微生物酶活性试验方法

脱氢酶活性

测定方法参考：【周春生, 尹军. 一脱氢酶活性检测方法的研究[J]. 环境科学学报, 1996, 4: 400-405.】以及【环境工程微生物检验手册[M]. 中国环境科学出版社, 1990.】

（一）试验方法：

（1）水样预处理：取污泥混合液10ml，放入离心管中离心5min后去除上清液，用纯水反复清洗三次，最后向样品中加入纯水至10ml搅拌均匀。

（2）加试剂：将处理后样品转移至25ml比色管中，依次加入缓冲液（PH=）、硫酸钠溶液（%）、纯水以及溶液（%）、混匀。

（3）样品培养：将比色管置于37℃条件下水浴恒温振荡器中培养，培养5min 后吸取5ml于离心管内，加甲醛固定以作样品空白；

（4）终止酶反应：继续培养30min，然后向管中加入2ml甲醛终止酶反应；（5）样品萃取：将样品培养液以为1份分装在四个离心管中，连同样品空白对照管一道离心5min, 弃去上清液向各离心管内加6ml丙酮, 研磨搅拌混合, 于37℃条件下萃取TF10min后；

（6）比色分析：将萃取液进行离心5min,用1cm的比色皿取上清液显色液, 于波长485nm处进行比色, 记录吸光值,根据样品显色液与样品空白的吸光值之差, 查标准曲线, 进而计算出TF的生成速度, 即脱氢酶活性(mg/(L*h))

（二）试剂：

（1）％三苯基四氮唑氯化物溶液（氯化三苯基四氮唑，TTC）:4g-2、3、5-氯化三苯基四氮唑，稀释至1L至容量瓶中，棕色瓶保存；

（2）Tris-HCl缓冲液：称取（三羟甲基氨基甲烷, 分析纯, 北京化学试剂厂），加入20ml 1mol/L HCl溶液, 再定容至1L；

（3）硫酸钠溶液（%）：硫酸钠（Na

2SO

3

）稀释至1L容量瓶中；

（4）TTC标准溶液：称取定容与50ml茶色容量瓶中此溶液即为1mg/L的标准溶液。（三）标准曲线的绘制：

（1）采用1mg/L的TTC标准溶液制备每含20、40、60、80、100、120、140µgTTC 系列溶液，即取1、2、3、4、5、6、7ml至50ml容量瓶中，稀释至50ml进行实验；（2）用8试管，分别加入2ml Tris-HCl缓冲液、2ml纯水、2ml不同浓度的TTC，第八只不加入TTC；

（3）加入10g硫酸钠溶液，TTC被还原为红色的TF；

（4）加入5ml丙酮振荡摇匀提取TF（振荡床振荡10次）；

（5）离心5min后485nm下测吸光度；

（6）吸光度为纵坐标，TTC浓度为横坐标绘制标准曲线。

（四）计算：

TF=A*B*C

A：标准曲线上读数；B：计算时间矫正值：培养时间/60min；C分光时的稀释倍数，当分光>0,8时，稀释分光

ATP含量

测定方法参考：【环境工程微生物检验手册[M]. 中国环境科学出版社, 1990.】ATP消化后变为无机磷，制备ATP消化液，测无机磷吸光度以确定ATP含量

（一）试验方法：

（1）活性污泥稀释1:20，曝气池稀释1:10（保证ATP量在之间）；

（2）用50ml烧杯加入35ml 的（pH= Tris缓冲液）加热至沸腾；然后加入待测活性污泥溶液1ml，煮沸加热30-60s后摇动几分钟放入冰浴中，冷却后加入的Tris缓冲液至50ml，摇匀过滤，所得过滤液供测ATP；

（3）ATP制备液消化：去待测液1ml于比色管中，加入硫酸，至于高压锅中加压128℃,15min，冷却后加入1-2滴过氧化氢，摇匀，纯水稀释，制成消化液；（4）取两支试管，加入消化液3ml，摇匀，另一只加入纯水3ml，各加入定磷试剂3ml，至于45℃水浴加热25min，冷却至室温，660nm下分光；

