区分松材线虫和拟松材线虫的生化及分子鉴别方法

根据上述形态观察和测量,初步鉴定为
草莓滑刃线虫,并经浙江大学郑经武教授复核确认。

3　讨论
草莓滑刃线虫是一种叶和芽寄生线虫,可引起草莓春矮病(Spring Dwarf Disease ),还可侵染蕨类、百合科等47个科250多种植物。

该线虫危害草莓时,在草莓芽和叶片表面取食,造成植株发育不良,叶片发红或叶片卷曲皱缩,芽和花畸形,影响产量。

危害百合引起百合黑死病,线虫侵染导致叶片从茎基部自下而上枯死。

幼嫩梢被侵染时,线虫在生长点取食,使新梢矮缩、扭曲,不能开花。

滑刃属线虫主要特征如下:体长014～112mm ,头部通常略缢缩,口针长度10～12
μm ;食道前体部圆柱形,中食道球及中食道球瓣发达,后食道腺叶发达、覆盖肠的背面;雌虫阴门位于虫体的60%～75%;后阴子宫囊通常存在并含有精子;尾圆锥形,尾端
及尾尖突形态多样。

雄虫尾圆锥形,向腹面弯成钩状;交合刺玫瑰刺形,基顶及基喙通常发达;无交合伞。

Shahina 提出,按尾尖突形状及有无将滑刃属线虫分为4组:11尾简单,无尾尖突;21尾具1～2个尾尖突;31尾尖突四叉或星形;41尾尖突为其他形状。

草莓滑刃线虫被分在第2组,具有1个尾尖突。

而其他文献一般称草莓滑刃线虫尾为钝穗状或钝钉状,无任何附属物。

此次观察到的草莓滑刃线虫雌虫和雄虫均有一尾尖突。

致谢　承蒙浙江大学郑经武教授复核鉴定草莓滑刃线虫标本并提供资料,特此感谢!参考文献
1　谢辉编著1植物线虫分类学1合肥:安徽科学技术出版
社,2000
2　刘维志主编1植物病原线虫学1北京中国农业出版社,
2000
3　Shaniha F 1A Diagnostic C ompendium of The G enus A phelen 2
choides Fischer ,1894W ith S ome New Records of The group
From Pakistan 1Pak 1J 1Nematol ,1996,14(1):1～32
区分松材线虫和拟松材线虫的
生化及分子鉴别方法
Ξ
蒋立琴　郑经武ΞΞ
(浙江大学农业与生物技术学院植物保护系,杭州310029)
摘要　本文从蛋白质、激素、脂类及核酸等不同的角度,概述了松材线虫和拟松材线虫的
一些生化和分子鉴别方法及其优缺点。

其中以DNA 为基础的分子诊断技术(如对rDNA 中ITS 区的PCR -RFL P 等)系目前较稳定可靠的鉴别方法;而以蛋白质为基础的单克隆抗体技术对于正确、快速地鉴别两种线虫也有极大的潜力。

关键词　松材线虫　拟松材线虫　诊断方法
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78—ΞΞ联系作者
收稿日期:2002-09-13
浙江省自然科学基金项目(300267)和浙江省科技厅项目(2002C34003)资助
松材线虫[B ursaphlenchus xylophil us
(Steiner &Buhrer ,1934)Nickle ,1970]是特大林业病害———松树萎蔫病的病原物。

我国外来的松材线虫主要是来自进口木质包装材料。

目前,我国出入境检验检疫部门多次截获到该线虫,但与松材线虫相似的拟松材线虫(B.m ucronat us )也常被检测到,而拟松材线虫对松科植物的致病力非常弱甚至近乎不致病,又常常在一些其它原因致死的松树中分离到,因此从检疫的角度,能否正确区分两种线虫就非常重要。

