犬瘟热病毒一步RT_PCR检测方法的建立_张洪亮
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畜牧与兽医 2012 年 第 44 卷 第 1 期
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兽医 科技
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犬瘟热病毒一步 RT-PCR 检测方法的建立
张洪亮1 ，孟培培1 ，宋晓明2 ，杨瑞梅1 ， 秦晓冰1 ，丰艳妮1 ，黄 娟1* ，单 虎1*
（ 1． 青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109； 2． 乳山市畜牧局，山东 乳山 264500）
反应总体积为 25 μL，其中模板 RNA 3 μL，5 × Reverse Transcriptase Buffer 5 μL，2. 5 mmol / L dNTP 2. 5 μL，RNase inhibitor 0. 5 μL，AMV 反转录酶 0. 5 μL，P1、P2 各 0. 5 μL，rTaq DNA 聚 合 酶 0. 5 μL， 去离子水 12 μL。优化一步法 RT-PCR 循环参数，确 定最佳的反应程序为： 42 ℃ 60 min； 95 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s，50. 8 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，30 个循环； 72 ℃ 延 伸 10 min。反 应 结 束 后 取 6 μL 产 物 进 行 1. 2% 琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像系统拍照并分 析结果。 1. 6. 2 两步法 RT-PCR
无菌取山东青岛、潍坊、威海等地区送检的疑似 犬瘟热的水貂、狐狸、貉和犬的脑、肝、肺、脾以及 膀胱等 脏 器，Trizol 法 提 取 RNA，进 行 一 步 法 RTPCR 鉴定。
2 结果
2. 1 反应条件优化 通过反复多次对不同条件的摸索，优化了一步法
RT-PCR 的反应体系。以引物 P1 / P2 在 48 ～ 58 ℃ 退 火温度范围 内 分 别 扩 增 CDV Lederle 株，在 49. 7 ～ 54. 0 ℃ 时出现明显的特异性目的条带，以 50. 8 ℃ 扩 增时，目的条带最佳，故选用 50. 8 ℃ 作为最适退火 温度 （ 见图 1，2） 。
1. 2 主要试剂 DMEM 培养基购自美国 Gibco 公司； 标准胎牛血
清购自天津灏洋生物制品科技有限公司； TaKaRa Ribonuclease Inhibitor、 dNTP、 Reverse Transcriptase （ AMV ） 、 rTaq DNA 聚 合 酶、 DNA 分 子 量 标 准 DL2000 购自大连宝生物工程公 司； Trizol 试 剂 购 自 Invitrogen 公司； 琼脂糖购自上海夏夷实业有限公司； DEPC 购自 Sigma 公司。 1. 3 病毒培养
待培养 Vero 细胞长满单层，将培养液弃去，用 不含血清的 DMEM 冲洗 3 次后，置于超净台上备用。 将冻干病毒以 1 mL PBS 液溶解。将溶解的病毒用无 菌吸管接种细胞，37 ℃ 感作 1 h。弃去细胞瓶内液 体，用无菌 PBS 液洗涤 3 次，加 1% 双抗和不含血清 的 DMEM 培养基 10 mL，6 h 后换液 1 次。72 h 后， 待细胞出现明显病变后以封口胶封口，将细胞反复冻 融 3 次。10 000 r / min，离心 10 min，取上清 －20 ℃ 保存备用。 1. 4 引物的设计与合成
将 CDV Lederle 株 Vero 细胞培养物及上清处理， 提取 RNA，进行 10－1 ～ 10－8 系列稀释，利用紫外分光
光度计测定核酸浓度，按优化的循环参数进行一步法 RT-PCR 扩增，电泳观察，确定反应的敏感性。 1. 9 重复性试验
以建立的一步法 RT-PCR，分 别 对 CDV Lederle 株、送检的犬瘟热阳性病料以及 CDV 细胞培养物和 正常细胞对照样品重复检测 3 次，以验证试验的稳 定性。 1. 10 临床病料检测
