二苯胺法测定DNA含量

实验12 二苯胺法测定DNA 含量

一、目的

学习和掌握测定DNA 的定糖法（二苯胺法）的原理和操作技术。

二、原理

脱氧核糖核酸中的α—脱氧核糖在酸性环境中变成ω—羟基—γ酮基戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物，在595nm 处有最大的吸收，在每毫升含DNA20~400微克范围内，光密度与DNA 的浓度成正比，在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应的灵敏度。除DNA 外，脱氧木糖，阿拉伯糖也有同样的反应。

HO CH 2C — CH 2 CHO 蓝色化合物 酸性条件 二苯胺 O

ω—羟基—γ酮基戊醛

三、材料、试剂和器具 （一）试剂

1、DNA 标准溶液：取小牛胸腺DNA 用0.1N 氢氧化钠溶液配制成200微克/毫升的溶液。

2、DNA 样品液：（自己提取）控制其DNA 含量在50~100微克/毫升左右。

3、二苯胺试剂：称取1克结果的二苯胺试剂溶于100毫升分析纯的冰醋酸中，再加入10毫升过氯酸（A.R60%以上）或浓硫酸2.75毫升，混匀备用。临用前加入1毫升1.6%乙醛溶液（乙醛溶液应保存于冰箱，一周内可使用）所配得的溶液应为无色。 （二）器具

1、试管及试管架

2、移液管（1，2，5毫升）

3、恒温水浴

4、可见光分光光度计

四、操作步骤

（一）DNA 标准曲线的制作

==

加毕，摇匀，于60℃恒温水浴中保温1小时，（或于沸水中煮沸15分钟，冷却测0.D 595nm 值。）以光密度为纵坐标，DNA 含量（ug/ml ）为横坐标，绘制标准曲线。 （二）样品的测定

取2支试管，各加0.2~0.5毫升的待测液（内含DNA 应在标准曲线可测范围之内）加蒸馏水稀释至2毫升，再加4毫升二苯胺试剂，摇匀，其操作步骤与标准曲线的制作相同。根据测得的光密度值，从标准曲线上查出相当该光密度DNA 的含量，按下式计算出样品中DNA 的百分含量。

DNA 含量/毫升待测液=标准曲线查得值×稀释倍数

10010

)(/(%)6

⨯⨯⨯=

g DNA 新鲜鲜肝总体积毫升含量产率

五、注意事项

1、二茉胺法测定DNA 含量灵敏度不高，待测样品中DNA 含量低于50mg/L 即难以测定。乙醛可增加二苯胺法测定DNA 的发色量，又可减少脱氧木糖和阿拉伯糖的干扰，能显著提高测定的灵敏度。

2、样品中含有少量RNA 并不影响测定，但因蛋白质、多种糖类及其衍生物、芳香醛、羟基醛等能与二苯胺反应形成有色化合物，故能干扰DNA 定理。

六、实验报告

1、绘制标准曲线图

2、计算DNA 含量及产率

七、思考题

1、本实验的关键步骤是什么？如何控制？

2、DNA 制品可用哪几种方法测定其含量，试从原理、准确性等方面加以比较。