(完整版)根癌农杆菌介导的植物基因遗传转化技术
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展根癌农杆菌介导的真菌遗传转化是一种重要的生物技术手段，被广泛应用于真菌基因工程研究和相关产业生产中。
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术利用农杆菌Ti质粒中的T-DNA片段将外源基因导入真菌细胞内，使真菌细胞具有新的遗传特性。
近年来，随着生物技术的发展和研究的深入，根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究取得了令人瞩目的进展。
一、根癌农杆菌介导的真菌遗传转化原理及方法1.构建适合真菌的质粒载体，将外源基因插入T-DNA载体中，构建成适合真菌遗传转化的质粒载体。
2.将构建好的质粒载体通过农杆菌进行转化，使其含有T-DNA片段。
3.利用农杆菌与真菌细胞的接触，将质粒中的T-DNA片段导入真菌细胞内。
4.筛选和鉴定转化后的真菌株系，确认外源基因是否成功导入真菌细胞中，并对转化菌株进行鉴定和分离纯化。
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术在农业生产中有着广泛的应用价值，主要体现在以下几个方面：1. 抗病力提高：根癌农杆菌介导的真菌遗传转化可以实现真菌对病原菌的抗性提高，使植物在生长过程中更加健康，减少病害发生的可能性。
2. 产量增加：通过真菌遗传转化技术可以使真菌获得更好的生长特性和代谢特性，从而提高作物产量。
3. 抗逆性提高：真菌经过遗传改造后，可能对环境中的逆境条件具有更强的抵抗能力，使植物更加适应不良环境的生长条件。
4. 品质改进：真菌遗传转化技术还可以用于改进植物的品质，比如提高农作物的风味、口感等。
1. 药物生产：利用真菌遗传转化技术可以大规模生产生物药物，比如抗生素、激素等，在生物医药领域有着重要的应用。
2. 新药研发：真菌遗传转化技术可以用于研发新的药物，通过改造真菌代谢途径等方式，获得新型的生物活性化合物。
3. 医学研究：真菌遗传转化技术也可以用于医学研究领域，比如用于疾病的基因治疗、蛋白质表达等。
1. 技术改进：研究者不断优化根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术，提高转化效率和稳定性，为真菌的遗传改造提供更好的手段。
根癌农杆菌介导法
——一元载体
（卸甲载体）
1. 切除T-DNA中的致瘤基因，仅保留两侧边 界与T-DNA准确转移所需的25个碱基序列。 2. 在T-DNA区中删除致瘤基因位点插入与中 间载体同源的质粒序列。 3. 用特定转移方法转移中间载体，发生同源 重组。 4. 根据中间载体所携带的抗性基因进行筛选。 5. 用筛选后的菌株侵染植物组织细胞。
外植体的接种及培养 一般接种时间1~30min 接种菌液浓度0.3~1.5OD
——基因枪法Vs
农杆菌法
转化 效率 基因枪法 低 宿主 范围 无限制 操作 可 控度 高简便ຫໍສະໝຸດ 根癌农杆 菌介导法高
单子叶 植物；一 些双子叶 植物
复杂
低
——二元载体
基本原理：T-DNA区与Vir区不在同一个载 体上，Vir区通过反式作用使T-DNA区发生 缺失Vir，T-DNA卸甲， 转移。 引入酶切位点 微型Ti质粒 去掉T-DNA去 根癌农杆菌 辅助Ti质粒 外源基因 微型Ti质粒 含有辅助Ti 质粒的根癌农杆菌 植物
——T-DNA导入植物
因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系, 改 造的Ti质粒就是一个优良的植物转基因载体。
——Ti质粒结构
特点
Ti-质粒的基因结构
T-DNA区 （transferred DNA region)
转移到植物基因组中的DNA 序列，与肿瘤形相关。 激活T-DNA的转移，使植物 致瘤，是毒性区。 调控Ti质粒在根癌农杆菌 之间的转移，是接合转移 编码区。 调控Ti质粒的自我复制， 为复制起始区。
基因组的过程
一、农杆菌对受体的识别 菌株对植物细胞所释放的化学物质产生趋 向性。
植物细胞转基因技术
适用范围广，不依赖组织培养人工再生植株； 可直接获得转基因种子，育种时间短，在鉴定
时可直接针对目的性状的表现型来进行,简单快
捷； 转化速度较快，变异性状稳定较快； 方法简单,不需要复杂昂贵的仪器设备。