在日本,Mamiya 等早在1979年就提出了采用尾部的尾尖突来区分这两种线虫[1],这也是目前两种线虫鉴别中的主要形态学依据。

由于北美的松材线虫有些群体中的雌虫尾部也有尾尖突,因此从形态上要将两者正确区分开来对一些非专业从事植物线虫分类的人员是非常困难的。

除了形态学鉴定外,近十多年来发展起来的许多技术和方法对正确区分松材线虫和拟松材线虫提供了一些重要的途径。

本文概述了相关的一些研究进展。

1　蛋白质111　酶学
胡凯基等(1994)[2]对松材线虫与拟松材线虫的不同株系进行多种酶电泳的研究发现,谷氨酸草酰乙酸转氨酶是唯一可区分两种线虫的酶。

该酶具有种内均一性和种间特异性,有相当的稳定性,可用于初步确定松材线虫和拟松材线虫的生化鉴定。

K ojima 等(1994)[3]对松材线虫的分泌物进行了电泳分析,结果表明:松材线虫分泌的纤维素酶的谱带类型与拟松材线虫的纤维素酶的不同,而且松材线虫分泌的纤维素酶还具有分解结晶纤维素的能力。

蒋丽雅等(1994)[4]通过对松材线虫虫体提取液和分泌液中的致病物纤维素酶的生化检测,确定了纤维素酶扩散法为其简单而灵敏的检测方法,结果显示出拟松材线虫虫体提取液和分泌液中几乎没有纤维素酶,而松材线虫则有。

故用此法对纤维素酶的测定也可将两者区分开来。

这与K ojima 的结果似乎有点不同,这可能与他们所采用的方法有关。

Noel G.R.(1998)[5]利用酯酶同工酶正确区分了大豆孢囊线虫不同分离物。

Evans (1971)[6]用酯酶也正确区分了两类密切相关的茎线虫———甘薯腐烂线虫(Ditylenchus dest ructor )和蘑菇茎线虫(D.m ycelioph 2
ague )。

这方面最成功的要属酯酶在4种常
见的根结线虫———南方根结线虫(Meloi dog 2yne i ncognita ),北方根结线虫(M.hapla ),爪哇根结线虫(M.javanica )和花生根结线虫(M.arenaria )的种甚至小种的鉴定和鉴别上,目前在鉴定和鉴别上述4种常见根结线虫的种和小种时,还常常应用该方法[7]。

De Guiran 等(1985)[8]用来自日本的松材线虫及拟松材线虫各一株系和来自法国的线虫作聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析,结果发现3个线虫株系有简单的同功酶和苹果酸脱氢酶谱,并可以之相互区别。

但胡凯基等[2]对松材线虫与拟松材线虫的酯酶进行分析的结果表明:酯酶的稳定性并不好,同一株系在不同菌上培养后也有变化。

这可能与酶本身易受外界环境条件如培养线虫的条件(湿度和温度等)、提取过程及提取物的贮藏条件、分析方法及线虫本身即线虫的各发育阶段或在某一阶段线虫的生理状况的影响有关。

因此,酶虽然在密切相关的种类间保持着高度保守性,但由于上述因素,利用电泳分析线虫蛋白易导致结果的不稳定性。

因而采用该方法进行种类鉴定尽量用线虫相同的发育阶段,以便减少误差。

112　血清学方法
利用血清学技术和方法进行种类鉴定,其所需蛋白量少,测定结果也不会受到线虫的生理状态如卵的滞育的影响,而且能在短时间内快速完成。

该技术在根结线虫和孢囊
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类线虫方面探索较早、应用也较多、技术也相应比较成熟,这与易从这两类线虫中分离各个发育阶段的线虫有关。

在松材线虫及近似种的鉴别上也有报道。

11211　多克隆抗体技术
Lawler C.等(1993)[9]研究结果表明:松材线虫与拟松材线虫的多克隆抗体可用Western杂交将两者区分开来,用酶联免疫吸附法EL ISA却不易将两者区分开,这说明虽然EL ISA的敏感度高,但种间区分度并不好,这跟多克隆抗体的特异性差有关。

