土壤微生物研究方法

.香蕉地土壤细菌种类多样性分析流程
总DNA的提取 16S rRNA基因扩增
构建16S rRNA基因文库
转化宿主
阳性克隆子进行菌落PCR
HhaI酶切
多样性分析
构建系统发育树
挑选测序、Blast分析
4.香蕉地土壤细菌种类多样性分析
总DNA的提取 16S rRNA基因扩增
构建16S rRNA基因文库
转化宿主
该法优点
灵敏度高、分辨力强 无需分离培养纯种微生物，可以最大限度地 保留微生物群落原有的代谢特征 测定简便，数据读取与记录可以由计算机辅 助完成
可以连续监测微生物的变化，可批量分析
该法缺点
特别依赖于群体生理活性，不能监测休眠体， 也不能检测那些不能利用BIOLOG碳源底物的 群体； 如果不能很好地解释一个区系中微生物种类 的相互作用如何影响底物的利用情况，很难把 这些变化同种类变化联系起来；
Acidobacterium sp. （酸杆菌属）
Uncultured prokaryote
D1B19
D1B24 D1B31
0.0
0.0 0.0
94%
95% 99%
未培养原核生物
绿屈挠菌门 厚壁菌门
Chloroflexus sp.（绿弯菌属） Clostridium sp. （梭菌属）
发病香蕉园病土壤16S rDNA文库的克隆子有6个属， 大约有29%属于厚壁菌门，22%属于放线菌门，还有少 部分属于硝化螺旋菌门、酸杆菌门、绿屈挠菌门等。
一、微生物功能多样性研究方法
•
指土壤微生物群落所能执行 的功能范围以及这些功能的执行 过程，如分解功能、营养传递功 能等
BIOLOG碳素利用法：
•
是由美国BIOLOG公司于1989年开发成功，最初应用 于纯种微生物的鉴定，1991年开始应用于土壤微生物群 落功能多样性研究，目前以使用BIOLOG ECO（生态板） 板最为实惠而受欢迎。
• 3、土壤微生物结构多样性 • 指土壤微生物群落在细胞结构组分上的多样化程度，
这是导致微生物代谢方式和生理功能多样化的直接原因
• 4、土壤微生物的遗传多样性 • 是土壤微生物在基因水平上携带的各类遗传物质和遗
传信息的总和，这是微生物多样性的本质和最终反映
（二）土壤微生物过程
• 土壤微生物是土壤中物质转化的动力： • 如;固氮作用，硝化作用、反硝化作用、腐殖质的分 • 解和合成 • 土壤酶与微生物细胞一起推动物质转化
基本原理
• PLEA是构成活体生物细胞膜的重要组分，不 同类群微生物能通过相应生化途径形成特定 的PLEA，使部分PLEA总是出现在同一类群 的卫生中，作为区分活体微生物群落生物标 记的基础。以此根据脂肪酸的种类及组分比 例可鉴别土壤微生物群落结构的多样性变化。
该法的缺点
很难从种的水平鉴定微生物类群，只能鉴定到属 该法依赖于标记脂肪酸， PLEA的组成和浓度可 能受土壤微生物生长发育及其外界环境的影响， 难以区别死与活的微生物，给微生物群落结构的 定性和定量分析带来了一定困难。
10-1 稀释度 生长情况 +++++ 5 读数
10-2 +++++ 5
10-3 ++++4
10-4 ++--2
10-5 ----0
该系列稀释中，所有重复都有生长的最高稀释度的数量 指标是5（10-2），出现菌落的最低稀释度指标是2 （10-4），则该例的数量指标为542，查重复为5稀释法 测数统计表得近似值为25
最大或然数法（MPN稀释法）
用于一些特殊功能菌的计数，如，硝化细菌和反硝化细菌
•
假设被测定的微生物在稀释液中均匀分布，并 在试管中全部存活，随着稀释倍数的加大，稀释 液中微生物的数量将越来越少，直到将某一稀释 度的土壤稀释液接种到培养基上培养后，没有或 很少出现微生物，根据没有出现细菌的最低稀释 度和出现菌落的最高稀释度计算土壤中微生物的 数量。
香蕉根际土壤样品的DNA含量和DNA纯度比较 DNA纯度 土壤样品 OD260/OD230 OD260/OD280 浓度 µg/ml 干土 µgDNA/g
发病蕉园
健康蕉园
直接法
间接法 直接法
1.57
1.40 1.63
1.76
1.69 1.64