01
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缺点： 转化受体受植物花期的限制，同时必须充分了解 每一种植物的开花受精的时间过程。 在自然田间进行操作，受环境条件的影响很大。 操作的经验性很强,需要一定的技巧。 利用此方法获得水稻、烟草、甘蓝、小麦等植物的 转基因植株。
10bp 和4bp 两组,是完全保守的。这两个边界是 T -DNA 转移所必需的。其中尤以右边界最为重
DNA
1
2
3
4
5
6
vir基因
Ti 质粒的 vir 区大小为30kb ,分 VirA 、B 、C 、D 、E 、G 、H 等7 个操纵子,一共有24 个 基因共同控制着 T -DNA 的加工和转移,它们总 称调控子。
4.化学物质诱导法
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优点：
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PEG法操作简单、成本低、结果较稳定、重复性
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好、无需昂贵的基因转化仪器，且嵌合转化体很
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少产生。
缺点： 原生质体培养再生难度较大； 原生质体再生培养的转化植株变异率高,易产生白 化苗，且由于 PEG法对原生质体活力有害，转化 率低。 应用这种方法已成功的获得大麦、柑桔、胡 椒等植物的转基因植株。
电击法
DNA 混合入电击缓冲液 幼苗
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优点： 操作简便，可以一次转化许多原生质体，转化效
率较高，特别适于瞬间表达。
缺点： 有原生质体培养的麻烦,电穿孔易造成原生质体损伤使再生率降低。
农杆菌介导法
实验九植物遗传转化——农杆菌介导法一、目的了解农杆菌转化的机理；掌握农杆菌介导转化水稻的技术二、原理根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具有跨界转移DNA的能力。
下列因子与转化过程有关：1. Ti 质粒(tumor-inducing plasmid)上的T-DNA (transferred DNA)T-DNA是农杆菌Ti质粒上能够转移到植物基因组的一段DNA序列。
T-DNA含有RB和LB两个边界，它们是25bp的正向重复序列，是T-DNA 转移的顺式作用元件。
不同类型的农杆菌其边界序列有所不同，但划线部分为完全保守序列。
置于该边界内的任何外源基因均可被转化。
LB缺失突变后农杆菌仍能致瘤，但RB缺失会导致致瘤能力丧失，这时几乎完全没有T-DNA的转移。
LB（－链）5’GT TTACACCACAA TA TATCCTG CCA 3’RB（＋链）5’TGA CAGGA TA TA TTGGCGGGTAA AC 3’2. Ti质粒上的Vir区（virulence region）操纵子转化所必需的基因有vir A、B、C、D、E、G。
其中蛋白VirD1/D2识别T-DNA边界RB和LB；VirC识别T-DNA右边界的超驱增强子；VirD2在T-DNA底链起内切酶作用造成切刻，并与T－链5’ 共价结合，带有1个核定位信号NLS；VirB形成转移复合通道；VirE2为单链DNA 结合蛋白，有2个NLS。
该操纵子的表达顺序如下：vir A和vir G组成型表达形成VirA和VirG蛋白→VirA被植物创伤信号分子激活→激活的VirA使VirG激活→激活的VirG 诱导vir C、D、E、B、F、H表达。
3. 农杆菌染色体基因组相关基因：chv A、chv B（农杆菌运动、附着）、chv D、chv E（编码单糖结合蛋白、趋化性）、psc A、att、cel（合成纤维素丝，附着）。
它们与农杆菌的趋化性和识别附着植物细胞有关。
根瘤农杆菌介导植物转基因流程
根瘤农杆菌介导植物转基因流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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农杆菌介导遗传转化原理
!