但免疫后获得的多克隆抗体的带型表明:日本和美国的松材线虫分离物与加拿大分离物比起来其亲缘关系更近。

11212　单克隆抗体技术
与多克隆抗体相比,单克隆抗体的特异性与敏感性均较好,而且不易发生交叉反应。

应用单克隆抗体技术在一些重要的植物寄生线虫的鉴定中已有成功先例,如Arjen Schots 等[10]应用单克隆抗体技术区分出马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)和马铃薯白线虫(G.palli da),其他如大豆孢囊线虫(Het2 erodera glyci nes)和南方根结线虫(M.i ncog2 nita)也有过单克隆抗体技术的应用。

作为一种快速、准确且灵敏的检测方法,应用单克隆抗体技术在松材线虫与拟松材线虫种的鉴别上有非常大的发展前景,目前我们所在的实验室正在进行此方面的研究。

2　激素
Riga(1992)[11]研究表明,松材线虫与拟松材线虫产生的性外激素具有种特异性,即松材线虫或拟松材线虫只有各自的雌虫才能吸引各自相应的雄虫,这是各自雌虫释放性外激素引起的反应。

因此可利用测定性外激素来区分两者。

另外,可针对其性外激素作进一步的分析,比如成分、性状,是否借此可对两者进行区分有待于进一步的研究。

3　脂类
Krusberg等(1973)[12]报道南方根结线虫和花生根结线虫的成熟雌虫和卵的脂肪酸性质相同,但是两种线虫中某种脂肪酸的含量不同,因此可以以此来区分两种线虫。

目前尚未见有用脂类来区分松材线虫与拟松材线虫的报道,在这方面是否可行,也可进行一番尝试。

4　核酸
随着近几年分子生物学技术的迅猛发展,以DNA为基础的诊断,在线虫分类鉴定中的作用也与日俱增,在许多植物线虫类群中已建立了较成熟的分子诊断系统[13]。

早期研究曾有通过制备特异性DNA探针及杂交技术来区分松材线虫与拟松材线虫的;另外利用DNA指纹技术,像RFL P(限制性内切酶片断长度多态性,就是利用靶DNA经限制性内切酶的酶切片段的数量差异及不同迁移率来区分线虫[14],但是这些早期的研究是以线虫基因组DNA为靶DNA,故利用限制性酶切和DNA探针杂交的方法需要较大量的线虫样品,操作复杂,而且可能要接触同位素,一定程度上限制了其应用。

RAPD技术是在PCR基础上演化而来的,也可用来鉴定两种线虫[15],但由于所用为单一引物,序列短,稳定性不好,近年来也较少被采用。

目前广泛采用的是PCR—RFL P对rDNA中ITS区的测定与分析[16];张立海等[17]尝试了用PCR—SSCP(单链构象多态性)技术对rDNA进行分析,实验结果表明,由于松材线虫与拟松材线虫在rDNA中的ITS1区存在着碱基差异性———30～40bp,而PCR—SSCP 检测DNA的碱基为400bp左右,因此这种差异可大幅度改变单链DNA的构象及迁移率,从而使之被检出,将两种线虫区分开来;此外,根据松材线虫和拟松材线虫两种间一些特异性的DNA序列,设计特异性的引物来进行特异性的扩增也可以达到鉴别两种线虫的目的[18]。

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综上所述,应用各种生化技术和各种分
子生物学技术有助于松材线虫与拟松材线虫的鉴别。

