第二章 酶学基础
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2基因工程的酶学基础
GCGC NarI BsaHI
GGCC
BbeI HaeII XbaI Bcl I
FspI
ApaI BanII
Bsp1286
T****A T****A NruI T****A T****A
EaeI MscI
GTAC **** **** **** **** A****T A****T A****T A****T A****T
② 不完全同裂酶： 识别位点相同，但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。
Xma I
Sma I
5’-CCCGGG -3’ 3’-GGGCCC-5’ 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
（6）同尾酶(Isocaudamers）
识别的序列不同，但能切出相同的粘性末 端。如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等
核酸限制性内切酶的类型及主要特性
特性 I类内切酶 II类内切酶 III类内切酶
限制和修饰 单一多功能的酶 活性 内切酶和甲基 共同亚基的双 化酶分开 功能酶
内切酶的蛋 3种不同的亚基 白结构 限制作用所 ATP、 Mg2+和SAM 需要的辅助 因子 寄主特异性 EcoB： 位点识别序 TGA(N)8TGCT 列 EcoK： AAC(N)6GTGC
BamH I Bgl Ⅱ
Bcl I Xho Ⅱ
5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’ 5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’ 5’-UGATCY-3’ 3’-YCTAGU-5’
U代表嘌呤；Y代表嘧啶。
Sau 3A
BfaI
DpnI
HinpI
HaeIII HhaI
第02章 酶学基础知识
（2） 胞外酶
胞外酶 ( 又可称为分泌型酶 ) 是指可以穿过质 膜的任何酶，大多数是水解酶，多数工业用 酶都是胞外酶。如淀粉酶、蛋白酶、纤维素 酶、果胶酶等。胞外酶优点明显，它比胞内 酶容易回收、纯化，不必将细胞破碎，也不 用去核酸，容易获得高产(因为胞外酶生产不 受可获得的生物量的限制)。 胞外酶的分泌位置由细胞质膜的结构所决定。
3.
恒态酶和调节酶
根据酶在代谢中所处的地位、含量与活性情况， 也可以分成恒态酶与调节酶。 恒态酶是构成代谢途径和物质转化体系的基本 组成成分，在细胞中恒态酶的含量相对恒定， 其活性仅受反应动力学系统本身的组成因素调 节。 调节酶是指在代谢途径和物质转化体系中起调 节作用的关键酶，它们的含量与活性常因机体 的机能状况而不同。按照其活性调节方式又可 分为三种类型:潜态酶，别构酶和多功能酶。
（4） 裂合酶类
裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键 的反应及其逆反应。 底物 裂解基团 裂合酶 分为5个亚类，对应裂解的键的性质主要包括醛缩酶、 水化酶及脱氨酶等。 例如， D-果糖-1，6-二磷酸：D-甘油醛-3-磷酸裂合酶 （果糖二磷酸醛缩酶、醛缩酶A）
（5） 异构酶类
按照分子中起催化作用的主要组分不同， 酶可以分为蛋白类酶（proteozyme，P 酶）和核酸类酶（ribozyme，R酶，核 酶）两大类。 两者的显著区别之一是蛋白类酶只能催 化其他分子进行反应，而核酸类酶却可 以催化酶分子本身也可以催化其他分子 进行反应。
一、蛋白类酶（P酶）的分类
1961年国际酶学委员会（Enzyme Committee, EC）根据 酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类：
《酶学基本原理》PPT课件
O H
O
系统命名： 供体：受体氧化还原酶
推荐命名： （1）供体脱氢酶（2）受体氧化酶
精品医学
7
酶的分类2：转移酶
Transferase
❖ 转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子 的基团或原子转移到另一个底物的分子上。 例如: 谷丙转氨酶催化的氨基转移反应
CH3CHCOOH HOOCCH2CH2CCOOH
应类型。
乳酸：NAD+氧化还原酶
乳酸脱氢酶
对于催化水解反应的酶一般精在品医酶学 的名称上省去反应类型。 4
(3)EC 命名法
Each enzyme is now classified and named according to the type of chemical reaction it catalyzes. So an enzyme is assigned a four-number classification and a two-part name called a systematic name. In addition recommended name is suggested by IUB for everyday use.
