酸性α醋酸萘酯酶染色法

酸性α醋酸萘酯酶染色法

来源：生物学实验中心发布时间：2010-04-04 查看次数：1597

一、原理

淋巴细胞内含有许多种酶，如α醋酸萘酯酶(ANAE)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、β葡萄糖苷酸酶等。不同的淋巴细胞细胞亚群所含酶类及其含量各异，如淋巴母细胞富含ACP，而成熟的T淋巴细胞则显示ANAE活性，因此可利用化学反应作检测。T淋巴细胞浆内含有的酸性α醋酸萘酯酶(acid αnaphthy l acetate esterase，ANAE)，在弱酸性条件下，能使底物酸性α醋酸萘酯水解成醋酸和α萘酚，后者与六偶氮副品红偶联，生成不溶性的红色沉淀物，沉积在T淋巴细胞胞浆内酯酶所在的部位，经甲基绿复染，反应呈现单一或散在的颗粒或斑块，显棕红色。B淋巴细胞则无此种反应。因此ANAE染色法可作为鉴别T 淋巴细胞的一种非特异性方法。此外，单核细胞、中性粒细胞、酸性粒细胞及血小板等也可呈现酯酶染色阳性反应，应当注意区分。

二、材料和方法

(一) 材料

1 25%戊二醛溶液(固定液)在01mol/L pH值74磷酸盐缓冲液9ml中加入25%戊二醛溶液1ml，混和，置4℃冰箱保存备用。

2 副品红液将副品红4g加入2mol/L盐酸100ml中，37℃溶解过滤，4℃冰箱保存备用。

3 4%亚硝酸钠溶液取亚硝酸钠400mg，溶于蒸馏水10ml中，临用前配制。

4 六偶氮副品红溶液取新配制的亚硝酸钠溶液3ml，慢慢滴入副品红溶液3ml中，边滴边搅拌，此时有刺激性气体产生。充分混合，1min后备用。

5 α醋酸萘酯溶液：

α醋酸萘酯2g 乙二醇单甲醚100ml 也可用丙酮100ml代替乙二醇单甲醚。

6 0067(1/15)mol/L pH值76磷酸盐缓冲液：

甲液KH2PO4 908g加蒸馏水至1，000ml

乙液Na2HPO4 974g加蒸馏水至1，000ml。(如为Na

2HPO

4

•12H2O则称取23 22g)

取甲液13ml，加入乙液87ml，即为0067mol/L pH值76磷酸盐缓冲液。

7 反应液

0067mol/L pH值76磷酸盐缓冲液89ml 六偶氮副品红 6ml(缓慢加入) α醋酸萘酯液25ml(缓慢加入)

8 甲基绿染色液充分混匀，调pH值58～60，临用前配制。

甲基绿1g 蒸馏水100ml 置37℃溶解，冰箱保存备用。

(二) 方法

1 分离单个核细胞取家兔肝素抗凝血1ml加入Hank s液1ml，加入到含有2m l淋巴细胞分

层液(比重1077±0001)的离心管中，以2 000 r/min离心30min。洗涤后，加少量Hanks液，摇匀。

2 制片取上述细胞悬液1滴，加到洁净玻片上，涂片，自然干燥。

3 固定和染色将制备的细胞涂片用25%戊二醛液4℃固定10min，流水冲洗，待干。将玻片置于反应液内，37℃孵育1h，取出用水冲洗，待干。

4 复染用甲基绿染色液染1min(或瞬时染色)，水洗，吹干。油浸镜下观察计数。

三、结果判定

镜检时，首先要判定是否为淋巴细胞。淋巴细胞经ANAE染色后，可区分为两大类：一类淋巴细胞的胞浆内不见呈色物质，为ANAE阴性细胞；另一类在胞浆中出现棕红色物质，为ANAE阳性细胞。根据呈色物质的形态和分布又分为块状AN AE阳性淋巴细胞和点状ANAE阳性淋巴细胞。ANAE阴性淋巴细胞呈黄绿色，胞浆内无明显着色颗粒。

四、注意事项

1 不同质量的试剂，尤其是偶氮染料对反应产物的颜色、鲜艳程度、颗粒粗细和定位清晰程度等影响很大，应加注意。

2 由于本反应为酶化学反应，反应非常灵敏，各种条件应严格掌握。尤其是试剂的pH值要求准确，需用精密pH试纸或pH计测定。

3 配制反应液时，各溶液混合，必须边摇边缓慢加入，若滴入过快，可出现沉淀，影响染色结果。

4 制片过程中，标本要求尽快固定、干燥和冲洗。若时间过长，可影响酯酶活性。

5 涂片插入染色缸时，要注意必须将标本面与反应液接触，切勿将标本面紧贴缸壁，以免影响染色反应。如片子较多，反应液相对减少，会使阳性率减低。

染色后冲洗不宜过久，防止酶反应产物的红色消减，造成标本观察困难。