（5）用上述曲线的吸光度在无机磷标准曲线上查出相应的无机磷含量，利用无机磷含量查Pi-ATP相关曲线，得出ATP值；

ATP含量高的污泥，微生物活性越高。

（二）试剂：

（1）无机磷溶液中间液：烘干后称取 KH

2PO

4

稀释至500ml容量品；

（2）无机磷溶液使用液：上述溶液取10ml稀释至100ml；

（3）定磷试剂：6mol/L硫酸：水：%钼酸铵：10%抗坏血酸（体积比）=1：2:1:1，配置时按上述顺序加入试剂。溶液配制后当天使用，正常为浅黄绿色，若颜色不正常，则不能使用

6mol/L硫酸：取17ml浓硫酸加入83ml水中，得6mol/L；%钼酸铵：钼酸铵→100ml容量瓶；10%抗坏血酸：取10g抗坏血酸→100ml容量瓶（棕色瓶冷藏）。（4）ATP：10mgATP

（5）的Tris缓冲液：稀释至500ml+35ml 1mol/L盐酸→1000ml容量瓶

（6）10N硫酸：浓硫酸加入700ml纯水中，冷却后，稀释至1000ml容量瓶中；（三）标准曲线的绘制：

1、无机磷标准曲线的绘制

（1）取KH

2PO

4

置于烘箱中恒重后称取，稀释至500ml容量瓶中，得无机磷浓度

100ug/L；

（2）取10ml上述溶液稀释至100ml容量瓶中定容，得无机磷浓度10ug/L，取6之试管；

463

583

6103

（3）将试管置于45℃中水浴，保温25min，冷却后660nm下比色；

（4）以吸光度作为纵坐标，无机磷含量为横坐标，绘制标准曲线；

2、ATP-无机磷曲线绘制；

（1）称取10mgATP，取少量新配的的Tris缓冲液，充分摇匀溶解，定容至1L,最终浓度为10mg/L；取上清液，配置从系列标准液；

（2）ATP标准液的消化：去待测液1ml于比色管中，加入硫酸，至于高压锅中加压128℃,15min，冷却后加入1-2滴过氧化氢，摇匀，纯水稀释，制成消化液；（3）取两支试管，加入消化液3ml，摇匀，另一只加入纯水3ml，各加入定磷试剂3ml，至于45℃水浴加热25min，冷却至室温，660nm下分光；

（4）以吸光度为纵坐标，ATP浓度为横坐标，绘制曲线；

（5）用上述曲线的吸光度在无机磷标准曲线上查出相应的无机磷含量，然后作为纵坐标，ATP为横坐标，绘制Pi-ATP相关曲线。

脲酶活性

测定方法参考：【李振高, 骆永明, 滕应. 土壤与环境微生物研究法[M]. 科学出版社, 2008.】根据脲酶水解时生成的氨与苯酚钠及次氯酸钠反应，形成兰色靛酚这一原理。

（一）试验方法：

（1）水样预处理：取10ml待测样品经甲苯处理后，加5~10滴甲苯，盖好；（2）加试剂：15min后加10ml 10%尿素和20ml pH=柠檬酸盐缓冲液

（3）样品培养：将锥形瓶置于37℃条件下恒温箱，培养24h过滤；

（4）继续加试剂：取滤液1-3mg/L（视样品浓度定）与50ml比色管中，加入4ml 苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，边加边摇匀；

（5）比色分析：20min后定容，并在578nm波长下分光；

（6）计算：并在标准曲线上求氨氮的量，测出脲酶活性。

每一土样设置用水代替基质（即尿素）的对照，以除掉土壤中氨态氮引起的误差？。还需减去无土基质（尿素＋柠檬酸盐）。

（二）试剂：

（1）甲苯（分析纯）；

（2）10%尿素：尿素（分析纯）10克溶于100毫升蒸馏水中，（现配现用）；（3）柠檬酸盐缓冲液：368克柠檬酸（分析纯）溶于600毫升蒸馏水中；295克氢氧化钾溶于水；将二种溶液合并，调pH至，并用水稀释至2L；

（4）苯酚钠溶液：A液：苯酚溶于少量95%乙醇，加2毫升甲醇和毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升。B液.27克氢氧化钠溶于100毫升水中。将二溶液保存在