H O O C C H = C H C O O H H 2 OH O O C C H 2 C H C O O H O H
系统命名： 底物+裂解基团+裂合酶
推荐命名： 裂解底物+脱精（品基医学团）酶
10
酶的分类5：异构酶
Isomerase
❖ 异构酶催化各种同分异构体的相互转化， 即底物分子内基团或原子的重排过程。 例如：6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应
第二章 酶学基本原理
第一节 酶的分类、组成
酶学与酶工程重点总结
酶学与酶⼯程重点总结第⼆章酶学基础⼀、酶的活性中⼼(active center，active site)（⼀）活性中⼼和必需基团1、与酶活性显⽰有关的，具有结合和催化底物形成产物的空间区域，叫酶的活性中⼼，⼜叫活性部位。
2、活性中⼼可分为结合部位和催化部位。
3、结合部位决定酶的专⼀性，催化部位决定酶所催化反应的性质。
4、酶结构概述（1）活性中⼼是⼀个三维实体。
（2）是有⼀些⼀级结构上可能相距较远的氨基酸侧链基团组成，有的还包含辅酶或辅基的某⼀部分基团。
（3）在酶分⼦表⾯呈裂缝状。
（4）酶活性中⼼的催化位点和结合位点可以不⽌⼀个。
（5）酶活性中⼼的基团都是必需基团，但必需基团还包括活性中⼼以外的基团。
5、酶分⼦中的氨基酸残基或其侧链基团可以分为四类1．接触残基2．辅助残基3．结构残基4．⾮贡献残基（⼆）酶活性中⼼中的化学基团的鉴别1．⾮特异性共价修饰：某些化学试剂能使蛋⽩质中氨基酸残基的侧链基团反应引起共价结合、氧化或还原修饰反应，使基团结构和性质发⽣变化。
如果某基团修饰后不引起酶活⼒的变化，就可初步认为此基团可能是⾮必需基团；反之，如修饰后引起酶活⼒的降低或丧失，则此基团可能是酶的必需基团。
2．亲和标记共价修饰剂是底物的类似物，可专⼀性地引⼊酶的活性中⼼，并具有活泼的化学基团(如卤素)，可与活性中⼼的基团形成稳定的共价键。
因其作⽤机制是利⽤酶对底物类似物的亲和性⽽将酶共价标记的，故称为亲和标记。
3．差别标记在过量底物或可逆抑制剂遮蔽活性中⼼的情况下，加⼊共价修饰剂，使后者只修饰活性中⼼以外的有关基团；然后去除底物或可逆抑制剂，暴露活性中⼼，再⽤同位素标记的向⼀修饰剂作⽤于活性中⼼的同类基团；将酶⽔解后分离带有同位素的氯基酸，即可确定该氨基酸参与活性中⼼。
4．蛋⽩质⼯程这是研究酶必需基闭和活性中⼼的最先进⽅法，即将酶蛋⽩相应的互补DNA(cDNA)定点突变，此突变的cDNA表达出只有⼀个或⼏个氨基酸被置换的酶蛋⽩，再测定其活性，可以知道被置换的氨基酸是否为活⼒所必需。
酶改性基本理论
蛋白类酶的分类原则
氧化还原酶(oxidoreductases) 转移酶(transferases) 水解酶(hydrolases) 裂合酶(lyases) 异构酶(isomerases) 连接酶(ligases)或合成酶(synthetases)
★★ 国际系统分类法及编号（EC编号）
Sidney Altman Yale University New
Haven, CT, USA
Cech和Altman各自独立地发现了RNA 的催化活性，并命名这一类酶为 ribozyme（核酶），2人共同获1989年 诺贝尔化学奖。
具有催化作用的 一类蛋白质 ——蛋白质酶类
有自剪切或催 化功能的核酸
※Koshland将酶分子的氨基酸残基分为四类： (1)接触残基：它们与底物接触、参与底物的 化学转变。此类氨基酸残基的一个或几个原 子与底物分子中一个或几个原子的距离都在 一个键距离 (1.5～2埃)之内。它们的侧链，起 与底物结合作用的称为结合基团；起催化作 用的称为催化基团。有时结合基团也参与催 化作用，不能绝对区分。这些残基中的一些 有时可能也起辅助残基的作用。
(4)非贡献残基： 除了上述三类酶的必需基团外，酶分 子上其余的氨基酸残基都可称为非贡献残基或非必需 基团。它们对酶活性显示不起作用，可以由其它氨基 酸残基代替，且在酶分子中占很大比例。
例如，木瓜蛋白酶的三分之二的氨基酸残基是非贡献
残基。当然，它们也可能在免疫、酶活性调节、运输
转移、防止降解、种系发育的物种专一性等方面起作
活性中心以外 的必需基团
结合基团
底物 催化基团 活性中心
酶活性中心示意图
S-S
底物
肽链
活性中心外 必需基团
第二章酶学基础
(1) 氧化还原酶 Oxidoreductase
• 氧化-还原酶催化氧化-还原反应。
AH+B=A+BH
• 主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶 (Oxidase)。
• 如乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。
CH3CHCOOH NAD+ OH
CH3CCOOH NADH H+ O
v
酶浓度对酶促反应速度的影响
5 4 3 2 1 0
0.00
1.00
2.00 3.00 [E]
4.00
5.00
三、温度的影响
• 最适温度：在 某一特定温度 条件下，酶催 化反应速度达 到最大，这一 温度即为最适 温度。
• 在一定范围内，随着温度升高，酶活力增加；超 过此范围后，随着温度升高，酶活力反而下降； 大多数酶在超过60℃，活性迅速下降甚至失活。
3、酶分子的结构域 结构域在蛋白质肽链的折叠和变构调节等现象中具
有重要作用，不同的结构域常有不同的功能。
纤维素酶结构示意图
四、酶的四级结构与催化功能的关系
• 具有四级结构的酶按功能分有两类：
– 与催化作用有关：由数个相同亚基组成，每个 亚基有一个活性中心。四级结构完整，催化功 能充分发挥。
– 与代谢调节有关：由不同亚基构成，分别为不 同的活性中心和调节中心。
• 例：乳酸脱氢酶催化丙酮酸加氢生成L-乳酸
立体异构专一性：当酶的作用底物或形成的 产物含有不对称碳原子时，酶只能作用于异 构体的一种。
• 例：天冬氨酸裂合酶仅作用于L-天冬氨酸， 经脱氨基生成延胡索酸（反丁烯二酸）或 其逆反应。
2、相对专一性：一种酶能够催化一类结构相 似的物质进行某种相同类型的反应。
第二章 酶的基础
d. 变形或张力
e. 酶的活性中心为疏水区 域
酶的活性中心为酶分子的凹穴 此处常为非极性或疏水性的氨基酸残基
• 酶的分类：
氧化还原酶 转移酶 水解酶 裂合酶 异构酶 连接酶 单体酶 寡聚酶 多酶复合体 锁和钥匙模型 诱导锲合模型
• 酶的组成和结构特点
酶的作用过程