M． DNA 标准 DL2000； 1-6： 分别为 10 －1 -10 －6 CDV 病毒 RNA 模 板稀释液的 RT-PCR 产物
图 3 RT-PCR 敏感性试验 （ 上图一步法，下图两步法）
2. 4 重复性试验 利用建立的一步法 RT-PCR 方法在不同时间对每
份样品重复检验 3 次，检验结果一致。 2. 5 临床病料的检测
反转 录 体 系 为 20 μL， 其 中 RNA 5 μL，5 × Reverse Transcriptase Buffer 4 μL，2. 5 mmol / L dNTP 2 μL，RNase inhibitor 0. 5 μL，AMV 反转录酶 0. 5 μL， P1、P2 各 0. 5 μL，DEPC H2 O 7 μL。42 ℃ 反转录 1 h，之后 70 ℃ 10 min 灭活反转录酶。PCR 体系为 25 μL，其中上述反转录产物 2 μL，10 ×PCR buffer 2. 5 μL，2. 5 mmol / L dNTP 2 μL，P1、P2 引物各 0. 5 μL， rTaq DNA 聚合酶 0. 5 μL，ddH2 O 17 μL。反应程序 为： 95 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s，50. 8 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，30 个循环； 72 ℃ 延伸 10 min。反应结束后取 6 μL 产物进行 1. 2% 琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像 系统拍照并分析结果。 1. 7 特异性检测
1 材料与方法
1. 1 毒株、细胞和病料 CDV Lederle 株、犬细小病毒 （ CPV） 由本实验
室保存； Vero、BHK-21 细胞由山东信得药业有限公 司惠赠； 狂犬病活疫苗由齐鲁动物保健品有限公司生 产； 鸡新城疫低毒力活疫苗 （ Clone-30 株） 由青岛 易邦生物工程有限公司生产； 病料来自山东青岛、潍 坊、威海等地区毛皮动物养殖场和动物医院送检的疑 似犬瘟热病例，其中水貂 15 例、狐狸 2 例、貉 3 例、 犬 5 例，无菌采集脑、肝、肺、脾以及膀胱等脏器。
分别用一步法 RT-PCR 和两步法 RT-PCR 检测了 25 份送检的临床犬瘟热疑似病例的脏器组织样品， 各检 测 出 阳 性 样 品 17 份 和 18 份，检 出 率 分 别 为 68% 、72% ，阳性符合率为 94. 4% 。见表 1。
采用 Invitrogen 公司的 Trizol 试剂提取 RNA。主 要步骤为： （ 1） 取 250 μL 处理好的病毒悬液加入到
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Animal Husbandry ＆ Veterinary Medicine 2012 Vol. 44 No. 1
EP 管中，再加入 750 μL Trizol LS Reagent，颠倒混匀 后于 4 ℃ 静置 5 min； （ 2） 加入 200 μL 氯仿，反复颠 倒 EP 管 振 荡 5 ～ 6 次 至 乳 化 均 匀，4 ℃ 静 置 约 10 min； （ 3） 4 ℃ 、12 000 r / min 离心 15 min，取出 EP 管，轻轻吸取上层水相约 500 μL 转移入另一新 EP 管； （ 4 ） 加 入 等 体 积 （ 500 μL） 的 冰 冷 异 丙 醇 （ －20 ℃ 保 存 ） ， 颠 倒 混 匀 后 置 － 20 ℃ 过 夜 （ 或 －70 ℃ 放置 30 min） ，充分沉淀核酸； （ 5 ） 4 ℃ 、 12 000 r / min 离 心 10 min， 弃 上 清 液， 加 入 1 mL 75% 乙醇 （ 4 ℃ 保存） ； （ 6） 4 ℃ 、12 000 r / min 离心 5 min，弃去上清液，倒置 EP 管干燥核酸 （ 放置时间 不宜超过 25 min） ，加入 20 μL DEPC H2 O 溶解 RNA。 1. 6 反应体系及扩增条件 1. 6. 1 一步法 RT-PCR
