细菌的培养法

实验一细菌的培养法

一般细菌均可用人工方法进行培养，使其生长繁殖，以便进一步观察和研究它们的

各种生物学特性。为了获得良好的细菌培养物，在分离培养细菌时，除采用适宜的培养

基并考虑到其他的培养条件（如温度、湿度、酸碱度、气体等）之外，掌握各种分离培

养和接种的基本技术，也是重要环节。

在土壤、水、空气、以及人和动、植物体中，不同种类的细菌混杂地生活在一起。

若要研究其中某种细菌，就必须先将各种细菌进行分离，以得到只含有这一种细菌的纯

培养。分离培养细菌的方法有多种，平板划线法即是其中之一。该法主要是借划线而将

混杂的细菌在琼脂平板表面分散开，使单个细菌能固定在某一点，生长繁殖后形成单个

的细菌集团（即菌落）以达到分离纯种的目的。

当细菌分离成纯种后，常需要接种到有关的培养基中，以测试其各种生物学性状。

一般可用斜面、液体和半固体培养基来检验细菌的培养特征，因此接种方法可相应的分

为三种。

斜面培养基接种法常用于细菌的大量繁殖，保存菌种，或观察其某些生化特性。琼脂斜面、尿素培养基、双糖铁培养基、柠檬酸盐培养基等具有斜面外形的固体培养基

均可用此法接种。

液体培养基接种法可用于观察细菌不同的生长状况，有的呈均匀混浊，有的呈沉淀生长，还有的在液体表面形成菌膜；另外还可以供测定细菌生化特性之用。凡是肉汤、葡萄糖蛋白胨水以及各种单糖发酵管等液体培养基均用此法接种。

穿刺接种法常用于半固体琼脂培养基、醋酸铅培养基、双糖铁培养基等的接种，

前者用于测定细菌的动力，后二者则用于观察细菌的生化反应。

目的要求

1. 学习和掌握细菌分离和培养的各种基本技术。

2. 进一步熟悉和掌握微生物的无菌操作技术。

材料

1．菌种和培养基

平板划线接种法斜面培养基接种法液体培养基接种法穿刺接种法

菌种葡萄球菌和大肠杆菌大肠杆菌培养物大肠杆菌培养物变形杆菌培养物的混合菌液枯草杆菌培养物痢疾杆菌培养物培养基* 普通琼脂平板琼脂斜面培养基普通肉汤培养基半固体琼脂培养基*各培养基的组成及配置方法参见书后附录。

2．接种环、接种针、酒精灯、记号笔、试管架等

方法

1. 平板划线接种法

（1 ）标记在培养皿底玻璃上，用记号笔注明接种的菌名、接种者姓名、班级、日期

等。

（2 ）灭菌接种环点燃酒精灯，右手以持笔式握持接种环并放置火焰中烧灼灭菌，如

图1-1 ，先将接种环的接种丝部分置于火焰中，待金属丝烧红并蔓延至金属环端，再直接烧灼金属环直至烧红，然后由金属环至金属杆方向快速通过火焰，随后再反方向通过火

焰，如此2～3 次。

图1-1 接种环的灭菌操作

然后将接种环移开火焰，待其冷却。注意，接种环不能距离火焰过远，一般应在距

火焰10cm 范围之内（视此范围为无菌环境）；灭菌后的接种环不能再碰及他物。

（3 ）取菌种

左手持装有葡萄球菌和大肠杆菌混合菌液的试管，用持有接种环的右手手掌及小指

拔取试管棉塞，将试管管口迅速通过火焰2～3 次进行灭菌。

将已灭菌且已冷却的接种环伸入菌种管中，取一接种环的混合菌液，然后退出菌种

管。将菌种管管口再次通过火焰 2 ～3 次灭菌，塞好棉塞，放至原来的位置。

（4 ）分离划线接种细菌（见图3-1）

左手持琼脂平板培养基（将皿盖反放在桌上酒精灯附近），尽量使之直立以免空气中

的细菌落入其中，并靠近火焰。右手持接种环在琼脂平板上端来回划线，涂成一细菌薄

膜（约占平板面的1/10 ），视为一区。划线时使接种环与平板面成30～40 度角，以腕力在平板表面行轻而快地来回滑动动作。切记，接种环不应嵌进培养基内，避免将琼脂表

面戳破。

旋转琼脂平板90 度。烧灼接种环，以杀灭环上的残留细菌，将接种环触及培养基表

面以使其冷却。灭菌接种环通过薄膜处作连续平行划线（约占平板1/5 ），此为二区。注意接种环只通过薄膜 1 ～2 次，以获取薄膜处少量的细菌。

旋转琼脂平板90 度。烧灼接种环灭菌并使之冷却。将灭菌接种环接二区连续平行划

线（约占平板1/4 ），此为三区。接种环只通过二区 1 ～2 次以获得少量细菌。

旋转琼脂平板90 度。接种环不必再灭菌，接三区连续平行划线，划满平板其余部分，此为四区。

注意各区接种线间尽量互不交接，以达到细菌逐渐稀释的目的。

（5 ）划线完毕，将琼脂平板放进皿盖，将培养皿倒放（这样可避免培养过程中凝结水

自皿盖滴下，冲散菌落），送进37 ℃温箱培养。

（6 ）培养18 ～24 小时后将培养皿取出。观察琼脂平板表面生长的各种菌落，注意其

大小、形状、边缘、表面结构、透明度、颜色等性状。

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图1-2 四区划线接种法

2. 斜面培养基接种法

（1 ）用记号笔在待接种的培养管上写明标记。

（2 ）点燃酒精灯。

（3 ）左手拇指、食指、中指及无名指分别握持菌种与待接种的培养基管，使菌种管位

于左侧，斜面部均应向上，勿成水平，以免凝结水浸润培养基表面，甚至沾湿棉塞。

（4 ）以右手拇指和食指捏持转动两管棉塞，以便在接种时易于拔取。

（5 ）右手持接种环，在火焰上烧灼灭菌。

（6 ）以右手手掌及小指，小指及无名指分别拔取并夹持两管棉塞，将两管管口灭菌。

（7 ）将已灭菌且已冷却的接种环伸入菌种管内，从斜面上轻轻挑取少量菌苔退出菌种管（注意，一要防止取菌过多；二要防止弄破培养基表面）。再伸进待接种的培养基管，如图3-2 进行斜面培养基接种，从斜面底部轻轻向顶端弯曲划线，不要触破培养基表面。

沾有细菌的接种环进出试管时不应触及到试管内壁和试管口。

（8 ）接种完毕，灭菌两试管的管口，塞好棉塞，并放至原来的位置上。重新烧灼接种

环，灭菌后放回试管架上。接种好的试管放37℃温箱培养，18 ～24 小时后观察生长情况。