• 酶的作用机制
酶与底物的结合模型
二．抑制程度的表示
• 1． 相对活力分数（残余活力分数） a=Vi/Vo • 2． 相对活力百分数（残余活力百分数） a%==Vi/Vo*100% • 3． 抑制分数 指被抑制而失去活力的分数i=1-a=1Vi/Vo • 4． 抑制百分数 i%=(1-a)*100%==(1-Vi/Vo)*100%
（3）共价修饰调节
改变酶的活性来调节，就是在一种酶的 分子上，共价的引入一个基团从而改变 它的活性。例如，磷酸化酶的磷酸化和 去磷酸化。
4）限制性蛋白酶水解作用 与酶活力的调控
• 例如酶原的激活，是指体内合成的非活化 的酶前体，在适当的条件下，受到H+或特 异的蛋白酶限制性水解，切去酶原分子上 的某个肽键而转变为活性的酶。胃蛋白酶 原是受H+作用转化为胃蛋白酶，胰蛋白酶 原是在小肠中被其他蛋白水解酶切去一个 六肽从而活化为胰蛋白酶。
三、酶的调节性好
• 主要表现在以下几个方面 （1）酶浓度的调节：通过诱导或抑制酶的合成 （2）激素调节:激素水平的高低可调节酶量 （3）共价修饰调节：改变酶的活性来调节 （4）限制性蛋白酶水解作用与酶活力的调控： （5）抑制剂的调节：改变酶的活性来调节 （6）反馈调节：被其终端产物抑制 （7）金属离子和其他小分子化合物的调节：
多酶复合体的组成部分
• 辅因子：酶蛋白中非蛋白质部分，它可 以是无机离子也可以是有机化合物。 • 辅酶：有机辅因子与酶蛋白结合松散即 为辅酶。 • 辅基：有机辅因子与酶蛋白结合紧密即 为辅基。 • 区别在于：是否能透析的方法除去。
酶学原理笔记
第一章绪论酶是生物细胞产生的、具有催化能力的生物催化剂。
定义：酶是生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。
酶的重要两大类：主要由蛋白质组成——蛋白类酶（P酶）主要由核糖核酸组成——核酸类酶（R酶）酶与其他化学催化剂的区别、特点：（1）酶的催化高效性通常要高出非生物催化剂催化活性的106~1013倍（2）高度专一性（3）温和的作用条件常温常压和温和的酸碱度条件（4）容易控制酶的反应（5）酶的来源广泛第二章酶学基础酶的活性中心：是它结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是整个酶分子相当小的部分，它是由在线性多肽中可能相隔很远的氨基酸残基形成的三维实体。
必需基团：活性中心的一些化学基团为酶发挥作用所必需活性中心外的必需基团－－结构残基；非贡献残基（非必需残基）：是除了酶的必须基团之外，酶蛋白的其余部分中的氨基酸残基。
8种频率最高的氨基酸残基：丝氨酸、组氨酸、胱氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和赖氨酸。
酶的结构;1、酶的一级结构：是催化基础，是把蛋白质肽链中氨基酸的排列顺序。
二硫键的断裂将使酶变性而丧失其催化能力。
2、酶的二级结构：是肽链主链不同肽段通过自身的相互作用，形成氢键，延一条主轴盘旋折叠而形成的局部空间结构。
3、酶的三级结构：是多肽在二级结构基础上，通过侧链基团的相互作用进一步卷曲折叠，形成的特定构象。
4、酶的四级结构：是指由不同或相同的亚基按照一定排布方式聚合而成的蛋白质结构。
具有四级结构的酶按其功能分，一类与催化作用有关，另一类与代谢调节关系密切。
（亚基虽然具有三级结构，但单独存在时通常没有生物学活性或活性低，只有缔合形成特定的四级结构时才具有生理功能。
）活性中心空间构象的维持则依赖于酶蛋白的二、三级结构的完整性。
酶分子的结构域：是指蛋白质肽链中一段独立的具有完整、致密的立体结构区域，一般由40—400个氨基酸残基组成。
酶的催化原理：（中间产物理论）在酶浓度固定的条件下，要达到最大初速率必须增加底物浓度，这是大多数酶的特征。
基因工程的酶学基础
5′···GTNAC···3′ 3′···CANTG···5′
切割方式
Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA，水解磷酸二酯键中3’ 位酯键产生两个末端，末端结构是5’-P和3’-OH，产生3种不同的切口。
粘性末端(cohesive ends):因酶切位点在两条DNA单链上不同（对称）酶切后形成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。
第二章 基因工程的酶学基础
从核酸分子末端逐个降解核苷酸，叫外切核酸酶 从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫内切核酸酶
按水解断裂核酸分子的方式:
核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的蛋白酶。 特异水解断裂RNA分子，核糖核酸酶（RNase） 特异水解断裂DNA分子，脱氧核糖核酸酶（DNase） 非专一性酶，底物或者为DNA或者为RNA
主要特性
Ⅰ型
Ⅱ型
Ⅲ型
限制修饰 蛋白结构 辅助因子 识别序列 切割位点
双功能（具甲基化） 异源三聚体 ATP Mg2+ SAM 距识别序列1kb处 随机性切割
单一功能 同源二聚体 Mg2+ 4-6bp回文序列 识别序列内或附近特异切割
双功能（具甲基化） 异源二聚体 ATP Mg2+ 距识别序列下游 24-26bp处 随机性切割
01
大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示
01
限制性内切酶的命名
如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。
切割方式
Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA，水解磷酸二酯键中3’ 位酯键产生两个末端，末端结构是5’-P和3’-OH，产生3种不同的切口。
粘性末端(cohesive ends):因酶切位点在两条DNA单链上不同（对称）酶切后形成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。
第二章 基因工程的酶学基础
从核酸分子末端逐个降解核苷酸，叫外切核酸酶 从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫内切核酸酶