0.096
0.256 0.088
0.96
0.51 0.88
土壤中PLEA标记物的组成及其稳定性受提取方法、 提取条件等因素直接影响
三、土壤微生物遗传多样性的分析
• 指土壤微生物在基因水平所携 带的各类遗传物质和遗传信息 的综合，是微生物多样性的本 质和最终反映
基于杂交的分析方法(fish技术)
基于PCR（聚合酶链反应，polymerase chain reaction ）的分析方法
近似值 数量指标首位稀释倍数 鲜土重 菌落 ，单位MPN / g 干土重
如果在所有试管都有微生物生长的稀释度后仍有三个数字， 稀释度 10-ห้องสมุดไป่ตู้ 10-2 ++++4 10-3 ++--2 10-4 ++--2 0 10-5 -----
生长情况 +++++ 5 读数
该系列稀释中，所有重复都有生长的稀释度是10-1，指标 是5，后面还有三个稀释度有数字，则将数量指标最后一 个数字（2）加到前一个数字（2）即544，由表查得近似 值为35
•
充氮厌氧培养法 用真空泵抽去真空干燥器中的空气，用N2、CO2H
• 或H2代替。在真空干燥器中培养严格厌氧细菌，可 • 得表面菌落。 • 焦性没食子酸吸氧法
•
利用焦性没食子酸在碱性溶液中能吸收游离氧来创造 厌氧环境。
二、土壤微生物生物量的测定
• 氯仿熏蒸法 • 根据熏蒸和未熏蒸土壤释放的CO2的量计算生物量。 • 底物诱导呼吸法 • 在土壤中加入容易分解的底物进行培养，根据CO2释 放量计算。
表3 土样16SrDNA文库的微生物多样性参数
文库 RFLP 库容 香农-维纳指数 均匀度指数 优势度指数 丰富度指数
编号 发病蕉园 健康蕉园
类型 21 47
C 96% 93.5%
H 1.71 3.59
E 0.56 0.93
D 0.97 0.92
dmax 4.34 8.87
测序结果比对分析
表4 发病香蕉园土壤16S rDNA文库部分克隆子测序分析
（4）物种优势度Simpson指数的计算公式
D 1 pi2
S 1 dmax ln N
i 1
s
（5）物种丰富度Margalef指数的计算公式
香蕉园土壤真菌种类多样性分析
香蕉园土壤总DNA进行ITS片段扩增 筛选阳性克隆子进行菌落PCR 选择克隆子测序并比对，构建系统进化树 测得序列提交GeneBank
基于PCR（聚合酶链反应，polymerase chain reaction ）的分析方法
•
•
土壤DNA提取与纯化 PCR：PCR能快速特性性扩增任何已知序列，并能将pg 水平的DNA混合物中的目的基因扩增到ng、ug、mg级的 特异性片段
• 变性处理和分析检测：电泳和酶切
海南福山香蕉园土壤微生物多样性分析过程
• （三）土壤微生物与环境的关系 • 如：全球变暖、森林锐减、土壤退化都与微生物
• 有关。
• 二、土壤微生物研究方法进程 • 1676年，虎克用自制的单式显微镜观察到细菌个体
• • • • • • 1897年，毕希纳用无细胞酵母菌压榨汁中的“酒花酶” 对葡萄糖进行乙醇发酵成功，从而开创了微生物生 化研究的新时代 1953年，沃森和克里克发表了关于DNA双螺旋模型， 整个生命科学领域进入分子生物学研究阶段，是微 生物学发展史上成熟到来的标志。
基本原理：
• 土壤微生物细胞利用31种碳源进行代 谢，以代谢过程产生的酶与四唑类显 色物质（如TTC、TV）发生颜色反 应的浊度差异为基础，运用独有的显 性排列技术分析土壤微生物的代谢特 征指纹图谱，反映不同环境条件引起 的土壤微生物群落变化
• BIOLOG 测试板含有96个小孔，除对照外， 其余孔内分别含有不同的有机碳源和一种指示 剂，通过接种菌悬液，根据微生物对碳源利用 时指示剂颜色变化差异来鉴定微生物群落功能 多样性
第二节 土壤微生物的计数与分析
• 一、培养计数法
•
根据培养基上所生长微生物的数量来 估算土壤中微生物的数量的方法
（一）一般微生物的分离与计数
• 稀释平板法
• 最大或然数法（MPN稀释法） • 土粒法
• 稀释平板法：
•