冠瘿碱代谢基因
农杆菌转化植物的过程 •植物受伤部位酚类化合物的分泌 •附着（chvA、chvB） •VirA/G的双组分系统感受受伤信号 （signal to A Pi to G） •其他Vir基因的表达 •T-DNA链的切出（VirD1+VirD2；Border to Border） •T-complex的形成 •运输（从细菌中输出、进入入植物细胞、入入核） •整合
A
B
C
PCR（A）、RT-PCR（B）和 Southern（C）鉴定结果
影响植物农杆菌转化效率的因素 •植物品种（基因型效应）； •农杆菌菌株及载体； •起始材料； •侵染所用用菌浓度（OD值）； •共培养条件(温度、时间、光照、培养基成分)； •共培养之后的筛选方方式； 等等；
农杆菌介导的 植物遗传转化
农杆菌的分类 革革兰氏氏阴性菌、杆状； 按侵染植物的后果分为： •根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens） 形成冠瘿（crown gall） •发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes） 形成发根（hairy root）
按合成/代谢冠瘿碱（Opine）的种类，根癌农杆菌分为 ： •章⻥鱼碱（Octopine）型 •胭脂碱（Nopaline）型 •农杆碱（Agropine）型
The Plant Cell, Vol. 18, 3350–3352
冠瘿病的害处： 苗木木感病后发育受阻；生生⻓长缓慢；植株矮小小；严重 时叶片片萎蔫、早衰，甚至至死亡； 大大树受害后树势衰弱，生生⻓长不良，提前落叶，果实 变小小，树龄缩短。主干受害降低材质及工工艺价值。
农杆菌能够导致植物产生生冠瘿病的原因： Ti（Ri）质粒
•T-complex的转运 通过细菌细胞壁上由11个VirB蛋白白和VirD4组成的通 道从农杆菌向外输出
根癌农杆菌
根瘤菌科，农杆菌属
（Agrobacterium）：
——革兰氏阴性菌，侵染植物伤口进 入细胞后，将T-DNA插入植物基因 组中，导致植物产生冠瘿瘤或毛状 不定根，干扰植物的正常生长
－根癌农杆菌（A. tumefaciens）
Ti质粒(tumor-inducing plasmid) （广泛使用）
纯化和稳定遗传 －不需要特殊的专用设备
缺点： －只能以T-DNA插入的方式导入寄主细胞，没
有方向性
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也称微弹轰击法：将外源DNA包 被在微小的金粒或钨粒表面，然后 在高压的作用下微粒被高速射入受 体细胞或组织。微粒上的外源 DNA进入细胞后，整合到植物染 色体上，从而实现基因的转化。
可将基因枪分为三种类型： 第一类是以火药作为动力； 第二类是以高压气体作为动力； 第三类是以高压放电作为动力。
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杀虫晶体蛋白的杀虫作用机理
当昆虫吞食后，ICP在昆虫中肠的碱性消化液和胰蛋 白酶作用下，变成有活性的毒蛋白，并与昆虫中肠 上皮细胞上的特异性受体结合，全部或部分嵌合于 细胞膜中形成离子通道，造成膜穿孔，细胞渗透平 衡受到破坏，代谢终止，昆虫停止进食，最后脱水 死亡。
由于ICP要形成有活性的毒蛋白，必须同时具备碱性 条件和特定的蛋白酶才能产生，因此人畜不受影响。
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基因枪
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1) 提高植物的农业价值（产量、品质、抗性）和园艺 价值（花色、花形、花期），eg. 抗虫棉、转基因 矮牵牛等；
2) 作为生物反应器生产某些重要蛋白质和次生代谢物 质，eg. 生长激素、干扰素、白介素-2、 乙肝疫苗、表皮 生长因子等；
3) 研究基因在发育及其他生理生化过程与代谢途径中 的作用
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Bt能杀死宿主昆虫主要靠其芽孢和毒素（杀虫晶体蛋白， Bt）。
根癌农杆菌介导法原理
根癌农杆菌介导法原理引言根癌农杆菌介导法是一种常用的基因转化技术，广泛应用于植物遗传工程领域。