按水解断裂核酸分子的方式:
核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的蛋白酶。 特异水解断裂RNA分子，核糖核酸酶（RNase） 特异水解断裂DNA分子，脱氧核糖核酸酶（DNase） 非专一性酶，底物或者为DNA或者为RNA
主要特性
Ⅰ型
Ⅱ型
Ⅲ型
限制修饰 蛋白结构 辅助因子 识别序列 切割位点
双功能（具甲基化） 异源三聚体 ATP Mg2+ SAM 距识别序列1kb处 随机性切割
单一功能 同源二聚体 Mg2+ 4-6bp回文序列 识别序列内或附近特异切割
双功能（具甲基化） 异源二聚体 ATP Mg2+ 距识别序列下游 24-26bp处 随机性切割
01
大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示
01
限制性内切酶的命名
如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。
酶学基础资料
限制(restriction)作用是指细菌的限制性核酸酶对DNA的 分解作用，限制一般是指对外源DNA侵入的限制。修饰 (modification)作用是指细菌的修饰酶对于DNA碱基结构改变的 作用(如甲基化)，经修饰酶作用后的DNA可免遭其自身所具有的 限制酶的分解。
到20世纪60年代中期，科学家推测细菌中有限制－修饰 系统(restriction—modification system． R-M system)。该 系统中有作用于同一DNA的两种酶，即分解DNA的限制酶和改变 DNA碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶，而且，这两种酶作 用于同一DNA的相同部位。一般说来，不同种的细菌或不同种的 细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制-修饰系统。
1968年，Meselson从E．coli K株中分离出了第一个限制
酶EcoK，同年Linn和Aeber从 E．coli B株中分离到限制酶 EcoB。遗憾的是，由于EcoK和EcoB这两种酶的识别和切割位点
不够专一，在基因工程中意义不大。
1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种限
制性酶，能够特异性地切割 DNA，这个酶后来命名为HindⅡ，
这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶。由于这类酶的识 别序列和切割位点特异性很强，对于分离特定的DNA片段就具 有特别的意义。
二.限制性内切酶的命名 与种类
按照国际命名法，限制性内切核酸酶属于水解酶类。由于限制性酶的 数量众多，而且越来越多，并且在同一种菌中发现几种酶。为了避免混淆， 1973年Smith 和Nathans对内切酶的命名提出建议，1980年，Roberts对限 制性酶的命名进行分类和系统化。
Ⅱ类限制性内切核酸酶
这类酶的分子量较小. 一般在2-4万道尔顿, 通常由2-4个相同的亚基所 组成。它们的作用底物为双链DNA, 极少数Ⅱ类酶也可作用于单链DNA, 或DNA/RNA杂种双链。这类酶的专一性强, 它不仅对酶切点邻近的两个 碱基有严格要求, 而且对更远的碱基也有要求, 因此, Ⅱ类酶既具有切割位 点的专一性, 也具有识别位点的专一性, 一般在识别序列内切割。切割的方 式有平切和交错切, 产生平末端的DNA片段或具有突出粘性末端的DNA片 段(5'或3'粘性末端)。作用时需要Mg2+作辅助因子, 但不需要ATP和SAM。 Ⅱ类酶与对应的甲基化酶在蛋白亚基上尚未发现有什么关系, 第一个被分 离的Ⅱ类酶是Hind Ⅱ。
食品酶学-酶学基础理论(第二章)
NADH + H+
CH3-CO- COOH 丙酮酸
用电泳法分离LDH可得到5种同工酶区带。都是 由H和M二种不同类型的亚基组成的四聚体。
乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱
同工酶的测定可作为某些疾病的诊断指标。
正常人血清LDH主要来自红细胞渗出，活 力很低。当某一组织病变时，血清LDH同 工酶电泳图谱会发生变化。如肝细胞受 损早期，LDH总活性在正常范围内，但 LDH5升高；急性心肌变时，LDHl可升 高。
氢键
每个氨基酸残基 （第n个）的羰基 氧与多肽链C端方 向的第4个残基 （第n+4个）的酰 胺氮形成氢键。
β-折叠(β-sheet)
折叠片的构象是通过一个肽键的羰基氧和位于同一个肽链或相邻肽链 的另一个酰胺氢之间形成的氢键维持的。肽链分为平行排列（走向都 是由N到C方向）或者是反平行排列（肽链反向排列）。
1.总体积中只占相当小的部分（约1%2%）
2.酶分子表面的一个凹穴，具有一定柔性
3.活性中心为非极性的微环境 4.底物与酶通过形成较弱键力的次级 键相互作用并结合到酶的活性中心
5.酶的活性部位与底物的几何图形并 非正好吻合，底物或酶或两者的构象 同时变化后才相互契合
酶活性中心示意图
举例：酪氨酸酶（多分氧化酶） 酪氨酸酶在生物色素形成中的作用
蜂蜜品质同工酶电泳检测
• 比较两种天然蜂蜜与掺假所用的工业淀粉酶的同工 酶电泳，发现天然蜂蜜的淀粉酶同工酶酶谱和工业 淀粉酶的同工酶酶谱存在差异。
三. 酶的催化机制
底酶
物的
结作
锁钥学说（lock and key hypothesis）
合用 后专
才一
表性
过渡态学说
现必 出须
第二章 酶学基础1
指在一定条件下催化本身RNA分子同时进行剪切和 连接反应的R-酶。
1）含Ⅰ型IVS的R酶
与四膜虫rRNA前体的间隔序列IVS结构类似，在 催化rRNA前体的自我剪接时，需要鸟苷（5'-鸟 苷酸）和Mg2+。
2）含Ⅱ型IVS的R酶
与细胞核mRNA前体的IVS相似，在催化mRNA 前体的自我剪接时，需要Mg2+，不需要鸟苷、5'鸟苷酸。
2、考虑动力学因素的影响
pH、温度、离子强度、效应物浓度、E浓度、底物浓度 （1） 确定最适反应条件，温度，pH值； （2）在一定条件下，将一定量的酶液与底物溶液混合均匀，
记下反应开始时间； （3）反应到一定的时间，取出适量的反应液运用各种生化
检测技术，测定产物的生产量或底物的减少量。
具体方法：
A．终点法 是使酶促反应进行一定时间后，终止其反应， 再用化学或物理方法测定产物或底物变化的量。