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摘要： 根据犬瘟热病毒 （ CDV） 弱毒株 Onderstepoort 的核蛋白 （ N） 基因的相对保守区序列设计了 1 对特异性寡聚核苷酸引物，在国内首次建立
了 CDV 一步 RT-PCR 检测方法。该法可以特异地扩增出 N 基因 265 bp 大小的目的片段，可以检测到 0. 043 6 μg / mL 的总 RNA，与两步法 RT-PCR
关键词： 犬瘟热病毒； 一步 RT-PCR； 检测
中图分类号： S852. 65
文献标识码： A
文章编号： 0529-5130（ 2012） 01-0049-04
犬瘟热病毒 （ canine distemper virus，CDV） 是引 起犬 科、 鼬 鼠 科 及 部 分 浣 熊 科 多 种 动 物 犬 瘟 热 （ Canine distemper，CD） 的病原［1－3］。反转录-聚合酶 链式反应 （ RT-PCR） 诊断方法由于具有较高的敏感 性和特异性，因而广泛应用于临床样品中 CDV 的检 测［4－8］。目前，在 RNA 病毒检测中，两步法 RT-PCR 应用的较多，但未见国内有关一步法 RT-PCR 用于检 测 CDV 的报道。为此，本研究针对 CDV N 蛋白的相 对保守区序列设计了 1 对特异的寡聚核苷酸引物，建 立了 CDV 一步 RT-PCR 检测方法，并利用该方法检 测了来自山东不同地区的水貂、狐狸、貉和犬的疑似 犬瘟热病料。
的敏感性相当。对 25 例犬瘟热临床疑似病例样品，一步法 RT-PCR 检测出 17 份阳性，与两步法 RT-PCR 的阳性符合率达 94. 4% ，胶体金检测试
纸条检测出 13 份阳性。研究结果表明，建立的 CDV 一步法 RT-PCR 检测方便、敏感、特异，适用于 CDV 临床病料的检测和分子流行病学调查。
利用 DNAstar 软件中的 MegLign 比对 GenBank 中 登录的不同来源的 18 株 CDV 的全基因序列，同时 BLAST 比对 GenBank 上发表的所有 CDV N 蛋白基因 序列，选定 N 基因的相对保守区。根据 GenBank 中 CDV Onderstepoort 株的基因序列，利用 primer 5. 0 设 计了 1 对特异性寡聚核苷酸引物，扩增目的片段大小 为 265 bp。P1： 5'-CTCTGCTTGCGGTCTTAC-3'； P2： 5 ' -AATCCACCTTCTCATCTCC-3 ' 。引物 由 北 京 赛 百 盛 基因技术有限公司合成。 1. 5 病毒总 RNA 的制备
提取 狂 犬 病 毒 （ RV ） 疫 苗 株、 新 城 疫 病 毒 （ NDV） 疫苗株、CDV Lederle 株和正常 Vero、BHK21 细胞的 RNA 及 CPV 的 DNA。取核酸模板各 3 μL， 以 P1、P2 为引物，优化的循环参数下进行 PCR 扩 增，琼脂糖电泳鉴定结果。 1. 8 敏感性试验
畜牧与兽医 2012 年 第 44Байду номын сангаас卷 第 1 期
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2. 2 特异性试验 按上述反应体系，采用一步法 RT-PCR 扩增 CDV
Lederle 株，得 到 了 265 bp 的 特 异 片 段，而 从 RV、 NDV、CPV 和正常 Vero、BHK-21 细胞中均未扩增出 条带。 2. 3 敏感性试验
10 倍系列稀释提取的 CDV Lederle 株的核酸，采 用两步法 RT-PCR 扩增，10－6 稀释模板能扩增到 265 bp 的目的条带，而采用建立的一步法 RT-PCR 法在 同样条件下扩增，稀释度达 10－6 亦出现明显的 265 bp 的目的条带 （ 见图 3） 。通过紫外分光光度计测定， 检测出的最低核酸浓度为 0. 043 6 μg / mL。
收稿日期： 2011-05-10； 修回日期： 2011-10-28 基金项目： 山东省自然科学基金 （ ZR2010CL023） 。 作者简介： 张洪亮 （ 1984- ） ，男，硕士研究生。 * 通讯作者： 黄娟，博士，副教授，主要从事动物传染病分子诊 断与防治 研 究，E-mail： happyhj888 @ 163. com； 单 虎， 博 士，教 授， 主要 从 事 动 物 传 染 病 防 治 和 生 物 制 品 研 究， E-mail： shanhu67 @ 163. com。
