遗传实验报告微核检测

环境中诱变物质的微核检测

摘要：微核是间期细胞的细胞质中一个或多个圆形或杏仁状结构，是染色体发生畸变的另一种表现形式，微核发生率用来反映诱变物质对生物的遗传危害程度。本实验以大蒜根尖作为实验材料，分别以清水和一定梯度的叠氮化钠溶液作为阴性对照和阳性对照，用一定梯度的咖啡溶液和电池浸出液对实验组大蒜根尖进行诱变。最后卡诺固定液进行固定、用改良苯酚品红染色、压片后观察统计各组的微核千分率，从而了解微核检测的方法和意义以及通过检测评价环境中常见物质的诱变情况。

1.引言

微核是间期细胞的细胞质中一个或多个圆形或杏仁状结构，是有丝分裂后期丧失着丝粒的落后的染色体片段形成。微核是染色体畸变的一种表现方式。许多能引起染色体断裂的理化因素，如辐射、化学诱变剂等，均可作用于分裂细胞而产生微核。目前研究表明，微核发生率同作用因子的剂量呈正相关，微核发生率来反映诱变物质对生物的遗传危害程度。

微核试验是一种建立在细胞水平上分析DNA损伤的技术。该技术以其经济、简便、快速、敏感、特异、准确等特点，成为检测致突变剂和环境污染物等经典的短期试验方法。目前许多国家和国际组织将其规定为新药、食品添加剂、农药、化妆品等毒理性安全性评价的必做试验并用于染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面。

本试验采用大蒜作为试验材料，具有许多优点：①用鳞茎进行无性增殖，避免了有性生殖过程中的遗传性变异，具有遗传背景稳定的优势；②分布广、材料易得，不受地区和季节的限制；③培养方便，操作简单，蒜瓣去皮后将基部浸入净水中即可萌生新根，无需其他条件，且蒜瓣体积较小，萌生新根的数目较多；④价格低廉，对诱变剂敏感，是一种理想的试验材料。

近年来，由于大量新的化合物的合成，原子能的应用，各种各样工业废物的排出，日常生活中人类接触到的有潜在遗传毒性的物质越来越多，其中一个较为突出的就是废旧电池的污染。废旧电池中的化学物质不断渗透在环境中，其污染将持续若干年，直接或间接的影响人们的身体健康，造成很大的危害。

咖啡的主要成分为咖啡因。德国生态学《okeo-test》的研究人员发现，他们所检测的所有24种品牌的研磨咖啡和7个品牌的浓咖啡中都含有致癌物质——丙烯酰胺。检测结果发现，丙烯酰胺也存在于煮熟的咖啡中。绝大多数研究均表明咖啡与膀胱癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌等癌症有一定的关系。

为了研究电池浸出液和电池咖啡是否真正具有诱变致癌作用，本次实验通过用咖啡和电池浸出液进行大蒜诱变培养，在阴性和阳性对照设计下，计算其微核率，通过微核检测技术评价咖啡和电池浸出液的诱变情况。

2. 实验材料与方法

2.1 实验材料

材料：大蒜

器材:培养皿、单面刀片、双面刀片、Eppendorf管、油性记号笔、显微镜、载玻片、盖玻片、镊子；

试剂：冰醋酸、无水乙醇、1M HCl溶液、100mmol/L NaN3溶液、电池内部粉末、雀巢速溶

咖啡粉末，改良苯酚品红。

2.2 实验方法

2.2.1 取材

选取生长良好、大小相对一致的大蒜，剥成一瓣瓣后置于放清水的培养皿中。于24 ℃水中浸泡24-36 h,选择根长整齐一致，不定根长约0.5－1cm左右的大蒜随机分组。

2.2.2 处理各实验组

将实验材料分为六组，放入8ml不同成分的培养液中，其中1组为阴性对照组，培养液为清水；2、3组为阳性对照组，培养液分别为25mmol/L、50mmol/L NaN3溶液；5——8组培养液分别为0.50g/ml浓度的咖啡和0.25 g/ml浓度的咖啡以及分别添加2.5g和5.0g的电池内部粉末。将培养皿中置于20摄氏度左右室温下培养24h。

表1 实验组浓度梯度的设定

也可以设定时间梯度，检测微核的形成情况。实验组如下

(实验组采用的诱变剂是NaN3，既是实验组，又是阳性对照组)

表2 实验组时间梯度的设定

2.3.4 固定

卡诺固定液中固定24小时，如不立即检测可移至70%乙醇中4℃下保存。

2.3.5 制片

①根尖用1MHCl处理的10min,水洗3次。

②切取近根尖分生区的伸长区组织，用改良苯酚品红染色10 min。

③压片：加上盖玻片后，用铅笔轻敲使细胞分散，最后垂直压下去。

2.3.6 镜检

每个根尖计数1000个细胞，统计含微核的细胞数，然后取平均值，即为该处理的微核千分率。

2.3结果

2.3.1 实验结果图

图1 含微核的细胞（10*40）图2 含微核的细胞（10*40）

图3 1组（10*40）图4 2组（10*40）

图5 3组（10*40）图6 4组（10*40）

图7 5组（10*40） 图8 6组、7组（10*40）

2.3.2 实验结果分析与统计

图1、2中可以看到含有微核的细胞，这些细胞都有以下特征：（1）在主核大小的1/3以下，并与主核分离的小核。（2）小核着色与主核相当或稍浅。（3）小核形态为圆形、椭圆形或不规则型。

图3-8分别为1-6组的其中一个视野结果图。其中，图3中为清水组，没有微核的出现，但是由于加入的染液太多，使得背景呈现紫红色。图4——7视野中均有微核的出现：图4的视野中的某些细胞由于敲片力度过大导致细胞破裂；图5为50mmol/l 的NaN 3溶液，可看到溶液中几乎全是微核，说明NaN 3诱导微核的能力很强。图5与图6进行对照，可看到咖啡的确具有一定的致癌作用，并且浓度越高，致癌作用越强烈。

图8为加入电池内部粉末的实验组，从图中可以看出，没有存活细胞，细胞均死亡，只留下细胞壁。说明我们加入的电池粉末浓度太高，已将细胞全部杀死，不能检测微核的千分率。

数据分析如下：

表3 实验数据分析

根据数据我们发现，咖啡存在一定的致癌率，但致癌作用要弱于NaN 3。随着咖啡浓度的升高，微核率也相应增多。由于实验设计存在一些问题，根尖的数量相对较少，实验组的浓度梯度设计的不够多，所以仅根据本次实验无法得出微核率最大的咖啡浓度，只能进行定性分析。

而电池浸出液对照组，因为我们加入的电池粉末太多，导致电池浸出液浓度太高，极大