通常测定在一定时间内最适于酶的条件下酶 促反应产物的生成量。如蛋白酶的活力，可据酶 催化酪蛋白水解生成的酪氨酸与酚试剂作用的蓝 色反应，再用比色法测定之。
2. 测定完成一定量反应所需的时间
测定酶所催化的一定量底物的减少或一定量 产物的生成所需的时间，酶活力与之成反比。
测定步骤：
1、根据酶催化的专一性 根据酶的专一性，选择适宜的底物，并配制成一 定浓度的底物溶液
E 去磷酸作用 CpCpCpCpCpCp === CpCpCpCpCpC + Pi
2 作用于DNA的R－酶 3 作用于多糖的R－酶 4 作用于氨基酸酯的R－酶
第二节 酶活力的测定方法
一、酶活力测定一般原则 酶活力 反应速度
二、初速度 initial velocity
三、测定物质的选择
1）含Ⅰ型IVS的R酶
与四膜虫rRNA前体的间隔序列IVS结构类似，在 催化rRNA前体的自我剪接时，需要鸟苷（5'-鸟 苷酸）和Mg2+。
2）含Ⅱ型IVS的R酶
与细胞核mRNA前体的IVS相似，在催化mRNA 前体的自我剪接时，需要Mg2+，不需要鸟苷、5'鸟苷酸。
2、考虑动力学因素的影响
pH、温度、离子强度、效应物浓度、E浓度、底物浓度 （1） 确定最适反应条件，温度，pH值； （2）在一定条件下，将一定量的酶液与底物溶液混合均匀，
记下反应开始时间； （3）反应到一定的时间，取出适量的反应液运用各种生化
检测技术，测定产物的生产量或底物的减少量。
具体方法：
A．终点法 是使酶促反应进行一定时间后，终止其反应， 再用化学或物理方法测定产物或底物变化的量。
通常测定在一定时间内最适于酶的条件下酶 促反应产物的生成量。如蛋白酶的活力，可据酶 催化酪蛋白水解生成的酪氨酸与酚试剂作用的蓝 色反应，再用比色法测定之。
2. 测定完成一定量反应所需的时间
测定酶所催化的一定量底物的减少或一定量 产物的生成所需的时间，酶活力与之成反比。
测定步骤：
1、根据酶催化的专一性 根据酶的专一性，选择适宜的底物，并配制成一 定浓度的底物溶液
E 去磷酸作用 CpCpCpCpCpCp === CpCpCpCpCpC + Pi
2 作用于DNA的R－酶 3 作用于多糖的R－酶 4 作用于氨基酸酯的R－酶
第二节 酶活力的测定方法
一、酶活力测定一般原则 酶活力 反应速度
二、初速度 initial velocity
三、测定物质的选择
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广义酸基团 （质子供体）
-COOH,
+ -NH3,
广义碱基团 （质子受体）
-COO , -NH2, O-
-SH,
..
-S ,
OH
HN
+
NH
:N
NH
His 是酶的酸碱催化作用中最活泼的一个催化功能团。
酶催化反应机制的实例 胰凝乳蛋白酶选择裂解芳香族氨基酸如 象Phe、Tyr羧基侧链。其活性中心由 Ser195、His57和Asp102组成。 在胰凝乳蛋白酶的催化反应中，组氨酸 的咪唑基起着广义酸碱催化剂的作用，先 促使Ser195的羟基亲核地附着到底物敏感 肽键中的羧基原子上，形成共价的酰化中 间物，在促进酰化的ES中间物上的酰基转 移到水或其他的酰基受体（如醇、氨基酸 等）上。
① 氧化还原酶
主要包括脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶、氧合酶、 细胞色素氧化酶等。 其催化反应通式为： AH2 ＋ B ＝ A ＋ BH2 被氧化的底物（AH2）为氢或电子供体，被还原的 底物（B）为氢或电子受体。 如乳酸脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。
CH3CHCOOH NAD OH
+
CH3CCOOH NADH O
H+
②转移酶
转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基 团或原子转移到另一个底物的分子上。 其反应通式为： AB ＋ C ＝ A ＋ BC 例如：谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。
③ 水解酶
水解酶催化底物的加水分解反应。
主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。
其反应通式为： AB ＋ H2O ＝ AOH ＋ BH 例如：磷酸二酯酶（EC3.1.4.1）催化磷酸酯键水 解。反应如下：
结合基团 活性部位 必需基团 专一性
催化基团
维持酶的空间结构
催化性质
二、 酶催化作用机理
（一） 酶催化作用的特点
1.高效率：比非催化高108－1020倍；比非酶催化高 107－1013倍
酶催化反应的效率之所以高，是由于酶催化反应 可以使反应所需要的活化能显著降低。
2. 酶的专一性
酶的专一性：酶对催化的反应和反应物有严格的 选择。 （1）绝对专一性：一种酶只能催化一种底物进行一 种反应。 （2）相对专一性 键专一性：作用于具有相同化学键的一类底物 基团专一性：酶的作用底物含有某一相同的基团 （3）立体异构专一性
3.酶活性的可调控性
（1）酶含量的调节 诱导或抑制酶的合成：乳糖操纵子 调节酶的降解 （2）酶活性的调节 ①共价调节： 磷酸/脱磷酸化的修饰 限制性蛋白酶水解
②别构调节
别构调节：某些小分子物质与酶的非催化 部位或别构部位特异性地结合，引起酶蛋 白构象的变化，从而改变酶活性的方式。
别构酶：能发生别构效应的酶。
（3）酸碱催化
酸碱催化是通过瞬时的向反应物提供质子 或从反应物接受质子以稳定过渡态，加速 反应的一类催化机制。在水溶液中通过高 反应性的质子和氢氧离子进行的催化称为 专一的酸碱性催化或狭义的酸碱催化；而 通过H+和OH-以及能提供H+和OH-供体进行的 催化称为总酸碱催化或广义的酸碱催化。
酶分子中可以作为广义酸、碱的基团
1、 酶催化机理：可降低反应的活化能。 在一个反应体系里，任何反应物分子都有 进行化学反应的可能，但并非全部反应物 分子都进行化学反应。只有那些具有较高 能量，处于活化态的分子（活化分子）才 能在分子碰撞中发生化学反应。 活化能：在一定温度下，1摩尔底物全部进 入活化态所需要的自由能（kJ/mol)
当酶遇到其专一性底物时，酶中某些基 团或离子可以使底物分子内敏感键中的某 些基团的电子云密度增高或降低，产生“电 子张力”，使敏感键的一端更加敏感，底物 分子发生形变，底物比较接近它的过渡 态，降低了反应活化能，使反应易于发生。
