PCR在动物寄生虫病定性和定量诊断上的应用

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PCR 在动物寄生虫病定性和定量诊断上的应用

陈锡慰　章子豪

摘要　PCR 对于寄生虫系统发生学、流行病学、免疫学、宿主-寄生虫相互作用、重组DNA 疫苗研制

和最近通过DNA 直接测序、表达序列标签(EST s )或通过迅速发展的功能蛋白组学的全基因组分析领域获得的进展均具有重要影响。本文重点介绍PCR 在寄生虫检测和鉴定以及在疾病诊断中的应用。特别注重于多重PCR 、实时荧光PCR 和PCR 定量技术。

关键词　寄生虫;PCR ;定量

作者单位:210029南京,南京医科大学病原生物学教研室

分子学方法不仅提高检测的敏感性和特异性,而且可减少在形态学和生物学资料解释中的内在主观性。除极少数情况外,如在有些寄生线虫的首次少数体细胞分化中观察到的染色质减少,寄生虫生活史各发育阶段DNA 的含量和完整性基本上是不变的,且不受制于可以改变转录和转录后事件的短期环境压力因素。因此,目标为寄生虫基因组的分子鉴定方法一般不受任何特别的发育期限制。PCR 技术,如限制性片段长度多态性(PCR -RFLP )和随机扩增多态性DNA (RAPD )已被广泛用于识别和鉴定寄生虫,当前人们已认识到单链构象多态性(SSCP )、多重PCR 和实时荧光PCR 的优越性。

长期以来,种或属特异序列的酶扩增已用于单一寄生虫识别,目前该方法已可用于研制同时识别一种以上寄生虫的PCR 试验,数种特异性引物结合至单次PC R 试验,即多重PCR 。这一试验实际上可简单地分析混合的寄生虫种群。

此外,PCR 与片段分析相结合的、敏感的实时荧光PCR 技术正被用于识别寄生虫和诊断寄生虫病以及测定生物标本中寄生虫的水平。1　基于PCR 的寄生虫鉴定的传统方法

cDNA 介导的核糖体RNA (rRNA )具有明显的优点,因为在正常情况下一个典型细胞内90%～95%的RNA 是rRNA ,RNA 量较DNA 高出50多倍。随着热稳定性RNA 依赖的DNA 多聚酶的发现,采用rRNA 已成为进一步增加敏感性的一种可行方法。

Welsh 等和Williams 等在缺少特异序列信息情况下制备遗传和诊断标志物。该方法利用单一随机

设计的PCR 引物,通常为10～12bp ,GC 大于50%,首先针对基因组内的富含序列,且通常产生一群可以鉴别特异有机体的扩增产物RAPD 。此方法已成功用于鉴定克氏肉孢子虫DNA 的引物,研究中未见与其他密切相关的球虫或宿主DNA 产生交叉反应,获准将它们作为克氏肉孢子虫的杂交探针用于单一扩增产物。Shianna 等研制RAPD 引物以评价取自不同地理区域的微小隐孢子虫的遗传学变异。Wu 等在一改良RAPD 技术中,从他们生产的特异且更为敏感的鉴别隐孢子虫种的引物中克隆了公认的种特异性RAPD 片段。他们采用相同方法来鉴定犬蛔虫和旋毛虫的种和基因型。Tsuji 等采用略有变更的RAPD 技术鉴定鸡艾美虫种(chicken Eimeria species ),并应用一组特异且高度保守的引物从每一种中首次扩增小亚单位DNA (ssrDNA )。首次PCR 循环后,用10个不同的RAPD 引物进行巢式PCR ,最终辨别艾美虫种。但是采用这一技术时,种间序列变异水平必须相对较高。

RAPD 技术的可靠性明显受到靶DNA 完整性的影响,此时部分降解的DNA 明显偏向于扩增较小的片段。因此,利用RAPD 技术作为一般诊断方法时,必须设有广泛对照组。因为引物可以与RAPD 技术所需较低退火温度的任何DNA 发生结合,所以,组织或血液内的寄生虫病诊断常需要一个预选步骤。重要的是理解RAPD 的作用是竞争性PCR 的一种形式,并因此易于发生PCR 片段对反应物成分竞争而导致信号赝像和在扩增程序的早期循环期间易于发生无效引物结合。因此,已出现的其他技术如扩增片段长度多态性(amplified frag -ment leng th polymorphism ,AFLP ),包括限制酶消化DNA 后添加特异引物结合位点至末端,使之采用更严格的PCR 条件。该技术在基因组序列的细微制图和在寄生虫遗传学方面更有价值,类似于已采用