利用生化技术为依据的鉴定方法时,要注意采用的样品具相对稳定性,对环境影响不敏感,而且与其它特征建立的分类系统相关。

在这些生化技术和分子鉴别方法中,尤其是以蛋白质为基础的单克隆抗体技术及以DNA 为基础的PCR 技术对两种线虫的鉴定和鉴别更是有着广泛的前途。

同时挖掘其他的一些新的分析方法,将各种方法和手段综合起来进行考虑,对松材线虫———这一国际的植物检疫对象的快速、准确的鉴定有着极为重要的意义。

参考文献
1　Mamiya Y ,Enda N.B ursaphelenchus m ucronat us n.sp.
(Nematoda :Aphelenchoididae )from pine wood and its bi 2ology and pathogenicity to pine trees.Nematologica ,1979,25:353～361
2　杨宝君等合编.中国松树线虫病的流行与治理.北京:中
国林业出版社,1995.55～58
3　K ojima K ,Kamijyo A ,Masumori M ,et al.Cellulase activi 2ties of pine -wood nematode isolates with different viru 2lences.J Jpn For Soc ,1994,76:258～262
4　杨宝君等合编.中国松树线虫病的流行与治理.北京:中
国林业出版社,1995.60～61
5　Noel G R ,Liu Z L.Esterase Allozymes of Soybean cyst
Nematode ,Heterodera glyci nes ,from China ,Japan ,and the United States.Journal of nematology ,1998,30(4):468～476
6　Evans A A F.Taxonomic value of gel electrophoresis of
proteins from mycophagous and plant parasitic nematodes.
Int.J.Biochem ,1971,2:72～79
7　Sasser J N ,Carter.An Advanced Treatise on Meloidogyne
volumel :Biology and Control North Carolina.North Car 2olina State University Graphics ,1985,135～140
8　De G uiran G et al.Preliminary attempts to differentiate
pinewood nematode (Bursaphelenchus xylophilus )by enzyme electrophoresis.Revue de Nematoloie ,1985,8:88～899　Lawler C ,Joyce P ,Harmey M A et al.Immunological dif 2ferentiation between B ursaphelenchus xylophil us and B.
m ucronat us .Nematologica ,1993,39:536～546
10　Schots A ,G ommers F J ,Bakker J et al.Serological differ 2
entiation of plant -parasitic Nematode species with poly 2clonal and monoclonal Antibodies.Journal of Nematology ,1990,22(1):16～23
11　Riga E ,Webster J e of sex pheromones in the taxo 2
nomic differentiation of B ursaphelenchus spp.(Nemato 2da )pathogens of pine trees.Nematologica ,1992,38:133
～145
12　Krusberg L R ,Hussey R S ,Fletcher C L.Lipid and fat 2
ty acid composition of females and eggs of Meloi dogyne
i ncognita and p.biochem.physiol.
1973,45B :335～341
13　郑经武,李德葆.植物线虫分子分类及鉴定研究新进
展.植物病理学报,1998,28(1):1～4
14　Bolla R I ,Weaver C.G enomic differences among patho 2
types of B ursaphelenchus xylophil us.J Nematol.1988,20:309～316
15　郑经武,许建平,吴玉良等.松材线虫和拟松材线虫种
间及种下群体的RAPD 指纹分析1浙江农业大学学报,1998,24(6):597～601
16　Iwahori H ,Tsuda K ,Karzaki N ,et al.PCR -RFL P and
sequencing analysis of ribosomal DNA of B ursaphe 2
lenchus nematodes related to Pine Wilt Disease.Fundam.
appl.Nematol ,1998,21(6):655～666
17　张立海,廖金铃,冯志新.松材线虫rDNA 的测序和
PCR -SSCP 分析.植物病理学报,2001,31(1):84～8918　许建平,郑经武,王建伟等.松材线虫的PCR 快速诊断
研究.浙江农业大学学报,1998,24(2):133～134
黄埔口岸截获黄纹曲虎天牛和青杨脊虎天牛
2001年5月,黄埔检验给疫局在检疫一批法国进口榉木板材时,截获到两种天牛成虫,鉴
定并经专家复核为青杨脊虎天牛Xylot rexchus rusticus Linnaeus 和黄纹曲虎天牛Cyrtoclyt us capra (G ermar )。

青杨脊虎天牛分布于伊朗、土耳其、俄罗斯、蒙古、朝鲜、日本和欧洲。

主要危害杨属、柳属、桦属、栎属、山毛榉属、椴属和榆属等林木。

黄纹曲虎天牛分布于西伯利亚、库页岛、朝鲜、日本、欧洲。

两种天牛在我国北方几省也有发生。

黄埔出入境检验检疫局　黄桂嫦　张卫东　宋婷婷　陈荣溢—
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