犬瘟热病毒一步RT_PCR检测方法的建立_张洪亮

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畜牧与兽医 2012 年 第 44 卷 第 1 期
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兽医 科技
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犬瘟热病毒一步 RT-PCR 检测方法的建立
张洪亮1 ,孟培培1 ,宋晓明2 ,杨瑞梅1 , 秦晓冰1 ,丰艳妮1 ,黄 娟1* ,单 虎1*
( 1. 青岛农业大学动物科技学院,山东 青岛 266109; 2. 乳山市畜牧局,山东 乳山 264500)
反应总体积为 25 μL,其中模板 RNA 3 μL,5 × Reverse Transcriptase Buffer 5 μL,2. 5 mmol / L dNTP 2. 5 μL,RNase inhibitor 0. 5 μL,AMV 反转录酶 0. 5 μL,P1、P2 各 0. 5 μL,rTaq DNA 聚 合 酶 0. 5 μL, 去离子水 12 μL。优化一步法 RT-PCR 循环参数,确 定最佳的反应程序为: 42 ℃ 60 min; 95 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s,50. 8 ℃ 40 s,72 ℃ 1 min,30 个循环; 72 ℃ 延 伸 10 min。反 应 结 束 后 取 6 μL 产 物 进 行 1. 2% 琼脂糖凝胶电泳,利用凝胶成像系统拍照并分 析结果。 1. 6. 2 两步法 RT-PCR
无菌取山东青岛、潍坊、威海等地区送检的疑似 犬瘟热的水貂、狐狸、貉和犬的脑、肝、肺、脾以及 膀胱等 脏 器,Trizol 法 提 取 RNA,进 行 一 步 法 RTPCR 鉴定。
2 结果
2. 1 反应条件优化 通过反复多次对不同条件的摸索,优化了一步法
RT-PCR 的反应体系。以引物 P1 / P2 在 48 ~ 58 ℃ 退 火温度范围 内 分 别 扩 增 CDV Lederle 株,在 49. 7 ~ 54. 0 ℃ 时出现明显的特异性目的条带,以 50. 8 ℃ 扩 增时,目的条带最佳,故选用 50. 8 ℃ 作为最适退火 温度 ( 见图 1,2) 。
1. 2 主要试剂 DMEM 培养基购自美国 Gibco 公司; 标准胎牛血
清购自天津灏洋生物制品科技有限公司; TaKaRa Ribonuclease Inhibitor、 dNTP、 Reverse Transcriptase ( AMV ) 、 rTaq DNA 聚 合 酶、 DNA 分 子 量 标 准 DL2000 购自大连宝生物工程公 司; Trizol 试 剂 购 自 Invitrogen 公司; 琼脂糖购自上海夏夷实业有限公司; DEPC 购自 Sigma 公司。 1. 3 病毒培养
待培养 Vero 细胞长满单层,将培养液弃去,用 不含血清的 DMEM 冲洗 3 次后,置于超净台上备用。 将冻干病毒以 1 mL PBS 液溶解。将溶解的病毒用无 菌吸管接种细胞,37 ℃ 感作 1 h。弃去细胞瓶内液 体,用无菌 PBS 液洗涤 3 次,加 1% 双抗和不含血清 的 DMEM 培养基 10 mL,6 h 后换液 1 次。72 h 后, 待细胞出现明显病变后以封口胶封口,将细胞反复冻 融 3 次。10 000 r / min,离心 10 min,取上清 -20 ℃ 保存备用。 1. 4 引物的设计与合成
将 CDV Lederle 株 Vero 细胞培养物及上清处理, 提取 RNA,进行 10-1 ~ 10-8 系列稀释,利用紫外分光
光度计测定核酸浓度,按优化的循环参数进行一步法 RT-PCR 扩增,电泳观察,确定反应的敏感性。 1. 9 重复性试验
以建立的一步法 RT-PCR,分 别 对 CDV Lederle 株、送检的犬瘟热阳性病料以及 CDV 细胞培养物和 正常细胞对照样品重复检测 3 次,以验证试验的稳 定性。 1. 10 临床病料检测
M. DNA 标准 DL2000; 1-6: 分别为 10 -1 -10 -6 CDV 病毒 RNA 模 板稀释液的 RT-PCR 产物
