细胞周期调控蛋白MPF的研究

细胞周期调控蛋白MPF的研究
第三节细胞周期调控的分子机理一、MPF的生化本质、活性调节及其功能MPF(卵细胞促成熟因子，matuation-promotingfactor;细胞促分裂因子，mitosis-promoting
factor;M期促进因子，M-phase-promoting factor)。

Johnson和 Rao1970将Hela细胞同步于不同阶段，然后与M期细胞混合，在灭活仙台病毒介导下，诱导细胞融合，发现与M期细胞融合的间期细胞产生了形态各异的早熟凝集染色体prematurely condensedchromosome，PCC。

不同形态的PCCG1期PCC为单线状，因DNA未复制;S期PCC为粉末状，因DNA由多个部位开始复制;G2期PCC为双线染色体，说明DNA复制已完成。

人M期细胞与袋鼠 (Ptk)G1、S、G2 期细胞融合诱导 PCC:提示M期细胞存在诱导PCC的因子; 不仅同类M期细胞可以诱导PCC，不同类的M期细胞也可以诱导PCC产生，如人和蟾蜍的细胞融合时同样有这种效果，这就意味着M期细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因子，即成熟促进因子maturation promoting factor，MPF。

1971年， Masui和Markert用非洲爪蟾做实验，明确提出MPF的概念 ? ? ? 注射实验表明:孕酮诱导卵母细胞成熟;成熟卵细胞质中，含有
Sunkara将不同时期Hela细胞的提取液注射卵母细胞成熟的因子，称做
MPF1979年，
到蛙卵母细胞中，发现G1和S期的抽取物不能诱导GVBD，而G2和M期的则具有促进胚胞破裂的功能，它将这种诱导物质称为有丝分裂因子MF。

后来在CHO细胞，酵母和粘菌中也提取出相同性质的MF。

这类物质被统称为MPF。

在此后20年里，许多学者致力于MPF的提纯，试图揭示MPF的生化本质。

第二个研究领域是为了弄清楚细胞周期调节基因，遗传学家们利用裂殖酵母和芽殖酵母温度敏感突变
株，分离细胞增殖必需的基因(cdc genes cell division cyclegenes) 1960s L. Hartwell以芽殖酵母为实验材料，利用阻断在不同细胞周期阶段的温度敏感突变株(在适宜的温度下和野生型一样)，分离出了几十个与细胞分裂有关的基因cell division cycle gene，CDC，如芽殖酵母的cdc28基因，在G1/S或G2/M转换点发挥重要的功能。

Hartwell还通过研究酵母菌细胞对放射线的感受性，提出了checkpoint(细胞周期检验点)的概念，意指当DNA受到损伤时，细胞周期会停下来。

以P.Nurse为代表的另一批酵母生物学家研究不同温度下培养的裂殖酵母细胞，也分离出数十种温度敏感的突变体。

这些不同的突变体在限定温度下，会滞留在细胞周期的某个阶段。

这些与细胞分裂和周期调控有关的基因被称为cdccell divisioncycle基因，根据被发现的先后顺序被命名。

cdc2是第一个被分离出来的cdc基因，表达34kDa的蛋白，称p34cdc2。

进一步研究发现其具有激酶活性，可以使许多蛋白磷酸化，在裂殖酵母的周期调控中起重要作用。

芽殖酵母中的一个关键cdc基因是cdc28，是第二个被分离出来的cdc基因，编码34kDa的蛋白，具有激酶活性。

p34cdc28是 p34cdc2的同原物，调控细胞周期，特别是G2/M期转变。

但研究者很快发现， p34cdc28 或p34cdc2单独并不具有激酶活性，需要同相关蛋白结合后才具有活性(如p34cdc2和蛋白p56cdc13结合)。

第三个研究领域，以美国科学家T.Hunt为代表，以海胆为研究材料，发现了细胞周期的另一个重要调控者-------细胞周期蛋白(cyclin) 多年来在上述三个领域的研究，互相之间并没有联系，一直到1988年才突然打破这一局面。