它利用植物根癌农杆菌接触感染时产生的植物激素和DNA导入技术，将外源基因导入植物细胞，实现对植物基因组的改造。
本文将全面、详细、完整地探讨根癌农杆菌介导法的原理、应用以及优缺点。
根癌农杆菌的特点1. 根癌农杆菌简介根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 是一种通过植物接触感染的土壤细菌，在植物遗传工程研究中具有重要的应用价值。
它能够将其自身的T-DNA（转座子DNA）片段导入植物细胞，并在植物细胞中稳定表达。
2. 根癌农杆菌的感染机制根癌农杆菌感染植物的过程包括以下几个步骤：1.识别和结合：根癌农杆菌通过识别植物伤口释放的酚类化合物，结合到植物细胞表面。
2.感染透入：根癌农杆菌产生的信号分子诱导植物细胞产生细胞壁降解酶，使其自身进入植物细胞。
3.T-DNA转移：根癌农杆菌通过特殊的转移螺旋（vir蛋白）将T-DNA从细菌自身转移到植物细胞中。
4.T-DNA整合：转移的T-DNA片段在植物细胞染色体上整合，并导致植物细胞的遗传改变。
根癌农杆菌介导法原理根癌农杆菌介导法利用根癌农杆菌的感染机制，将外源基因导入植物细胞，从而实现对植物基因组的改造。
1. 构建适合的转化载体在根癌农杆菌介导法中，首先需要构建适合的转化载体。
转化载体通常包括以下几个重要组成部分：•T-DNA：携带待转化的外源基因片段。
•选择标记基因：用于筛选转化成功的植物细胞。
•根癌农杆菌起始核酸序列（ori）：用于在根癌农杆菌中复制转化载体。
2. 根癌农杆菌感染植物将构建好的转化载体导入根癌农杆菌中，然后让根癌农杆菌感染植物组织。
通常可以通过以下步骤实现：•制备根癌农杆菌感染液：将构建好的转化载体导入根癌农杆菌中，培养至菌体达到一定浓度。
•植物组织处理：将待转化的植物组织浸泡在根癌农杆菌感染液中，利用真空处理或共振法促使菌体进入植物细胞。
根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化
三、根癌农杆菌Ti质粒转化方法
• 整体植株接种共感染法 • 优点：实验周期短；充分利用无菌实生苗 的生长潜力；避免在转化过程中其它细菌 污染；避免农杆菌在培养基上的过度生长； 具较高的转化率。 • 缺点：嵌合体严重；转化细胞的筛选困难。 • 原生质体共培养转化法 • 最大优点实减少嵌合体产生；缺点是原生 质体再生困难，获得转化株少，操作比较 复杂。
• 叶盘转化法 • 优点：适用性广；改良的叶盘法可以适用于其它 外植体如茎段、子叶等；操作简单且重复性高。 • 注意事项：掌握叶组织侵入农杆菌培养液的适宜 时间；叶片在培养过程中常膨大而扭曲，可把切 口边缘压入埋藏在培养基中；制备叶盘是最好避 免叶脉进入。
农杆菌Ti质粒转化系统的优点
• 该转化系统是模仿天然的转化载体系统，成功率高， 效果好； • 机理研究最清楚，方法最成熟，应用最广泛； • Ti质粒的T-DNA区可以容纳相当大的DNA片段插入，目 前已把50kb的DNA转入植物细胞中； • 农杆菌Ti质粒转化系统的外源基因以单拷贝为多 数，遗传稳定性好，且多数符合孟德尔遗传规律。
• 根癌农杆菌通过基因转化把T-DNA上的基因 导入植物细胞并整合到核DNA上。这些外源 基因在植物细胞中得到表达，致使植物细胞 转化为肿瘤状态，并大量合成冠瘿碱。这些 冠瘿碱又是农杆菌的唯一碳源，有利于农杆 菌的繁殖和Ti质粒的转移，进一步扩大侵染 领域。
二、根癌农杆菌转化程序及操作原理
农杆菌基因转化可分为三部分： • 受体系统的建立； • Ti质粒转化载体的构建； • 目的基因的转化。
农杆菌附着后不能立即转化只有在创伤部位生存16h之后的菌株才能诱发肿瘤因此共培养时间必须长于16h时间过长由于农杆菌的过度生长植物细胞因受到毒害而死亡
根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化
农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素
二、农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素转化机制：与植物基因转化有关的农杆菌有两种类型:根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）。
根癌农杆菌含有Ti 质粒。