该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定 形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状。
（三）国际系统分类法及酶的编号 国际酶学委员会，根据各种酶所催化反应的类 型，把酶分为6大类，即氧化还原酶类、转移酶类、 水解酶类、裂合酶类、异构酶类和连接酶类。分 别用1、2、3、4、5、6来表示。再根据底物中被 作用的基团或键的特点将每一大类分为若干个亚 类，每一个亚类又按顺序编成1、2、3、4……等 数字。每一个亚类可再分为亚亚类，仍用1、2、3、 4……编号。每一个酶的分类编号由4个数字组成， 数字间由“·”隔开，编号之前冠以EC。
底物
催化基团
结合基团
活性中心
单体酶、寡聚酶和多酶复合物
1.单体酶：仅有一条具有活性部位的多肽链，全部 参与水解反应。 2.寡聚酶 ：由几个或多个亚基组成，亚基牢固地 联在一起，单个亚基没有催化活性。亚基之间以非 共价键结合。 3.多酶复合物 ：几个酶镶嵌而成的复合物。这些酶 催化将底物转化为产物的一系列顺序反应。
（4）共价催化
共价催化又称亲核催化或亲电子催化， 在催化时，亲核催化剂或亲电子催化剂能 分别放出电子或吸取电子并作用于底物的 缺电子中心或负电中心，迅速形成不稳定 的共价中间复合物，降低反应活化能，使 反应加速。
丙酮酸脱氢酶系（E.coli）：丙酮酸脱氢酶（EⅠ）、 硫辛酰转乙酰酶（EⅡ）和二氢硫辛酰脱氢酶（EⅢ）。 EⅠ EⅡ EⅢ
碱性
EⅠ + EⅡ EⅢ
脲
EⅡ + EⅢ
活性部位和必需基团
必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则 酶的活性丧失。 活性部位：酶分子中直接与底物结合，并和酶 催化作用直接有关的部位。
乳酸：NAD+氧化还原酶
惯用名：只取一个较重要的底物名称和反应类型。
乳酸：NAD+氧化还原酶 乳酸脱氢酶
对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反 应类型。
乳酸脱氢酶 EC 1.
1.
1.
27
第1大类，氧化还原酶
第1亚类，氧化基团CHOH 第1亚亚类，H受体为NAD+
该酶在亚亚类中的流水编号
（2）六大酶类
2. 根据酶催化反应的性质及类型命名；有的酶
结合上述两个原则来命名。
习惯命名比较简单，应用历史较长，尽管
缺乏系统性，但现在还被人们使用。
（二）国际系统命名法 国际系统命名法原则是以酶的整体反应 为基础的，规定每种酶的名称应当明确标 明酶的底物及催化反应的性质。如果一种 酶催化两个底物起反应，应在它们系统名 称中包括两个底物的名称，并以“：”号 将它们隔开。若底物之一是水时，可将水 略去不写。
X射线衍射仪
3 、酶作用专一性的机理
锁和钥匙模型
诱导锲合模型
锁钥匙模型 酶作为生物催化剂的一个重要特点即实现 酶催化功能的必要条件之一是酶必须和底 物结合。 锁钥匙模型提出了结合部位的概念，结合 部位和底物之间存在互补的关系，就像钥 匙和锁一样，因此造成酶的催化部位具有 很强的专一性，结合部位是酶活性中心的 组成部位。
⑥ 合成酶 合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 键的形成反应。这类反应必须与ATP分解 反应相互偶联。
A + B + ATP + H-O-H ==AB + ADP +Pi
例如:丙酮酸羧化酶催化的反应。
丙酮酸
+ CO2+ATP 草酰乙酸+ADP+H3PO4
Ser195
图2-6 胰凝乳蛋白酶的三维 结构
His57
Asp102 图2-7 胰凝乳蛋白酶活性部位中的催化三联体
Asp 102
（a）
Ser195
His57
Asp 102
（b）
Ser195
底物
His57 图2-8 胰凝乳蛋白酶的催化机制
（a）酶本身；（b）加上底物后，从Ser195转移一个质子给 His57，带正电荷的咪唑环通过带负电荷的Asp102静电相互 作用被稳定
分子由基态达到活化态的途径有二：
1、给反应体系加热或用光照射，从而使反应 分子获得所需的活化能量； 2、使用催化剂，使其瞬时地与反应物结合成 过渡态，降低反应活化能，使反应沿着一个 活化能垒较低的途径进行。
2、中间复合物学说
酶促反应分两步进行
酶和底物形成不稳定的过渡态中间复合物 ES，然后再分解产物并释放出酶。
蛋白类酶（P酶）的分类与命照酶催化作用的类型，将蛋白酶分为6大类 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ 氧化还原酶类 转移酶类 水解酶类 裂合酶类 异构酶类 合成酶类
酶的命名有两种方法：系统名、惯用名。 系统名：包括所有底物的名称和反应类型。
乳酸 + NAD+ 丙酮酸 + NADH + H+
结合部位一般是由氨基酸侧链组成，有的 酶中还有辅基参与，与底物有形状的配合， 使底物的原子和侧链的原子有尽可能多的 接近到范德华半径之内。
除范德华力，稳定底物结合的力还有离子 间吸引力，氢键和疏水作用，侧链、辅基 和底物之间存在相应的配合。
按锁钥模型假说，酶的活性中心空间结构 是刚性的。
后来研究发现自由酶的活性部位和底物之 间并不精确地像锁钥匙一样配合一样，从 而提出了诱导契合模型。 该假说认为底物和酶结合时，结合力促使 底物和酶分别发生一些构象变化，从而有 利于催化反应的进行，酶的构象改变可使 结合更紧密。并使催化基团处于更有利于 催化的位臵上。底物形变造成的应力状态 可使发生反应的键变弱，降低发生反应的 活化自由能，使反应速度增加。形变所需 要的能量由结合能提供。
2、酶的组成和结构特点
单纯酶 酶 结合酶 （全酶）= 酶蛋白 + 辅因子
辅酶 与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。 辅因子 辅基 与酶蛋白结合得紧密的小分子有机物。
金属激活剂 金属离子作为辅助因子。
酶的催化专一性主要决定于膜蛋白部分。 辅因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体。
-COOH,
+ -NH3,
广义碱基团 （质子受体）
-COO , -NH2, O-
-SH,
..