用已知质量的土壤在适量的溶液中搅拌的时候，微生 物和土壤分离，这些分开的微生物细胞在营养琼脂平板上 生长成为分散的菌落，根据菌落数换算得单位重量土壤中 微生物的数量。土壤中微生物的数量很多，因此必须取少 量样品制成土壤悬液，然后稀释，使发育在培养皿中的菌 落可以很好地分散开
间接法
1.48
1.78
0.211
0.42
香蕉地土壤细菌种类多样性
香蕉地土壤总DNA16SrDNA片段扩增
本研究采用的PCR循环次数是 15次，同时做10管，将PCR 产物 回收后混合均匀，减少PCR偏向 性的影响，以保证所构建的文库 准确。
图4 土壤总DNA的16S rDNA扩增结 果
香蕉园土壤微生物多样性参数
专题四 土壤-微生物系统研究方法
•
第一节 土壤微生物研究概述 • 一、土壤微生物学的研究对象
土壤微生物多样性：
土壤微生物过程 土壤微生物与环境的关系 • •
（一）土壤微生物的物种多样性 土壤微生物的功能多样性 土壤微生物的结构多样性 土壤微生物的遗传多样性
1、土壤微生物功能多样性：
菌落 近似值 数量指标首位稀释倍数 鲜土重 ，单位MPN / g 干土重
土粒法
• 该法是将供试土壤颗粒，排列在适于某 一生理类群微生物生长的选择性固体培 养基上，这一类微生物的菌落围绕着颗 粒发育起来，由这些颗粒在试样中所占 的百分数可以得到这类菌在土壤中的含 量及其近似值。
（二）、厌氧微生物的分离与计数
编号 D1B5 D1B7 D1B11 D1B17 所属物种 E值 0.0 0.0 0.0 0.0 同源性 100% 96% 97% 94% 所属门 放线菌门 硝化螺旋菌门 未培养酸杆菌门 酸杆菌门
Streptomyces sp.（链霉菌属） Nitrospira sp.（硝化螺菌属）
Uncultured Acidobacteria bacterium
表5 健康香蕉园土壤16S rDNA文库部分克隆子测序分析
编号 D2B006 D2B007 所属种属 Streptomyces sp. （链霉菌属） Oscillatoria sp. （颤藻属） E值 0.0 0.0 同源性 100% 99% 所属门 放线菌门 蓝藻门
• 指土壤生态系统中微生物的物种丰富度和均一度，主 要从分类学、系统学和生物地理学角度对一定地域内物种 的现状进行研究。 • 目前主要通过培养基最大限度地培养各种菌落，由此了 解土壤中可培养的微生物种群。 •
• 2、土壤微生物的功能多样性 • 指土壤微生物群落所能执行的功能范围以及这些功能
的执行过程，对自然界元素循环具有重要意义 • 如：分解功能、营养传递功能以及促进或抑制植物生长的 功能等。 • 目前一般采用底物诱导下的代谢响应模式测算土壤微 生物群落的代谢功能多样性。
测定是微生物在与野外环境完全不同的溶液 中的代谢活性，因此，也不能确定它的结果能 否反映土壤区系的实际代谢情况；
二、土壤微生物结构多样性分析
• 磷脂脂肪酸法也称为PLEA法 • （phospholipid fatty acid 法）； • 磷酸脂肪酸是所有微生物细胞膜磷脂的组分，具有结构多 样性和较高的生物学特异性，用磷酸脂肪酸作为标记物来 研究鉴别土壤微生物群落结构多样性变化。
阳性克隆子进行菌落PCR
HhaI酶切
多样性分析
构建系统发育树
挑选测序、Blast分析
多样性指数计算 （1）库容coverage C文库 的库容计算： H ' pi ln pi
（2）Shannon―Wiener指数的计 算 （3）物种均匀度指数的计算公式
i 1
n1 C 1 s N
H' E ' H Max
• 腺苷三磷酸测定法 • 通过测定土壤中ATP的量测定土壤微生物量
第三节 土壤微生物多样性分析
• 土壤微生物多样性是指土壤生态系 统中微生物的物种丰富度和均一度,是 调节和维护土壤生态系统功能的关键 因素。她包括微生物群落多样性、结 构多样性及遗传多样性。
研究方法
基于培养和分离手段来揭示土壤微生物的群 落变化。 基于生物指示分子（如磷脂脂肪酸、DNA及 RNA）变异模式的土壤微生物多样性