发根农杆菌含有Ri 质粒.根癌农杆菌的Ti 质粒和发根农杆菌Ri 质粒都具有一段转移DNA （transfer DNA，又称T-DNA)，在农杆菌侵染植物时，T-DNA 可以插入到植物基因组中，使其携带的基因在植物中得以表达。
由于T-DNA 能够进行高频率的转移，而且Ti 质粒和Ri 质粒上可插入大到甚至150kb 的外源基因，因此，Ti 质粒和Ri 质粒成为植物基因转化中的理想载体系统。
1 与农杆菌转化相关的基因与转化相关的基因主要包括农杆菌染色体上的基因和Ti 质粒上T—DNA 以外Vir 区的基因。
染色体基因包括chvA、chvB、att、pscA、chvD 以及chvB。
它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。
ChvD 蛋白可能在低pH 和磷酸饥饿情况下提高VirG 蛋白的合成水平。
ChvE 与VirA 蛋白共同对virG 起激活作用。
原始的Ti质粒根据其功能的不同，可分为4个区：（1）T—DNA区:是在农杆菌侵染细胞时,从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA,其携带的基因与肿瘤的形成有关,但与T-DNA本身的转移与整合无关.T—DNA上最重要的是两端的2个边界(LB和RB)，它们是T-DNA转移所必需的。
只要其存在，T—DNA 可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中， T—DNA的右边界在T—DNA的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用，因此,尤以右边界更为重要．（2）毒性区：位于T—DNA以外的1个30～40 kb的区域内，该区段编码的基因但对T-DNA 的转移和整合非常重要．这些基因也称为Ti质粒编码毒性基因(vir)。
根癌农杆菌介导的植物遗传转化1
实验三根癌农杆菌介导的植物遗传转化一实验目的了解植物遗传转化的方法和理论掌握根癌农杆菌介导的遗传转化技术二原理植物遗传转化技术是指通过物理的，化学的或生物学的方法，将外源的基因导入受体植物细胞中获得再生植株的转基因技术。
自1983转基因植物问世以来，至今不到20年时间里，植物转基因技术发展迅速，除了占指导地位，运用最为广泛的农杆菌介导法，还发展了10多种转基因方法，如物理方面的基因枪法，电激法，显微注射法，超声波法，激光微束法，炭化硅纤维介导法，电泳法等；化学方面PEG介导转化，脂质体介导转化；生物学方面的种质系统法如花粉介导法，花粉管通道法等。
农杆菌介导法土壤农杆菌（Agrobacterium）是一种革兰氏阳性菌，有两个种与植物转基因有关，即根癌农杆菌（Agrobacterium Tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium Rhizogenes）.它们在自然状态下具有趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠缨瘤或发状根，在离体条件下，可以在不加任何生长素的培养基中持续生长，研究表明根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti 和Ri质粒,上面有一段T-DNA区，可以通过一系列过程进入植物细胞并将这一段T-DN插入到植物基因组中，这是农杆菌侵染植物后产生冠缨瘤或发状根的根本原因，因此农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系，人们可将所构建的目的基因插入到去除了致瘤基因的Ti(Ri)质粒的T-DNA区，借助农杆菌侵染受体植物细胞后T-DNA向植物基因组的高频转移和整合特性，实现目的基因对受体植物细胞的转化，然后通过植物细胞合和组织培养技术，利用植物细胞的全能性获得转基因再生植株。
农杆菌介导法转基因技术的关键是T-DNA整合受体植物基因组的过程，这一过程依赖与Ti质粒上的T-DNA区，和Vir区各种基因的表达以及一系列蛋白质和核酸的相互作用。
简略地说。
其过程是：植物细胞在受伤后细胞壁破裂，分泌高浓度的创伤诱导分子，它们是一些酚类化合物，如乙酰丁香酮（acetosyringone,AS）和羟基乙酰丁香酮（hydroxy- acetosyringone,OH-As）农杆菌对这类物质具有趋化性，首先在植物细胞表面发生贴壁，继而植物创伤分子诱导农杆菌Vir区各种基因的激活和表达。
