抗氧化剂抗氧化活性的测定方法

1.抗氧化剂是指在低浓度下能有效延缓或阻止底物氧化的物质。被氧化的底物包括蛋白质、脂质、糖和DNA。

2.初始型抗氧化剂(AH)可通过与脂质自由基L.、过氧自由基LOO.或烷氧自由基LO.反应抑制脂质氧化链反应。

L.+ AH--- LH + A.

LOO.+ AH--- LOOH + A.

LO.+ AH--- LOH + A.

抗氧化剂自由基A.也能与过氧自由基、烷氧自由基反应从而终止脂质氧化反应。

LOO.+ A.---LOOA

LO.+ A.---LOA

次级型抗氧化剂可通过各种机理延缓脂质氧化,如螯合过渡金属、给初始型抗氧化剂补充氢、清除氧以及使活性物质失活等。

抗氧化剂的活性分为在生物体外( 如食品中) 的活性和在生物体内的活性。本文综述了体外测定抗氧化剂抗氧化活性的方法,不包括在生物体中测定生物活性的方法。

3.评价或表征抗氧化活性的方法为了说明在特定条件下被测物抑制底物氧化的效力或清除自由基的能力

实际测定时至少要说明在测试条件下被测物是抗氧化剂还是促氧化剂; 在指定浓度下比较不同测试材料( 如被测物与标准抗氧化剂或添加有被测物的测试体系与空白体系) 对底物的作用。

评价或表征抗氧化活性的方法有:

(1) 在指定的时间测量氧化产物或官能团的浓度或吸光度值;

( 2)测量反应的速率;

( 3) 测量诱导期( 延滞期) 或氧化达到一定程度所需的时间;

( 4) 测量速度的积分( 即动力学曲线下的面积) ;

( 5) 测量被测物产生与标准抗氧化剂相当作用的浓度。

4. 参数

4.1诱导期( induction period)

诱导期tIND( 也叫延滞期, lag period) 常定义为化学反应的速度。诱导期是一个相当不确定的值, 受检测方法、使用仪器的灵敏性以及一些其他因素的影响。对于脂质氧化,诱导期通常是指链增长阶段动力学曲线的切线和时间轴的交点。

4.2抑制率( percentag e of inhibition) 和IC50

抑制率和IC50 (抗氧化剂提供50%抑制作用时的浓度, 也可用EC50表示的) 常用来表征抗氧化能力。它们不仅与被测抗氧化剂的反应性能和氧化的底物有关, 而且受其他因素的影响, 如脂质氧化链反应的长度和抑制速率等。此外, 用IC50表征抗氧化剂

的活性与比较活性的时间点有关。只有在其他参数相同的情况下, 在某一研究中测得的抑制率和IC50才可以与另一研究中测得的值进行直接比较。TEC50是指抗氧化剂提供50% 抑制作用所需的时间, 也常用来表征抗氧化活性

5. 对测定方法的要求

测定抗氧化剂抗氧化活性的方法应满足如下要

求:

( 1) 能说明测试体系中发生的反应, 并能用明确的动力学图解描述; ( 2) 测试要有再现性;

( 3) 测试效率要足够高;

( 4) 方法要相对简单;

( 5) 能连续检测;

( 6) 应使用与体内或食品有关的活性自由基;

( 7) 分析中被测物的浓度在食品中或在生物体内能够得到;

( 8) 除了适合纯溶液外, 还适合复杂生物组织和天然产物的测定; ( 9) 水溶性的和脂溶性的化合物都适用。

6. 测定抗氧化活性的方法

大多数方法涉及到直接或间接测量: ( 1) 底物或标记底物或氧消耗的

衰减, ( 2) 氧化产物的生成, ( 3) 特征自由基的形成或衰减的速度或程度。在( 1) 和( 2) 中, 抗氧化活性是以对反应物的消耗或生成物的形成的程度或速率来表征抗氧化活性的; ( 3) 是假设通过捕获脂质自动