的微卫星、调变相关标志物和表达序列标签(ESTs)方法。

2　常规PCR的替代方法

2.1　多重PC R

针对每一属单一高度特异的PCR引物对,当用于扩增不明DNA时,产生每一虫种独特的PCR带型。这一独特带型由它们各自的rDNA重复代表区内序列长度差异和存在多数rDNA重复单元的结合所致。因而,可以将PCR信号缺乏理解为是一避免广泛阳性对照要求的一种不合格的反应。但是,这里提及的是单一虫体水平的最佳利用试验,因为当采用凝胶分析时,部分重叠PCR片段将不允许鉴定混合种群的DNA。Bowles和M cM anus用微卫星DNA序列的PC R-RFLP完成了对带属绦虫(Tae-nia)的检测。

多重PCR包括通过混合具有不同特异性的多个引物对,每次反应同时扩增一个以上的靶基因。对所有被鉴定的寄生虫产生PCR产物的一个交叉引物对,可能包括在这特异性诊断引物组内,并以此方法创建一个对完整反应的内部对照。采用线粒体DNA微卫星重复序列作为特异引物靶和与螺ssrDNA互补的第二引物对作为内部参照,较简化地完成了螺体内曼氏血吸虫的检测。存在吸虫DNA 时,ssrDNA引物也产生不同大小的片段并协助自其它吸虫感染的螺中鉴定曼氏血吸虫。

已设计大规模多重PCR鉴定所有最近识别的8个旋毛形线虫属(Trichinella)虫种和基因型。这项研究制备了抗大亚单位rDNA(IsrDNA)伸展片段V序列的一对引物,在所有的、其中数个是大小独特的旋毛形线虫属基因型产生PCR产物中,发挥诊断试剂及内部对照功能。

一些情况下,在多重PCR显示形态上无法区别的常见牛胃肠道线虫卵时,充分的以往证据可以避免广泛的内部对照。该试验中将用rDNA重复片段的内、外转录空间及ssrDNA3′端和IsrDNA的序列资料用于制备5个引物组。每一引物组产生单一DNA片段,其特征为独特的带型:Ostertagia os-tertagi(257bp)、H.plac ei(176bp)、辐射结节线虫(329bp)、蛇形毛圆线虫(243bp)和肿孔古柏线虫(151bp)。这种检测可能比依靠培养资料更能代表感染动物的传播能力,且最终可以取代较费力的、精细且传统的对这些线虫的培养技术。

为提高敏感性,当检测二联巴贝虫牛巴贝虫和边缘边虫时,按Figueroa等的方法,多重PCR可以与第二次检测方法结合。该多重PC R在PCR步骤利用种特异性引物,随后将通过点渍凝胶分离的PCR产物印迹杂交至制备的地高辛探针内。

已研制其它多重PCR检测法,如采用剪接的引导RNA基因重复片段鉴定新大陆利什曼原虫复合株;采用扩增的重复DNA序列显示牛带绦虫、猪带绦虫和细粒棘球绦虫感染,鉴定理论检出水平低至0.1条L3幼虫的犬恶丝虫和班氏丝虫。为进一步提高敏感性,Evanqelopoulos等研制一种巢式多重PCR检测粪便内的溶组织内阿米巴和迪斯帕内阿米巴。此项研究以ssrDNA为靶采用一套引物扩增2个虫种,在随后的第二次PCR循环中采用种特异的巢式引物。令人吃惊的是,虽然检测2个虫种的水平提高,但研究者发现当存在2个虫种的DNA 时,敏感性呈现5倍差异。这可能是与扩增产物片段大小差异有关的未料及的偏向扩增的结果。因此,在方法的研制期间,多重PCR可能存在明显的假阳性信号和敏感性问题,然而,将识别过程简化成单次、可重复PC R反应的潜能可以超越此技术中经常遇到的许多技术障碍。

2.2　实时(real time)PCR

目前通过将荧光探针或色素结合至PCR反应混合物而避免了随后的凝胶电泳,能够在一台仪器内同时扩增靶序列和分析产物。采用最适仪器配置,可连续检查荧光试剂的排放物,因此“实时”显示结果。该技术最终目标是通过最小人工输入即时检查大量样品,使人力和材料价格降低。一般可通过两种方式探讨荧光素PCR。第一是在存在两种特异序列引物时,利用标准酶学方法和相对价廉的染料,如SYBR Green TM或溴乙锭。当未与双链DNA 结合时,插入染料荧光较少,荧光素强度与合成双链的PCR产物量成比例,因此随着每一步扩增循环而增加。该法缺点是不能从靶产物中鉴别非特异性扩增产物及通过软件检测阳性信号。为排除形成引物二聚体,需要注意仔细设计引物。替代性设置仪器检查高温时的荧光强度,高温时小的非特异性PCR 产物是不稳定的,在某些情况下可消除非特异信号的影响。一般常用的插入染料如SYBR Green TM和溴乙锭可能对PCR酶学有抑制作用,除非实验确定每一新引物组的最适Mg2+浓度。

因此,许多研究者依靠实时PC R的第二种方法,用荧光色素标记的基因特异的寡聚探针在PCR 期间的介导产物测定。一旦确定对一已知有机体特