图 3 RT-PCR 敏感性试验 ( 上图一步法,下图两步法)
2. 4 重复性试验 利用建立的一步法 RT-PCR 方法在不同时间对每
份样品重复检验 3 次,检验结果一致。 2. 5 临床病料的检测
反转 录 体 系 为 20 μL, 其 中 RNA 5 μL,5 × Reverse Transcriptase Buffer 4 μL,2. 5 mmol / L dNTP 2 μL,RNase inhibitor 0. 5 μL,AMV 反转录酶 0. 5 μL, P1、P2 各 0. 5 μL,DEPC H2 O 7 μL。42 ℃ 反转录 1 h,之后 70 ℃ 10 min 灭活反转录酶。PCR 体系为 25 μL,其中上述反转录产物 2 μL,10 ×PCR buffer 2. 5 μL,2. 5 mmol / L dNTP 2 μL,P1、P2 引物各 0. 5 μL, rTaq DNA 聚合酶 0. 5 μL,ddH2 O 17 μL。反应程序 为: 95 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s,50. 8 ℃ 40 s,72 ℃ 1 min,30 个循环; 72 ℃ 延伸 10 min。反应结束后取 6 μL 产物进行 1. 2% 琼脂糖凝胶电泳,利用凝胶成像 系统拍照并分析结果。 1. 7 特异性检测
1 材料与方法
1. 1 毒株、细胞和病料 CDV Lederle 株、犬细小病毒 ( CPV) 由本实验
室保存; Vero、BHK-21 细胞由山东信得药业有限公 司惠赠; 狂犬病活疫苗由齐鲁动物保健品有限公司生 产; 鸡新城疫低毒力活疫苗 ( Clone-30 株) 由青岛 易邦生物工程有限公司生产; 病料来自山东青岛、潍 坊、威海等地区毛皮动物养殖场和动物医院送检的疑 似犬瘟热病例,其中水貂 15 例、狐狸 2 例、貉 3 例、 犬 5 例,无菌采集脑、肝、肺、脾以及膀胱等脏器。
分别用一步法 RT-PCR 和两步法 RT-PCR 检测了 25 份送检的临床犬瘟热疑似病例的脏器组织样品, 各检 测 出 阳 性 样 品 17 份 和 18 份,检 出 率 分 别 为 68% 、72% ,阳性符合率为 94. 4% 。见表 1。
采用 Invitrogen 公司的 Trizol 试剂提取 RNA。主 要步骤为: ( 1) 取 250 μL 处理好的病毒悬液加入到
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EP 管中,再加入 750 μL Trizol LS Reagent,颠倒混匀 后于 4 ℃ 静置 5 min; ( 2) 加入 200 μL 氯仿,反复颠 倒 EP 管 振 荡 5 ~ 6 次 至 乳 化 均 匀,4 ℃ 静 置 约 10 min; ( 3) 4 ℃ 、12 000 r / min 离心 15 min,取出 EP 管,轻轻吸取上层水相约 500 μL 转移入另一新 EP 管; ( 4 ) 加 入 等 体 积 ( 500 μL) 的 冰 冷 异 丙 醇 ( -20 ℃ 保 存 ) , 颠 倒 混 匀 后 置 - 20 ℃ 过 夜 ( 或 -70 ℃ 放置 30 min) ,充分沉淀核酸; ( 5 ) 4 ℃ 、 12 000 r / min 离 心 10 min, 弃 上 清 液, 加 入 1 mL 75% 乙醇 ( 4 ℃ 保存) ; ( 6) 4 ℃ 、12 000 r / min 离心 5 min,弃去上清液,倒置 EP 管干燥核酸 ( 放置时间 不宜超过 25 min) ,加入 20 μL DEPC H2 O 溶解 RNA。 1. 6 反应体系及扩增条件 1. 6. 1 一步法 RT-PCR
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摘要: 根据犬瘟热病毒 ( CDV) 弱毒株 Onderstepoort 的核蛋白 ( N) 基因的相对保守区序列设计了 1 对特异性寡聚核苷酸引物,在国内首次建立
