[课件]噬菌体展示及酵母展示PPT

共价连接
• 共价连接细胞壁的锚定蛋白根据其连接方 式，可分为GPI型和Pir型。 • 前者的C端都有糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定 序列，并通过β- 1，6-葡聚糖连接至β- 1， 3-葡聚糖，可被β- 1，3或β- 1，6-葡聚糖酶 作用。 • 而后者直接与β- 1，3-葡聚糖相连，只可被 β- 1，3-葡聚糖酶作用，其具体连接方式目 前仍没有很明确的结论。
应用
• 1 噬菌体抗体库 • 噬菌体展示技术被用于产生人、鼠或者其他来源的重组 抗体片段。 • 在构建好组合抗体文库后，抗原特异的重组抗体片段可以 很容易地通过使用抗原蛋白，表达抗原的活体细胞或者是 固定的细胞对噬菌体文库进行生物淘选从而将其分离。 • 通过这一技术，可以从患传染病、自身免疫性疾病，以及 癌症患者的骨髓瘤细胞、淋巴瘤细胞或者外周血细胞中获 得重组抗体片段。可以用于病毒的检测和疾病的诊断。 • 构建人源性抗体库
酵母表面展示系统
• 酵母表面展示系统中研究较多的宿主主要 是酿酒酵母。
• ①酵母是一种理想的真核生物表达载体宿主，其 基因的表达调控及蛋白质的翻译后加工、分泌机 制比较接近高等真核生物。可以表达多种不同大 小的翻译后修饰的功能蛋白，用于构建蛋白文库。 对哺乳动物蛋白质，尤其是对人的蛋白质的展示 有独特的优越性； • ②酵母颗粒大，可利用流式细胞仪进行方便的筛 选和分离； • ③酵母展示的外源蛋白可紧密锚定在细胞壁上， 能耐受SDS的抽提； • ④酵母遗传学操作简单，具有发酵性，生长快， 并且安全无毒，可用于基因治疗及开发口服疫苗 等。
• 根据噬菌体载体的不同，噬菌体展示系统 主要分为：丝状噬菌体系统、入噬菌体系 统、T4噬菌体系统以及．T7噬菌体系统。
丝状噬菌体
• 常以一组随机多肽编码序列或基因群插入 噬菌体展示载体，形成噬菌体展示文库。 在噬菌体展示文库的每个噬菌体粒子只展 示一种序列的外源肽链，不同的噬菌体粒 子展示不同序列的外源肽链。
新型疫苗的研究
• 使用噬菌体展示能方便地大量生产疫苗用 抗原表位，可以在同一噬菌体上展示多十 具有保护性作用的抗原决定簇，构建多价 疫苗。使用病原特异性血清从随机肽库中 筛选出特异性的抗原决定簇，只要它们是 疫病特异性的和带有中和抗原决定簇(B细 胞抗原决定簇或T细胞抗原决定簇)，都可以 用于发展特异性疫苗。
• PVIII是丝状噬菌体的主要外壳蛋白，位于 噬菌体外侧，C端与DNA结合，N端伸出噬 菌体外，每个病毒颗粒有2700个左右PVIII 拷贝。 • 由于PVIll分子较小，只能融合较小的外源 肽段。但优点在于它的拷贝数多，因此该 系统一般用于筛选亲和力较低的配体，在 疫苗开发上具有潜在的应用价值。
噬菌体展示 及酵母展示
肽库的构建
• 噬菌体随机肽库是由上亿种与噬菌体外壳 蛋白以融合的形式呈现在噬菌体表面的多 肽所组成，库中上亿种多肽分别呈现在上 亿个噬菌体表面，众多重组型噬菌体便组 成了噬菌体随机肽库。 • 构建肽库的关键是获得足够的独立噬菌体 克隆。以6肽为例，至少应获得lo 7～109以 上的独立克隆。
同时用c-myc（原癌基因）单抗和荧光 素偶联的dextran(葡聚糖）(FITCdextran)标记的细胞可用激光扫描共聚 焦显微镜检测。
• 絮凝素FlolP富含N-和O糖苷连接而形成杆 状构象,在细胞表面的絮凝反应中起着主要 作用。 • Flolp絮凝功能结构域靠近N端，识别细胞壁 中的A甘露聚糖组分并与之非共价结合，引 起细胞聚集成可逆性絮状物。
GPI型共价连接细胞壁的锚定蛋白
• a凝集素和A凝集素是酵母细胞壁上的两种 甘露糖蛋白，它们在酿酒酵母的a交配型 （.MATa）和A交配型（MATA）单倍体细 胞之间介导细胞与细胞的性粘附，使细胞 融合形成双倍体。 • 目前已报道的酵母表面展示系统有两种， 目的蛋白分别与a或A凝集素融合，展示于 酵母细胞表面。
噬菌体展示技术的局限
• ①随机肽库容量限制性； • ②噬菌体文库一旦建成，很难进行有效的体外突 变和重组，从而限制了文库中分子遗传的多样性； • ③密码子的兼并性使噬菌体扩增中会不可避免地 造成20种氨基酸合成具有明显倾倾向性； • ④大肠杆菌的生物合成系统本身的局限性，不能 进行蛋白质的翻译后修饰； • ⑤展示的多肽或蛋白分子量不能太大，否则会影 响噬菌体的装配与感染。
酵母细胞壁结构
• 酿酒酵母的细胞壁非常坚硬，主要由位于 细胞膜外的甘露糖蛋白和β-葡聚糖组成。 • 细胞壁具有双层结构，内层是由β- 1，3-葡 聚糖和β- 1，6-葡聚糖连接形成的骨架，外 层是主要由甘露糖蛋白组成的纤维状或毛 刷状的结构。
锚定方式
• 作为锚定蛋白的细胞壁甘露糖蛋白主要存 在两种类型： • 一种与细胞壁非共价松弛连接，可被SDS 抽提； • 另一种与细胞壁共价相连，可用β- 1，3一 或β- 1，6葡聚糖酶消化细胞壁释放出来， 但不能被SDS（十二烷基硫酸钠）抽提。
丝状噬菌体属于单链环状DNA病毒
பைடு நூலகம்
• 主要外壳蛋白PVIII和4种次要外壳蛋白PIII、PVI、 PIX、PⅦ。PIII与PVIII蛋白一般主要用作展示外 源蛋白的锚定蛋白。 • PIII蛋白位于病毒颗粒的尾端，有3．5个拷贝，其 在结构上可分为N1、N2和CT 3个功能区域，其 功能是在噬菌体感染大肠杆菌时与F菌毛结合，使 噬菌体能吸附到细菌上。 • PIII蛋白展示系统最突出的特点是对外源多肽或蛋 白质的大小无严格限制，可用于生物大分子的表 达和功能分析等方面研究。PIII的拷贝数只有3．5 个，故可用于选择高亲和力的配体，但在免疫学 和生物疫苗研制中受到了限制。
• 此系统将目的蛋白作为N端，与A凝集素c端 部分融合，目的蛋白经A凝集素展示于酵母 细胞表面. • A凝集素共价连接到细胞壁的葡聚糖上其锚 定能力由蛋白质C端320个氨基酸组成，富 含Ser/Thr残基.Ser/Thr富集区因广泛存在的 O-糖基化而拥有一个杆状构象，可作为空 间支撑物发挥作用.