基因工程技术PPT-分子生物学课件.ppt

定义：
• 基因工程（gene engineering）
重组DNA技术（recombinant DNA technique）：是指在各种 酶的作用下，将细胞外的核酸片断（目的基因）在体外与病毒、细 菌或其它载体通过入工剪切、连接构成重组DNA分子，将其导入 受体细胞并使之无性繁殖（称之为“克隆”）和 表达，这种有目 的的应用分子克隆技术，人为地改造基因，改变生物遗传性状的系 列过程，总称为基因工程。
• 具有较小的分子量，较高的拷贝数， 是一个松弛型的质粒。
• 具有某种选择性标记以区别转化和
非转化细胞。大多是一些抗菌素抗
性基因，赋予受体细胞对某些抗生
素的抗性，为转化子选择提供便利。
（Ampr；Tetr）
是细菌染色体外能够自我复
• 具有若干限制性内切酶单一识别位
制的双链环状 DNA 分子。
点，便于外源基因插入。
TA 克隆
A A
TOPO-TA
表达载体：带有调控基因表达所必需的转录与翻译元件，如启
• 原核
动子等，这些调控元件应与宿主细胞相适应。
His-tag: pQE系列(Qiagen), pET22(Novagen)
GST-tag: pGEX系列(Pharmacia)
真核表达载体：大多是穿梭载体。
• 克隆载体(cloning vector)
用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低的分 子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。主要由细菌质粒或与其它 质粒、噬菌体及真核生物病毒的DNA重组构建（pBR322）。
• 表达载体(expression vector)
使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可将重组体DNA导入 适合的受体细胞，使所载荷的目的基因能够复制、转录和翻译 （pcDNA3）。
基因工程技术
The Nobel Prize in Chemistry 1980
Jackson, Symons, and Berg (1972) – generated first recombinant DNA molecules
Cohen and Boyer (1973) – produced first plasmid vector capable of being replicated within a bacterial host
克隆载体: pBR322
特点： • 分子量小，4.3kb，便于操作。 • 有两个抗性基因，便于转化子筛选。 • 有几个常用的限制性内切酶的单一位点，分布在抗性基因上，7种位于
四环素选择标记上，4种位于Amp抗性基因上。外源基因的插入将破坏 抗性基因的完整性，导致抗性基因插入失活，这种特性可用于区分重组 和非重组分子。 • 松弛性质粒，在大肠杆菌细胞内有较高的拷贝数，当细菌蛋白质合成停 止时，它仍能继续复制。
Eco RⅠ
Eco RⅠ
Eco RⅠ
连接策略：
连接浓度：
• 片段与载体连接机率＞自身环化
• 一般计算公式： 粘性末端：
载体片段含量（ng）/载体长度（kb）
1
﹦
DNA片段含量（ng）/ DNA片段长度（kb） 3-5
pcDNA 3系列 (Invitrogen)，
pFLAG-CMV系列(Sigma)
DNA分子的体外连接：方法
粘性末端：相同的粘性末端互相配对进行连接
两种情况：
（a）目的基因和载体用同一种限制酶切割后连接。载体 易自身环化。 用碱性磷酸酶(能除掉DNA两端的5’ 磷酸基团）处 理载体，可防止载体自身环化。
（b）目的基因和载体用两种产生粘末端的限制酶 切割后连接，可控制目的基因的插入方向(定向克隆)。
碱性磷酸酶处理：
平头末端：
（1）增加连接酶的量 （连接酶对平末端DNA的Km 约高于粘性末端DNA100倍 ）
（2）在末端加上一个人工接头，内含有一定的限制性内 切酶位点，经酶切处理产生粘性末端，然后与载体 连接。如加上一个人工接头内含GAATTC序列，用 EcoRI酶切，产生EcoRI 粘性末端。
穿梭载体(shuttIe vector)
能在两种不同的生物体内复制和往来穿梭的载体。 其可同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的 复制原点或酵母菌的自主复制序列（ARS），它即能在 原核细胞中扩增又能在真核细胞中复制和表达。主要用 于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移。
质粒载体
• 具有复制起始点，这是质粒自我增 殖的必要条件。
应用：
• 克隆感兴趣基因进行序列分析，研究其组织结构。 • 转入原核表达载体，进行大规模蛋白质合成，生产多
肽产品。 • 转入真核表达载体，导入细胞，研究其功能，表达调
控机制等
基因工程基本步骤：
分、切
目的基因 + 载体分子
接
构成重组DNA分子
转
筛选含有重组分子的克隆
鉴
片断的回收与纯化
载体：
• 载体(Vector)是目的基因的运载工具，其作用是将目 的基因带入受体细胞中，并使目的基因扩增和表达。
• 种类： 按来源分： 质粒载体(plasmid vector)、噬菌体载体(phage vector)、 柯氏质粒载体(cosmid vector)、病毒载体(virus vector ). 按作用分： 克隆载体(cloning vector )、表达载体(expression vector)、 穿梭载体(shuttle vector)
鉴定重组分子片段
基因工程流程示意图
构建重组分子（连接）
• 原料： 目的基因：研究对象 载体：目的基因的运载工具 工具酶：连接酶、限制性内切酶
目的基因片段来源：
• 基因组DNA（非编码序列） • PCR 方法扩增特定的目的基因片段（已知基因序列，
已有其它克隆构建或从商品化的cDNA扩增） • 通过RT-PCR 方法得到目的基因cDNA • 人工合成基因片段（价钱昂贵）
目的基因来源选择：
• 取决于解决什么问题？ 基因功能研究
cDNA RT-PCR
基因表达调控的研究
基因组DNA PCR
PCR：
• 引入合适的酶切位点，一个/两个。 • 加保护碱基，1-3个。 • 加上想要的标签，如 Flag, Myc, His, HA。 • 启始及终止密码子。
高保真聚合酶：HF，Pfu，Probest 等。