酶分子修饰和改造

三、酶化学修饰的基本原理
3．维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 • 大分子修饰剂产生的空间障碍可阻挡蛋白水解酶接近酶分 子，能“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。 • 酶分子上许多敏感基团参与修饰反应，也减少了酶分子遭 受蛋白水解酶攻击破坏的可能性。 4. 消除酶的抗原性 • 有些组成抗原决定簇的基团与修饰剂形成共价键，破坏了 酶分子上抗原决定簇的结构，使酶抗原性降低乃至消除。 • 能“遮盖“抗原决定簇和阻碍抗原、抗体产生结合反应。
糖肽分子上有游离氨基，活化后能与酶分子上氨基反应。 ① 2,3-异氰酸甲苯活化法
②戊二醛法
3.3 合成大分子多聚物修饰酶
（一）聚N-乙烯吡咯烷酮 N-乙烯吡咯烷酮修饰酶时，首先要开环水解，经活化反应，才 能与酶联结。
（二）聚乙烯醇修饰酶
聚乙烯醇与硝基苯酰氯反应后，其产物的硝基用连二亚 硫酸钠还原成氨基，与酶分子中羧基共价连接。
Vmax (mmol/ml.min.mg)
3. 羧基的化学修饰
• 主要涉及谷氨酸和天冬氨酸。 • 产物一般为含酯类或酰胺类的修饰酶。
• 水溶性的碳二亚胺为最常用的修饰剂，可定量测 定羧基含量。 • ．咪唑基的化学修饰：焦碳酸二乙酯。 • ．胍基的化学修饰：丁二酮和1，2-环己二酮为修 饰剂。 • ．二硫基的化学修饰：通常通过还原的方法进行 修饰。
• 现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术。定点突变 （site directed mutagenesis）是20世纪80年代发展起来的一种 基因操作技术。是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改 变从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质工程（Protein Engineering）和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。定点突 变技术，为氨基酸或核苷酸的置换修饰提供了先进、可靠、行之有 效的手段。
（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+,Zn2+)
• 若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如 果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。
若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。有的可
以使酶的活性降低甚至丧失，有的却可以使酶的活力提高或者增加酶 的稳定性。
• 氨基酸的置换 • 肽链有限切除 • 氨基酸残基的修饰等
三、酶化学修饰的基本原理
1．增强酶天然构象的稳定性与耐热性
• 酶与修饰剂交联后，使酶的天然构象产生“刚性”，不易 伸展打开，从而增强酶的热稳定性。
2．保护酶活性部位与抗抑制剂
• 大分子修饰剂与酶共价交联后，其产生的空间障碍或静电 斥力能有效地阻挡抑制剂对酶的进攻，同时“遮盖”保护 酶活性部位，使抑制剂和酶结合的难度增加，使酶的抗抑 制剂能力增强。
706对已知二硫键的能量值分布图
351对二硫键的χ3容许扭 转角分布图
Properties of the wild type and mutant xylanase
Properties Topt (℃) t1/2 (min) Specific activity (U/mg) Km (mg/ml) Wild type 45 <10 2127.9±83.9 56.9 Mutant CX8 50 180 3330.9±173.4 37.2
酶分子的定点突变
1、基因序列分析 2、蛋白质结构分析 3、酶活性中心分析 4、引物设计进行基因定点突变 5、酶基因克隆表达
6、变异特性分析
Sequence A Sequence B
Sequence C
Sequence D
NCBI-blast analysis of XynB
The analysis result of suitable point of introducing disulfide bridge of XynB
四、对修饰剂的了解
1．修饰剂的分子量、修饰剂链的长度、对蛋 白质的吸附性 2．修饰剂上反应基团的数目及位置 3．修饰剂上反应基团的活化方法与条件
五、酶性质的了解
1．酶活性部位情况 2．酶的稳定条件、酶反应最适条件 3．酶分子侧链基团的化学性质及反应活泼性 等
六、反应条件的选择
1．反应体系中酶与修饰剂的分子比例 2．反应体系的溶剂性质，盐浓度和pH 条件 3．反应温度及时间