1988年Lohka最终将非洲爪蟾卵的MPF纯化，发现MPF由32kD 和45kD两种蛋白质构成，其中32kD是Ser/Thr蛋白激酶。

问题:MPF和p34cdc2有何关系,J.Maller和P.Nurse实验室立即合作，很快证明爪蟾卵中的p32与p34cdc2是同原物。

与此同时，T.Hunt实验室等以海胆卵为材料研究细胞周期调控，发现一类与细胞分裂有关的蛋白，称为周期蛋cyclin。

然后J.Maller和T.Hunt实验室合作，发现周期蛋白B，证明与p45和
p56cdc13为同原物。

这样，沿着不同路线研究细胞周期调控的科学家的研究成果汇合到一点，奇异地发现他们所研究的实际上是共同的东西，MPF即P34cdc2和cyclin B. 这样一个概念逐渐明朗起来:从酵母到海洋无脊椎动物一直到人类的所有真核细胞中存在一个共同的生化分子机制来调节M期启动。

因而Nurse(1990)年提出了“M期启动调节的普遍机制”这一概念。

The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2001Prize citation: for
their discoveries of key regulators of the cell cycle Leland Hartwell Tim Hunt Paul Nurse
born 1939. born 1943. born 1949. Fred Hutchinson Imperial Cancer Imperial Cancer
Cancer Research Research Fund Research Fund Center Seattle Clare Hall Lincolns Inn
WA USA. Laboratories Fields London South Mimms UK. UK. 2001年的诺贝尔医学奖的获得者为一位美国科学家与两位英国科学家，他们在细胞研究领域取得了重大发现，这些发现有可能引导人们找到治疗癌症的新方法。

美联社的记者对此评论说，科学家们所做的工作将使人们对癌症有了进一步的了解。

二、MPF的活性调节1. 蛋白质的磷酸化与去磷酸化作用 ? 当p34cdc2与周期蛋白结合形成复合体后，wee1/mik1激酶和Cdk激酶催化P34cdc2第14位的苏氨酸Thr14、第15位的酪氨酸Tyr15和第161位的苏氨酸Thr161磷酸化——形成前体MPF，不表现活性;?P34cdc2在磷酸酶Cdc25c的催化下，其Thr14和Tyr15去磷酸化，才能表现出激酶活性。

? Thr161位点保持磷酸化状态是CDK1激酶活性表现所必需的;2 蛋白质的合成与降解 P34cdc2蛋白在细胞周期中的含量相对稳定(而周期蛋白B的含量则呈现周期性变化。

p34cdc2蛋白只有与周期蛋白B结合后才有可能表现出
激酶活性。

因而，P34cdc2激酶活性首先依赖于周期蛋白B含量的积累。

细胞周期运转到分裂中期后，M期周期蛋白A和B将迅速降解， P34cdc2激酶活性丧失。

周期蛋白A和B的降解是通过泛素化途径ubiquitina-tion pathway来实现的。

MPF的活性在催化亚基P34上，其活性受调节亚基Cyclin B的周期性合成与分解控制。

三、MPF的功能 MPF的M期可以磷酸化一系列底物，涉及染色质凝集、细胞核解体、细胞骨架崩解等很多方面。

现已了解的内容包括:1. MPF能够催化组蛋白H1磷酸化。

MPF可使组蛋白H1上与有丝分裂有关的特殊位点磷酸化，这些位点的磷酸化多发生在早、中期染色体凝集时期，可能与染色体凝集及有丝分裂的启动有关。

2. MPF可以催化核纤层蛋白(lamin)磷酸化，导致核纤层解体。

3. MPF能使necleolin核仁蛋白磷酸化，可能对于M期核仁分解以及染色体凝集有重要作用。

4. MPF能使一些原癌基因蛋白产物发生磷酸化，由此产生一系列深远的与细胞分裂有关的生物学效应。

如使c-myc 基因产物磷酸化，可能降低这些蛋白在M期与DNA的结合能力，利于染色体凝集。

此外，还能使P53、P105 RB等蛋白磷酸化，产生一系列有关的生理效应。

5. MPF作用于微管蛋白，控制着细胞周期中微管的动力学变化三、周期蛋白自1983年首次发现周期蛋白后，在不长的时间里有数十种周期蛋白被克隆和分离。

如酵母的
Cln1Cln2Clin3Clb1-Clb6，在脊椎动物的A1-2、B1-3 、C、 D1-3、E1-2、F、G、H等。

各类周期蛋白均含有一段约100个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白框，介导周期蛋白与CDK结合，不同的周期蛋白框识别不同的CDK组成不同的周期蛋白复合体，表现不同的CDK激酶活性。

M期周期蛋白分子的近N端含有一段9
个氨基酸组成的破坏框，参与泛素介导的周期蛋白A和B的降解。

G1期周期蛋白分子的C端含有一段特殊的PEST序列，可能与G1期周期蛋白的更新有关。