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兽医 科技
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犬瘟热病毒一步 RT-PCR 检测方法的建立
张洪亮1 ，孟培培1 ，宋晓明2 ，杨瑞梅1 ， 秦晓冰1 ，丰艳妮1 ，黄 娟1* ，单 虎1*
（ 1． 青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109； 2． 乳山市畜牧局，山东 乳山 264500）
反应总体积为 25 μL，其中模板 RNA 3 μL，5 × Reverse Transcriptase Buffer 5 μL，2. 5 mmol / L dNTP 2. 5 μL，RNase inhibitor 0. 5 μL，AMV 反转录酶 0. 5 μL，P1、P2 各 0. 5 μL，rTaq DNA 聚 合 酶 0. 5 μL， 去离子水 12 μL。优化一步法 RT-PCR 循环参数，确 定最佳的反应程序为： 42 ℃ 60 min； 95 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s，50. 8 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，30 个循环； 72 ℃ 延 伸 10 min。反 应 结 束 后 取 6 μL 产 物 进 行 1. 2% 琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像系统拍照并分 析结果。 1. 6. 2 两步法 RT-PCR
无菌取山东青岛、潍坊、威海等地区送检的疑似 犬瘟热的水貂、狐狸、貉和犬的脑、肝、肺、脾以及 膀胱等 脏 器，Trizol 法 提 取 RNA，进 行 一 步 法 RTPCR 鉴定。
2 结果
2. 1 反应条件优化 通过反复多次对不同条件的摸索，优化了一步法
RT-PCR 的反应体系。以引物 P1 / P2 在 48 ～ 58 ℃ 退 火温度范围 内 分 别 扩 增 CDV Lederle 株，在 49. 7 ～ 54. 0 ℃ 时出现明显的特异性目的条带，以 50. 8 ℃ 扩 增时，目的条带最佳，故选用 50. 8 ℃ 作为最适退火 温度 （ 见图 1，2） 。
1. 2 主要试剂 DMEM 培养基购自美国 Gibco 公司； 标准胎牛血
清购自天津灏洋生物制品科技有限公司； TaKaRa Ribonuclease Inhibitor、 dNTP、 Reverse Transcriptase （ AMV ） 、 rTaq DNA 聚 合 酶、 DNA 分 子 量 标 准 DL2000 购自大连宝生物工程公 司； Trizol 试 剂 购 自 Invitrogen 公司； 琼脂糖购自上海夏夷实业有限公司； DEPC 购自 Sigma 公司。 1. 3 病毒培养
待培养 Vero 细胞长满单层，将培养液弃去，用 不含血清的 DMEM 冲洗 3 次后，置于超净台上备用。 将冻干病毒以 1 mL PBS 液溶解。将溶解的病毒用无 菌吸管接种细胞，37 ℃ 感作 1 h。弃去细胞瓶内液 体，用无菌 PBS 液洗涤 3 次，加 1% 双抗和不含血清 的 DMEM 培养基 10 mL，6 h 后换液 1 次。72 h 后， 待细胞出现明显病变后以封口胶封口，将细胞反复冻 融 3 次。10 000 r / min，离心 10 min，取上清 －20 ℃ 保存备用。 1. 4 引物的设计与合成
将 CDV Lederle 株 Vero 细胞培养物及上清处理， 提取 RNA，进行 10－1 ～ 10－8 系列稀释，利用紫外分光
光度计测定核酸浓度，按优化的循环参数进行一步法 RT-PCR 扩增，电泳观察，确定反应的敏感性。 1. 9 重复性试验
以建立的一步法 RT-PCR，分 别 对 CDV Lederle 株、送检的犬瘟热阳性病料以及 CDV 细胞培养物和 正常细胞对照样品重复检测 3 次，以验证试验的稳 定性。 1. 10 临床病料检测