氧化中的自由基抑制氧化的, 因此集中在检测被测抗氧化剂对自由基

的捕获或抑制自由基的形成的能力上, 而不是检测实际发生的氧化反应, 如ABTS法和DPPH 法。

6.1以抗氧化剂抑制脂质氧化为基础的方法

脂质中的不饱和脂肪酸自动氧化, 生成不稳定的氢过氧化物, 氢过氧化物继续分解形成短碳链的醛、酮、酸等小分子化合物。抗氧化剂的加入可以延缓氢过氧化物及其分解产物的形成, 由此可测得抗氧化活性。

由于氧化的底物、引发或加速氧化的方法以及脂质氧化检测方法的不同, 该法又可分为以下几种情况。

6.1.1氧化的底物或使用的体系

以抗氧化剂抑制脂质氧化为基础的测量抗氧化活性的方法经常使用。常使用纯的甘油三酸酯、植物油( 红花油、葵花油、大豆油、橄榄油等) 、鱼油或猪油作为氧化反应的底物, 也使用磷脂或脂蛋白作为底物。

为了得到重复性的结果, 选择底物时应优先考虑单一的物质, 如亚油酸或亚油酸甲酯

底物中含有的抗氧化剂( 如植物油中常含有VE) 也能参与测试过程,

干扰测定。但是实际测定中常使用植物油等脂质混合物, 因为它们是与真实食品有关的脂质成分。实际操作中应根据具体的测试方法选择合适的底物和测试体系。

6.1.2 引发或加速氧化的方法

各种加速氧化的方法, 如烘箱法、活性氧法、Rancimat 法、OSI 法。这些方法是通过升温或增加氧浓度加速氧化的。

自由基引发剂加速脂质氧化, 常用热不稳定的偶氮化合物作为引发剂, 最典型的是水溶性的AAPH和脂溶性的AMVN。除此之外, 还有水溶性的ABAP、ABIP和脂溶性的ADVN、AIBN等, 也有用DBHN的

上述偶氮化合物在适当的温度下能以需要的速度分解, 生成活性自由基。由于温度容易改变和保持, 因此引发速率容易控制。上述引发剂的优点是自由基的生成速度与引发剂的浓度成比例, 与测试体系中的其

他成分无关

但是, 用自由基引发剂加速反应时抗氧化剂的抗氧化能力主要体现在

供氢的速度上, 没有考虑抗氧化剂自身生成的自由基的作用, 而有些抗氧化剂被氧化后的产物也能参与抑制作用, 对抗氧化活性有一定影响。

在食品体系和生物体系中还普遍使用过渡金属或过渡金属的氧化还原

反应引发氧化, 如Fe2+ 和Cu2+ 、Fe3+/ 抗坏血酸等。

但是这些体系中的一些成分( 如抗坏血酸) 能与自由基反应, 干扰测定结果。而且使用含有过渡金属的体系不能将不同于初始型抗氧化剂的抑制机理( 如螯合作用) 区别开。

也有用光照或紫外光来加速氧化的, 但是光引发脂质氧化可能引起氧

化机理的改变, 因此这种方法不常用。

6.1.3 脂质氧化的检测

在化学方法中, 过氧化值、碘值、游离脂肪酸的含量( 酸值) 、TBARS 法、羰基化合物、克雷斯试验和茴香胺值已被广泛采用。

至于物理方法, 如粘度、颜色、共轭二烯含量、红外光谱、折光指数、介电常数和气相色谱法、液相色谱法、气相色谱和质谱联用等已用于油脂氧化的测定。此外, 不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比率( C18: 2/

C16: 0) 、聚合物的含量、极性脂类的

含量也可用于检测脂质的氧化程度。

除上述方法外,测量体系中氧的减少造成压力变化的氧压法, 测量氧消耗的氧电极法, 测量底物中不饱和脂肪酸的减少以及氧化后底物的增