-S ,
OH
HN
+
NH
:N
NH
His 是酶的酸碱催化作用中最活泼的一个催化功能团。
酶催化反应机制的实例 胰凝乳蛋白酶选择裂解芳香族氨基酸如 象Phe、Tyr羧基侧链。其活性中心由 Ser195、His57和Asp102组成。 在胰凝乳蛋白酶的催化反应中，组氨酸 的咪唑基起着广义酸碱催化剂的作用，先 促使Ser195的羟基亲核地附着到底物敏感 肽键中的羧基原子上，形成共价的酰化中 间物，在促进酰化的ES中间物上的酰基转 移到水或其他的酰基受体（如醇、氨基酸 等）上。
① 氧化还原酶
主要包括脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶、氧合酶、 细胞色素氧化酶等。 其催化反应通式为： AH2 ＋ B ＝ A ＋ BH2 被氧化的底物（AH2）为氢或电子供体，被还原的 底物（B）为氢或电子受体。 如乳酸脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。
CH3CHCOOH NAD OH
+
CH3CCOOH NADH O
H+
②转移酶
转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基 团或原子转移到另一个底物的分子上。 其反应通式为： AB ＋ C ＝ A ＋ BC 例如：谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。
③ 水解酶
水解酶催化底物的加水分解反应。
主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。
其反应通式为： AB ＋ H2O ＝ AOH ＋ BH 例如：磷酸二酯酶（EC3.1.4.1）催化磷酸酯键水 解。反应如下：
结合基团 活性部位 必需基团 专一性
催化基团
维持酶的空间结构
催化性质
二、 酶催化作用机理
（一） 酶催化作用的特点
1.高效率：比非催化高108－1020倍；比非酶催化高 107－1013倍
酶催化反应的效率之所以高，是由于酶催化反应 可以使反应所需要的活化能显著降低。
2. 酶的专一性
酶的专一性：酶对催化的反应和反应物有严格的 选择。 （1）绝对专一性：一种酶只能催化一种底物进行一 种反应。 （2）相对专一性 键专一性：作用于具有相同化学键的一类底物 基团专一性：酶的作用底物含有某一相同的基团 （3）立体异构专一性
3.酶活性的可调控性
（1）酶含量的调节 诱导或抑制酶的合成：乳糖操纵子 调节酶的降解 （2）酶活性的调节 ①共价调节： 磷酸/脱磷酸化的修饰 限制性蛋白酶水解
②别构调节
别构调节：某些小分子物质与酶的非催化 部位或别构部位特异性地结合，引起酶蛋 白构象的变化，从而改变酶活性的方式。
别构酶：能发生别构效应的酶。
（3）酸碱催化
酸碱催化是通过瞬时的向反应物提供质子 或从反应物接受质子以稳定过渡态，加速 反应的一类催化机制。在水溶液中通过高 反应性的质子和氢氧离子进行的催化称为 专一的酸碱性催化或狭义的酸碱催化；而 通过H+和OH-以及能提供H+和OH-供体进行的 催化称为总酸碱催化或广义的酸碱催化。
酶分子中可以作为广义酸、碱的基团
1、 酶催化机理：可降低反应的活化能。 在一个反应体系里，任何反应物分子都有 进行化学反应的可能，但并非全部反应物 分子都进行化学反应。只有那些具有较高 能量，处于活化态的分子（活化分子）才 能在分子碰撞中发生化学反应。 活化能：在一定温度下，1摩尔底物全部进 入活化态所需要的自由能（kJ/mol)
当酶遇到其专一性底物时，酶中某些基 团或离子可以使底物分子内敏感键中的某 些基团的电子云密度增高或降低，产生“电 子张力”，使敏感键的一端更加敏感，底物 分子发生形变，底物比较接近它的过渡 态，降低了反应活化能，使反应易于发生。
该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定 形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状。
（三）国际系统分类法及酶的编号 国际酶学委员会，根据各种酶所催化反应的类 型，把酶分为6大类，即氧化还原酶类、转移酶类、 水解酶类、裂合酶类、异构酶类和连接酶类。分 别用1、2、3、4、5、6来表示。再根据底物中被 作用的基团或键的特点将每一大类分为若干个亚 类，每一个亚类又按顺序编成1、2、3、4……等 数字。每一个亚类可再分为亚亚类，仍用1、2、3、 4……编号。每一个酶的分类编号由4个数字组成， 数字间由“·”隔开，编号之前冠以EC。
底物
催化基团
结合基团
活性中心
单体酶、寡聚酶和多酶复合物
1.单体酶：仅有一条具有活性部位的多肽链，全部 参与水解反应。 2.寡聚酶 ：由几个或多个亚基组成，亚基牢固地 联在一起，单个亚基没有催化活性。亚基之间以非 共价键结合。 3.多酶复合物 ：几个酶镶嵌而成的复合物。这些酶 催化将底物转化为产物的一系列顺序反应。
（4）共价催化
共价催化又称亲核催化或亲电子催化， 在催化时，亲核催化剂或亲电子催化剂能 分别放出电子或吸取电子并作用于底物的 缺电子中心或负电中心，迅速形成不稳定 的共价中间复合物，降低反应活化能，使 反应加速。
丙酮酸脱氢酶系（E.coli）：丙酮酸脱氢酶（EⅠ）、 硫辛酰转乙酰酶（EⅡ）和二氢硫辛酰脱氢酶（EⅢ）。 EⅠ EⅡ EⅢ
碱性
EⅠ + EⅡ EⅢ
脲
EⅡ + EⅢ
活性部位和必需基团
必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则 酶的活性丧失。 活性部位：酶分子中直接与底物结合，并和酶 催化作用直接有关的部位。
乳酸：NAD+氧化还原酶
惯用名：只取一个较重要的底物名称和反应类型。
乳酸：NAD+氧化还原酶 乳酸脱氢酶
对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反 应类型。
乳酸脱氢酶 EC 1.
