(完整版)根癌农杆菌介导的植物基因遗传转化技术

根癌农杆菌(Agrobacterium
tumefaciens)
• 在植物基因工程的发展中, 研究最清楚和应用 最成功的是根癌农杆菌介导的遗传转化, 在已 获得的近200种转基因植物中约80%是由该菌 介导完成的. 起初, 人们认为农杆菌仅能转化双 子叶植物、裸子植物以及少数几种单子叶植物 ;而近几年, 由于在一些重要的单子叶植物以及 在真菌中应用农杆菌转化获得了成功,该方法 以转基因低拷贝、遗传稳定以及能够转化大片 段DNA等优点又受到了人们极大的关注.
• 野生型Ti质粒不能直接用作克隆外源基因的载 体：1.质量过大 2.酶切位点多 3.T-DNA区Onc基 因干扰宿主激素平衡 4.不能在大肠杆菌中复制 5冗余基因
• Onc卸甲载体：无毒的Ti质粒载体。切除了TDNA中的Onc致癌基因。缺失部分被大肠杆菌 的常用质粒pBR322区段（含Ampr)取代。
基因枪法 显微注射法
优点
缺点
转化效率高 主要以单拷贝或低拷贝形式插入 不需要特殊的专用设备
操作简单 转化效率高 同一实验可处理许多样品 化学法不需要特殊的专用设备
不受物种界限的约束 可用于不同的转化样品，如根、茎 、叶、愈伤等
不受物种界限的约束 可用于不同的转化样品，如根、茎 、叶、愈伤等
只能以T-DNA插入的方式导入寄主 细胞
整个过程大致可分为以下几个步骤
①根癌农杆菌对植物细胞的识别和附着； ②根癌农杆菌对植物信号物质的感受； ③根癌农杆菌Ti 质粒上的vir 基因以及染色
体上操纵子的活化； ④T-DNA 复合体的产生； ⑤T-DNA复合体的转运； ⑥T-DNA整合到植物基因组中。
植物表达载体构建— Onc卸甲载体（受体Ti质粒）的构建
Ti质粒
• Ti质粒（tumor-inducing plasmid）：Ti 质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质， 为双链共价闭合的环状DNA分子。Ti质粒中 有一段DNA，称为T-DNA（transfer-DNA）， 能转移并整合到植物基因组中，并导致冠 瘿瘤的形成
• Ti 质粒可分为4 个功能区域： • ①T-DNA区：T-DNA是根癌农杆菌侵染植物
细胞时从Ti 质粒上切割下来转移到植物细 胞的一段DNA，含有编码植物激素和冠瘿碱 的基因； • ②Vir 区：Vir 区上的基因能激活T-DNA 转移，使根癌农杆菌表现出毒性； • ③Con 区(接合转移编码区)：该区段上存 在与细菌间接合转移的有关基因，调控Ti 质粒在农杆菌之间的转移； • ④Ori区(复制起始区)：Ori区上的基因调 控Ti 质粒的自我复制。
花粉管通 道法
卵细胞
有
无来自百度文库
无
无
无 开花植物
简单
复杂
复杂
复杂
简单
无
10-2~10-1 10-5~10-4 10-5~10-4 10-2~10-1 10-3~10-2 10-1~101
有
无
无
无或有
多
无
简单
简单
复杂
更复杂
复杂
简单
便宜
便宜
昂贵
昂贵
昂贵
简便
高
低
低
更低
高
低
若干主要的植物细胞转化方法的比较
方法 农杆菌介导法 化学法及电激法
Ti质粒介导转化的过程
• 农杆菌吸附于植物的表面伤口部位 • 受酚类物质（乙酰丁香酮或羟基乙酰丁香
酮）的诱导，vir区基因被激活，virD基因 编码的核酸内切酶分别将T-DNA的RB序列和 LB序列切出单链切口，释放出T-DNA的单链 线性拷贝（T-链） • T-链在RB序列的引导下定向穿过农杆菌的 细胞膜、细胞壁、进入植物细胞壁并整合 到植物的染色体基因组中 • T-DNA在植物细胞中表达
• 任何适合于克隆在pBR322质粒中的外源DNA片 段都可以通过与pBR322质粒DNA的同源重组而 被共整合到Onc-Ti质粒载体上。
改造后的Ti质粒的基本结构
a. DNA复制 起始位点
b. 选择标记 基因
c. T-DNA的 边界序列
d. 多克隆位 点
左边界序列
右边界序列
植物表达载体构建—中间载体的构建
• 发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）：含有Ri (rootinducing plasmid)质粒，能够诱导被侵染的植物细胞产生 毛发状根。
• 根癌农杆菌的Ti 质粒和发根农杆菌Ri 质粒都具有一段转 移DNA (transfer DNA，又称T-DNA)，在农杆菌侵染植物 时，T-DNA 可以插入到植物基因组中，使其携带的基因 在植物中得以表达。由于T-DNA 能够进行高频率的转移， 而且Ti 质粒和Ri 质粒上可插入大到甚至150kb 的外源基 因，因此，Ti 质粒和Ri 质粒已成为植物基因转化中的理 想载体系统。
复性好、基因沉默现象少、转育周期短及能转 化较大片段等独特优点而备受科学工作者的青 睐
若干主要的植物细胞转化方法的比较
评价内容
受体材料 宿主限制 培养条件 转化频率 嵌合体
操作 设备要求 工作效率
农杆菌 法
外植体
植物转化方法 PEG法 电击法 微注射法 原生质体 悬浮细胞 细胞或组织
基因枪 法
外植体
• 带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒衍生载体称 为“中间载体”。
• 基本原理是把T区（即Ti质粒能整合到植物 基因组中去的一段DNA，总长度约为23kb） 片段克隆到普通载体pBR322上，把外源基 因插入到该T区后再导回受体细胞中，使外 源DNA转移到Ti质粒上，再经根癌土壤杆菌 转化植物把该外源片段导入植物体内。
根癌农杆菌介导的植物基因遗 传转化技术
常用的植物基因转化技术
• 农杆菌介导法 • 植物病毒载体介导法（如CaMV） • DNA直接导入法（PEG介导法、脂质体法、基因
枪法、电激法、激光微束法、 显微注射法等） • 种质系统介导基因转化（花粉管通道法等） • 其中农杆菌介导法以其费用低、拷贝数低、重
外源DNA重排率高，常为多拷贝形 式插入 化学法需通过原生质体培养及其再 生体系，才能产生 有体细胞克隆变异的风险
需复杂的专用设备 外源DNA重排率高，常为多拷贝形 式插入
需昂贵的专用设备 需接受专门训练的技术人员进行操 作
与植物基因转化有关的农杆菌
• 根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）：含有Ti (Tumor-inducing plasmid)质粒，能诱导被侵染的植物细 胞形成肿瘤，即诱发冠瘿瘤。