M． DNA 标准 DL2000； 1-6： 分别为 10 －1 -10 －6 CDV 病毒 RNA 模 板稀释液的 RT-PCR 产物
图 3 RT-PCR 敏感性试验 （ 上图一步法，下图两步法）
2. 4 重复性试验 利用建立的一步法 RT-PCR 方法在不同时间对每
份样品重复检验 3 次，检验结果一致。 2. 5 临床病料的检测
反转 录 体 系 为 20 μL， 其 中 RNA 5 μL，5 × Reverse Transcriptase Buffer 4 μL，2. 5 mmol / L dNTP 2 μL，RNase inhibitor 0. 5 μL，AMV 反转录酶 0. 5 μL， P1、P2 各 0. 5 μL，DEPC H2 O 7 μL。42 ℃ 反转录 1 h，之后 70 ℃ 10 min 灭活反转录酶。PCR 体系为 25 μL，其中上述反转录产物 2 μL，10 ×PCR buffer 2. 5 μL，2. 5 mmol / L dNTP 2 μL，P1、P2 引物各 0. 5 μL， rTaq DNA 聚合酶 0. 5 μL，ddH2 O 17 μL。反应程序 为： 95 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s，50. 8 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，30 个循环； 72 ℃ 延伸 10 min。反应结束后取 6 μL 产物进行 1. 2% 琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像 系统拍照并分析结果。 1. 7 特异性检测
1 材料与方法
1. 1 毒株、细胞和病料 CDV Lederle 株、犬细小病毒 （ CPV） 由本实验
室保存； Vero、BHK-21 细胞由山东信得药业有限公 司惠赠； 狂犬病活疫苗由齐鲁动物保健品有限公司生 产； 鸡新城疫低毒力活疫苗 （ Clone-30 株） 由青岛 易邦生物工程有限公司生产； 病料来自山东青岛、潍 坊、威海等地区毛皮动物养殖场和动物医院送检的疑 似犬瘟热病例，其中水貂 15 例、狐狸 2 例、貉 3 例、 犬 5 例，无菌采集脑、肝、肺、脾以及膀胱等脏器。
分别用一步法 RT-PCR 和两步法 RT-PCR 检测了 25 份送检的临床犬瘟热疑似病例的脏器组织样品， 各检 测 出 阳 性 样 品 17 份 和 18 份，检 出 率 分 别 为 68% 、72% ，阳性符合率为 94. 4% 。见表 1。
采用 Invitrogen 公司的 Trizol 试剂提取 RNA。主 要步骤为： （ 1） 取 250 μL 处理好的病毒悬液加入到
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Animal Husbandry ＆ Veterinary Medicine 2012 Vol. 44 No. 1
EP 管中，再加入 750 μL Trizol LS Reagent，颠倒混匀 后于 4 ℃ 静置 5 min； （ 2） 加入 200 μL 氯仿，反复颠 倒 EP 管 振 荡 5 ～ 6 次 至 乳 化 均 匀，4 ℃ 静 置 约 10 min； （ 3） 4 ℃ 、12 000 r / min 离心 15 min，取出 EP 管，轻轻吸取上层水相约 500 μL 转移入另一新 EP 管； （ 4 ） 加 入 等 体 积 （ 500 μL） 的 冰 冷 异 丙 醇 （ －20 ℃ 保 存 ） ， 颠 倒 混 匀 后 置 － 20 ℃ 过 夜 （ 或 －70 ℃ 放置 30 min） ，充分沉淀核酸； （ 5 ） 4 ℃ 、 12 000 r / min 离 心 10 min， 弃 上 清 液， 加 入 1 mL 75% 乙醇 （ 4 ℃ 保存） ； （ 6） 4 ℃ 、12 000 r / min 离心 5 min，弃去上清液，倒置 EP 管干燥核酸 （ 放置时间 不宜超过 25 min） ，加入 20 μL DEPC H2 O 溶解 RNA。 1. 6 反应体系及扩增条件 1. 6. 1 一步法 RT-PCR