了 CDV 一步 RT-PCR 检测方法。该法可以特异地扩增出 N 基因 265 bp 大小的目的片段,可以检测到 0. 043 6 μg / mL 的总 RNA,与两步法 RT-PCR
关键词: 犬瘟热病毒; 一步 RT-PCR; 检测
中图分类号: S852. 65
文献标识码: A
文章编号: 0529-5130( 2012) 01-0049-04
犬瘟热病毒 ( canine distemper virus,CDV) 是引 起犬 科、 鼬 鼠 科 及 部 分 浣 熊 科 多 种 动 物 犬 瘟 热 ( Canine distemper,CD) 的病原[1-3]。反转录-聚合酶 链式反应 ( RT-PCR) 诊断方法由于具有较高的敏感 性和特异性,因而广泛应用于临床样品中 CDV 的检 测[4-8]。目前,在 RNA 病毒检测中,两步法 RT-PCR 应用的较多,但未见国内有关一步法 RT-PCR 用于检 测 CDV 的报道。为此,本研究针对 CDV N 蛋白的相 对保守区序列设计了 1 对特异的寡聚核苷酸引物,建 立了 CDV 一步 RT-PCR 检测方法,并利用该方法检 测了来自山东不同地区的水貂、狐狸、貉和犬的疑似 犬瘟热病料。
的敏感性相当。对 25 例犬瘟热临床疑似病例样品,一步法 RT-PCR 检测出 17 份阳性,与两步法 RT-PCR 的阳性符合率达 94. 4% ,胶体金检测试
纸条检测出 13 份阳性。研究结果表明,建立的 CDV 一步法 RT-PCR 检测方便、敏感、特异,适用于 CDV 临床病料的检测和分子流行病学调查。
利用 DNAstar 软件中的 MegLign 比对 GenBank 中 登录的不同来源的 18 株 CDV 的全基因序列,同时 BLAST 比对 GenBank 上发表的所有 CDV N 蛋白基因 序列,选定 N 基因的相对保守区。根据 GenBank 中 CDV Onderstepoort 株的基因序列,利用 primer 5. 0 设 计了 1 对特异性寡聚核苷酸引物,扩增目的片段大小 为 265 bp。P1: 5'-CTCTGCTTGCGGTCTTAC-3'; P2: 5 ' -AATCCACCTTCTCATCTCC-3 ' 。引物 由 北 京 赛 百 盛 基因技术有限公司合成。 1. 5 病毒总 RNA 的制备
提取 狂 犬 病 毒 ( RV ) 疫 苗 株、 新 城 疫 病 毒 ( NDV) 疫苗株、CDV Lederle 株和正常 Vero、BHK21 细胞的 RNA 及 CPV 的 DNA。取核酸模板各 3 μL, 以 P1、P2 为引物,优化的循环参数下进行 PCR 扩 增,琼脂糖电泳鉴定结果。 1. 8 敏感性试验
畜牧与兽医 2012 年 第 44Байду номын сангаас卷 第 1 期
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2. 2 特异性试验 按上述反应体系,采用一步法 RT-PCR 扩增 CDV
Lederle 株,得 到 了 265 bp 的 特 异 片 段,而 从 RV、 NDV、CPV 和正常 Vero、BHK-21 细胞中均未扩增出 条带。 2. 3 敏感性试验
10 倍系列稀释提取的 CDV Lederle 株的核酸,采 用两步法 RT-PCR 扩增,10-6 稀释模板能扩增到 265 bp 的目的条带,而采用建立的一步法 RT-PCR 法在 同样条件下扩增,稀释度达 10-6 亦出现明显的 265 bp 的目的条带 ( 见图 3) 。通过紫外分光光度计测定, 检测出的最低核酸浓度为 0. 043 6 μg / mL。
收稿日期: 2011-05-10; 修回日期: 2011-10-28 基金项目: 山东省自然科学基金 ( ZR2010CL023) 。 作者简介: 张洪亮 ( 1984- ) ,男,硕士研究生。 * 通讯作者: 黄娟,博士,副教授,主要从事动物传染病分子诊 断与防治 研 究,E-mail: happyhj888 @ 163. com; 单 虎, 博 士,教 授, 主要 从 事 动 物 传 染 病 防 治 和 生 物 制 品 研 究, E-mail: shanhu67 @ 163. com。
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