1.
1.
27
第1大类，氧化还原酶
第1亚类，氧化基团CHOH 第1亚亚类，H受体为NAD+
该酶在亚亚类中的流水编号
（2）六大酶类
2. 根据酶催化反应的性质及类型命名；有的酶
结合上述两个原则来命名。
习惯命名比较简单，应用历史较长，尽管
缺乏系统性，但现在还被人们使用。
（二）国际系统命名法 国际系统命名法原则是以酶的整体反应 为基础的，规定每种酶的名称应当明确标 明酶的底物及催化反应的性质。如果一种 酶催化两个底物起反应，应在它们系统名 称中包括两个底物的名称，并以“：”号 将它们隔开。若底物之一是水时，可将水 略去不写。
X射线衍射仪
3 、酶作用专一性的机理
锁和钥匙模型
诱导锲合模型
锁钥匙模型 酶作为生物催化剂的一个重要特点即实现 酶催化功能的必要条件之一是酶必须和底 物结合。 锁钥匙模型提出了结合部位的概念，结合 部位和底物之间存在互补的关系，就像钥 匙和锁一样，因此造成酶的催化部位具有 很强的专一性，结合部位是酶活性中心的 组成部位。
⑥ 合成酶 合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 键的形成反应。这类反应必须与ATP分解 反应相互偶联。
A + B + ATP + H-O-H ==AB + ADP +Pi
例如:丙酮酸羧化酶催化的反应。
丙酮酸
+ CO2+ATP 草酰乙酸+ADP+H3PO4
Ser195
图2-6 胰凝乳蛋白酶的三维 结构
His57
Asp102 图2-7 胰凝乳蛋白酶活性部位中的催化三联体
Asp 102
（a）
Ser195
His57
Asp 102
（b）
Ser195
底物
His57 图2-8 胰凝乳蛋白酶的催化机制
（a）酶本身；（b）加上底物后，从Ser195转移一个质子给 His57，带正电荷的咪唑环通过带负电荷的Asp102静电相互 作用被稳定
分子由基态达到活化态的途径有二：
1、给反应体系加热或用光照射，从而使反应 分子获得所需的活化能量； 2、使用催化剂，使其瞬时地与反应物结合成 过渡态，降低反应活化能，使反应沿着一个 活化能垒较低的途径进行。
2、中间复合物学说
酶促反应分两步进行
酶和底物形成不稳定的过渡态中间复合物 ES，然后再分解产物并释放出酶。
蛋白类酶（P酶）的分类与命照酶催化作用的类型，将蛋白酶分为6大类 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ 氧化还原酶类 转移酶类 水解酶类 裂合酶类 异构酶类 合成酶类
酶的命名有两种方法：系统名、惯用名。 系统名：包括所有底物的名称和反应类型。
乳酸 + NAD+ 丙酮酸 + NADH + H+
结合部位一般是由氨基酸侧链组成，有的 酶中还有辅基参与，与底物有形状的配合， 使底物的原子和侧链的原子有尽可能多的 接近到范德华半径之内。
除范德华力，稳定底物结合的力还有离子 间吸引力，氢键和疏水作用，侧链、辅基 和底物之间存在相应的配合。
按锁钥模型假说，酶的活性中心空间结构 是刚性的。
后来研究发现自由酶的活性部位和底物之 间并不精确地像锁钥匙一样配合一样，从 而提出了诱导契合模型。 该假说认为底物和酶结合时，结合力促使 底物和酶分别发生一些构象变化，从而有 利于催化反应的进行，酶的构象改变可使 结合更紧密。并使催化基团处于更有利于 催化的位臵上。底物形变造成的应力状态 可使发生反应的键变弱，降低发生反应的 活化自由能，使反应速度增加。形变所需 要的能量由结合能提供。
2、酶的组成和结构特点
单纯酶 酶 结合酶 （全酶）= 酶蛋白 + 辅因子
辅酶 与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。 辅因子 辅基 与酶蛋白结合得紧密的小分子有机物。
金属激活剂 金属离子作为辅助因子。
酶的催化专一性主要决定于膜蛋白部分。 辅因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体。