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摘要： 根据犬瘟热病毒 （ CDV） 弱毒株 Onderstepoort 的核蛋白 （ N） 基因的相对保守区序列设计了 1 对特异性寡聚核苷酸引物，在国内首次建立
了 CDV 一步 RT-PCR 检测方法。该法可以特异地扩增出 N 基因 265 bp 大小的目的片段，可以检测到 0. 043 6 μg / mL 的总 RNA，与两步法 RT-PCR
关键词： 犬瘟热病毒； 一步 RT-PCR； 检测
中图分类号： S852. 65
文献标识码： A
文章编号： 0529-5130（ 2012） 01-0049-04
犬瘟热病毒 （ canine distemper virus，CDV） 是引 起犬 科、 鼬 鼠 科 及 部 分 浣 熊 科 多 种 动 物 犬 瘟 热 （ Canine distemper，CD） 的病原［1－3］。反转录-聚合酶 链式反应 （ RT-PCR） 诊断方法由于具有较高的敏感 性和特异性，因而广泛应用于临床样品中 CDV 的检 测［4－8］。目前，在 RNA 病毒检测中，两步法 RT-PCR 应用的较多，但未见国内有关一步法 RT-PCR 用于检 测 CDV 的报道。为此，本研究针对 CDV N 蛋白的相 对保守区序列设计了 1 对特异的寡聚核苷酸引物，建 立了 CDV 一步 RT-PCR 检测方法，并利用该方法检 测了来自山东不同地区的水貂、狐狸、貉和犬的疑似 犬瘟热病料。
的敏感性相当。对 25 例犬瘟热临床疑似病例样品，一步法 RT-PCR 检测出 17 份阳性，与两步法 RT-PCR 的阳性符合率达 94. 4% ，胶体金检测试
纸条检测出 13 份阳性。研究结果表明，建立的 CDV 一步法 RT-PCR 检测方便、敏感、特异，适用于 CDV 临床病料的检测和分子流行病学调查。
利用 DNAstar 软件中的 MegLign 比对 GenBank 中 登录的不同来源的 18 株 CDV 的全基因序列，同时 BLAST 比对 GenBank 上发表的所有 CDV N 蛋白基因 序列，选定 N 基因的相对保守区。根据 GenBank 中 CDV Onderstepoort 株的基因序列，利用 primer 5. 0 设 计了 1 对特异性寡聚核苷酸引物，扩增目的片段大小 为 265 bp。P1： 5'-CTCTGCTTGCGGTCTTAC-3'； P2： 5 ' -AATCCACCTTCTCATCTCC-3 ' 。引物 由 北 京 赛 百 盛 基因技术有限公司合成。 1. 5 病毒总 RNA 的制备
提取 狂 犬 病 毒 （ RV ） 疫 苗 株、 新 城 疫 病 毒 （ NDV） 疫苗株、CDV Lederle 株和正常 Vero、BHK21 细胞的 RNA 及 CPV 的 DNA。取核酸模板各 3 μL， 以 P1、P2 为引物，优化的循环参数下进行 PCR 扩 增，琼脂糖电泳鉴定结果。 1. 8 敏感性试验
畜牧与兽医 2012 年 第 44Байду номын сангаас卷 第 1 期
·51·
2. 2 特异性试验 按上述反应体系，采用一步法 RT-PCR 扩增 CDV
Lederle 株，得 到 了 265 bp 的 特 异 片 段，而 从 RV、 NDV、CPV 和正常 Vero、BHK-21 细胞中均未扩增出 条带。 2. 3 敏感性试验
10 倍系列稀释提取的 CDV Lederle 株的核酸，采 用两步法 RT-PCR 扩增，10－6 稀释模板能扩增到 265 bp 的目的条带，而采用建立的一步法 RT-PCR 法在 同样条件下扩增，稀释度达 10－6 亦出现明显的 265 bp 的目的条带 （ 见图 3） 。通过紫外分光光度计测定， 检测出的最低核酸浓度为 0. 043 6 μg / mL。
收稿日期： 2011-05-10； 修回日期： 2011-10-28 基金项目： 山东省自然科学基金 （ ZR2010CL023） 。 作者简介： 张洪亮 （ 1984- ） ，男，硕士研究生。 * 通讯作者： 黄娟，博士，副教授，主要从事动物传染病分子诊 断与防治 研 究，E-mail： happyhj888 @ 163. com； 单 虎， 博 士，教 授， 主要 从 事 动 物 传 染 病 防 治 和 生 物 制 品 研 究， E-mail： shanhu67 @ 163. com。