2．氨基的化学修饰
• Lys的氨基是酶分子中活性很高的基团，容易被修饰。 • 常用氨基修饰试剂：乙酸酐、２，４，６-三硝基苯磺酸 （TNBS）、碘代乙酸、还原烷基、。 • ２，４，６-三硝基苯磺酸（TNBS）可用于测定酶蛋白中 Lys数量。 • 常用２，４-二硝基氟苯(DNFB，Sanger试剂)、丹磺酰氯 (DNS)修饰多肽链N末端，用于N末端的测定。
4．芳香环取代反应
• 修饰剂：四硝基甲烷 • 修饰残基：Tyr，Phe。
二、特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰
1．巯基的化学修饰
• • • • 巯基是许多酶活性中心的催化基团 形成二硫键稳定酶的结构 最容易反应的侧键基团之一 通过修饰可提高酶的稳定性
• 烷基化试剂是一种重要的巯基修饰试剂，特别是碘乙酸和 碘乙酰胺；常用N-乙基马来酰亚胺、5,5′-二硫-2-硝基苯甲 酸（ＤＴＮＢ）。 • DTNB（Ellman试剂）用于定量酶分子中巯基数目。
• 将PEG的末端羟基转化为叠氮基，然后与酶反应。 ⑴PEG甲氧甲酰甲酯制备
⑵PEG酰肼制备
⑶PEG羧甲基叠氮化物制备
⑷活化PEG与酶交联
•
（二）琥珀酸酐法
• 用二溴代琥珀酸酐在温和碱性条件下将PEG活化， 经减压浓缩得活化PEG，可与酶分子上氨基交联。
（三）三氯均嗪法
• PEG经三氯均嗪法活化后，用石油醚抽提或减压蒸 馏，制得活化PEG。
第四节 其它修饰方法及修饰酶的性质
一、金属离子置换修饰
1．概念：通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶 的特性和功能发生改变的方法称为金属离子置换 修饰。 2．常用离子 常用二价金属离子。 3．修饰方法
酶的金属离子置换修饰
• 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生 改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。 • α -淀粉酶中的钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn2+)，过 氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的锌离子
（四）羰二亚胺法
• 修饰酶分子上的羧基。
3.2 糖类的修饰反应
（一）右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯的修饰反应 1.溴化氰法 右旋糖苷经溴化氰活化后，在碱性条件下与酶 的游离氨基共价连接，生成修饰酶。
2.高碘酸氧化法
高碘酸将右旋糖苷上邻双羟基氧化成醛基，醛基再与酶 分子上的氨基结合而生成修饰酶。
（二）糖肽的修饰反应
金属离子置换修饰的过程
a. 酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获
得具有一定纯度的酶液。
b. 除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，
如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。 通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。 此时，酶往往成为无活性状态。
c. 加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶
蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属 离子置换后的酶。
金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。 用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。
二、肽链有限水解修饰
7.分子内交联修饰
• 采用含有双功能基团的化合物，如二氨基丁烷、 戊二醛、己二胺等，与酶蛋白分子中两个侧链基 团反应，形成共价交联，可以使酶分子的空间构 象更为稳定，从而提高酶的稳定性的修饰方法称 为分子内交联修饰。
三、小分子修饰剂的作用
1. 用于酶分子结构和功能的研究 2. 用于改进酶性质
第三节 有机大分子对酶的修饰
例：对β-干扰素修饰，将17位半胱氨酸 → 组氨酸，提 高稳定性 mRNA UGU,UGC → AUG,AGC DNA ACA,ACG → TCA,TCG 将A突变成T，定点突变
•
•
氨基酸置换修饰
• 氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰方法，例如，Bender 等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换 为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出 现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化学修饰法难度大，成 本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以 工业化生产。
• 医药
解除医用酶免疫源性和抗原性
提高医用酶稳定性
延长医用酶体内半衰期
• 生物技术领域
改变酶最适pH 改变酶底物专一性 有机溶剂可溶解酶 提高酶耐热、酸、碱、有机溶剂能力
二、酶修饰的方向
1．核酸水平：利用基因操作技术对DNA 或 mRNA 进行改造或修饰 2．蛋白质水平：人们用化学法或酶法对酶的 一级结构进行改造
三、举例
3.1 聚乙二醇及其修饰反应
• 聚乙二醇的特点：
①线性分子HO-CH2-(CH2-O-CH2)n-CH2-OH； ②具有良好的生物相容性和水溶性； ③在体内无毒性、无残留、无免疫原性； ④末端活化后可与酶产生交联； ⑤覆盖在酶分子表面形成疏松的亲水外壳，导致流体动力学 发生改变。
（一）叠氮法
• 用专一性较强的蛋白酶或肽链为修饰剂，使肽链 部分水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变， 从而改变酶的性质和功能。 • 增加某些酶的活性 • 减少或消除某些酶的抗原性。
酶蛋白主链修饰(肽链有限水解修饰)
• 利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发 生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。 • 酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法。
• 修饰剂：2,4-二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、碘甲烷、 苯甲酰卤代物等。 • 修饰残基：氨基、巯基、羧基、甲硫基、咪唑基等。
3．氧化和还原反应
• 修饰剂：氧化试剂（H2O2、N-溴代琥珀酰亚胺等）；还原 剂（2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇等） • 修饰残基：巯基、甲硫基、吲哚基、酚基等（氧化）；二 硫键（还原）。
一、概念
• 利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发 生某些精细的改变，从而改变酶的特性
二、常使用的水溶性大分子修饰剂
• 糖及糖的衍生物（右旋糖酐、糖肽、Sephadex G25） • 聚乙二醇、大分子多聚物（如乙烯酮、乙烯乙酸、 丙烯酸等的单聚或共聚物） • 具有生物活性的大分子物质（如肝素）、蛋白质 等。 • 修饰的方法如：溴化氰法、高碘酸氮化法、戊二 醛法、叠氮法、琥珀酸法和三氯均嗪法等
第五章
酶的分子修饰和改造
第一节 酶化学修饰的原理和方法
一、酶的化学修饰原因
1．稳定性不够，不能适应大量生产条件的需要。 2．作用的最适条件不符。 3．酶的主要动力学性质的不适应。 4．临床应用的特殊要求。
酶化学修饰的应用
• 理论研究
酶中特定基团之间的距离 氨基酸残基的存在状态 氨基酸测序 确定酶活性部位 氨基酸数量测定
a、胃蛋白酶原的激活
胃蛋白酶原
HCl pH1.5～2
（从N端失去44个氨基酸残基） 胃蛋白酶
自身激活
b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活
c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活
三 氨基酸置换修饰
• 将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨 基酸，引起酶蛋白空间构象的某些改变， 从而改变酶的性质和功能。 提高酶活力或增加酶稳定性。
（三）聚氨基酸修饰酶
聚赖氨酸修饰酶 Lys上的氨基与含羧基较多的酶的羧基通过羰二亚胺产生交联。
3.4 天然大分子对酶的修饰作用
• 肝素修饰酶 肝素由氨基葡萄糖和两种糖醛酸组成。
• 羰二亚胺法
• 用羰二亚胺活化肝素分子上的羧基后，与酶上的氨 基共价连接。
• 人血清白蛋白修饰酶
• 戊二醛法
• 利用戊二醛双功能使白蛋白上的和酶分子上的氨基 相互交联。
七、酶修饰方法
1．酶分子侧wenku.baidu.com基团的化学修饰 2．有机大分子对酶的化学修饰 3．蛋白质类及其他
第二节 酶分子侧链基团的化学修饰
一、几种重要的修饰反应
1.酰化及其相关反应 修饰剂：乙酰咪唑、二异丙基氟磷酸、丹磺酰氯、硫代三氟 乙酸乙酯、O-甲基异脲等。 修饰残基：氨基、羟基、酚基、巯基等。
2．烷基化反应