一种根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法[发明专利]
![一种根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/9b20363db9f3f90f77c61b0d.png)
专利名称：一种根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法专利类型：发明专利
发明人：陈勇,沈雪峰,杨九铃,董朝霞,魏吉平
申请号：CN201711351411.5
申请日：20171215
公开号：CN108103093A
公开日：
20180601
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开一种根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法，属于遗传工程技术领域。
本发明首次建立了一种牛筋草的遗传转化体系方法，包括愈伤组织的诱导和继代、转化、诱导分化、生根筛选培养和炼苗移栽、转基因植株的PCR检测等步骤。
该方法优点在于：(1)愈伤组织诱导率高，为遗传转化提供了大量的受体材料。
(2)经过采用压力筛选培养基对抗性愈伤进行筛选和GUS鉴定对抗性植株进行筛选，简化了实验过程，大大减少了转化后的工作量。
(3)利用传统的单子叶遗传转化方法，获得了稳定、高效的一种牛筋草遗传转化体系方法。
申请人：华南农业大学
地址：510642 广东省广州市天河区五山路483号
国籍：CN
代理机构：广州市华学知识产权代理有限公司
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根癌农杆菌介导的植物转化-叶盘转化法
根癌农杆菌介导的植物转化－叶盘转化法一、原理以根癌农杆菌介导的遗传转化是目前最有效的途径之一。
根癌农杆菌对植物释放的化学物质产生趋化反应，向植物受伤组织集中。
经共培养后，受伤部位的化学诱导物透过农杆菌的细胞膜使Ti质粒上的Vir基因活化。
Vir基因产物使Ti质粒上的T－DNA进入植物细胞，并整合到植物核基因组中。
插入在T－DNA左右边界区内的目的基因也随之整合到植物染色体上，从而使目的基因在植物细胞中得到表达。
二、目的了解根癌农杆菌介导的植物基因转化的方法和用途，掌握叶盘转化法的基本原理和操作。
三、材料、试剂和器具1、烟草、甘蓝无菌苗或田间生长的植株。
2、含目的基因的共整合载体或双元载体的根癌农杆菌。
3、YEB液培养基。
4、抗菌素储备液(Kan, Cif, Rif, Amp)。
5、MS基本培养基。
6、MS分化培养基。
7、70％乙醇。
8、0.1%升汞。
四、操作步骤1、取幼嫩健康的叶片，用蒸馏水冲洗一遍，70％乙醇洗45秒，0.1%升汞消毒6－8分钟，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分。
2、将无菌叶片剪成份0.5cm×0.5cm的小块，叶片近轴面向下，接种在愈伤组织诱导或分化培养基上，预培养2－3天。
3、挑取一个单菌落根癌农杆菌，接种到20ml附加相应抗生素的YEB培养液中，在27℃恒温摇床上培养到OD值为0.6-0.8。
取上述上培养物按1％－2％的比例，转入新鲜的无抗菌素的YEB培养液中，继续培养6小时，当OD值为0.2-0.5时即可用于转化。
4、在超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿，从培养液中取出预培养的外植体，放入菌液中泡1－5分钟。
取出外植体在无菌滤纸上吸去附着的菌液。
然后接种在愈伤组织诱导或分化培养基（烟草的培养基为MS附加IAA0.5mg/L, BA2.0mg/L）上，28℃暗培养2－4天。
5、将经过共培养的外植体转移到加有选择压的脱菌分化和愈伤组织诱导培养基上。
在光照的条件下，25℃进行选择培养。
(完整版)农杆菌介导法
Ti质粒
Ti质粒是根癌农杆菌 细胞核外存在的一种 环状双链DNA分子， 长度约200kb，平均 周长54.1－75 .4 um， 分子质量为（90－ 150）×106 Da。在温 度低于30℃的 条件下， Ti质粒可稳定地存在 于根癌农杆菌细胞内。
的冠瘿碱类型分为三类：章鱼碱(octopine)类 胭脂碱(nopaline)类 农杆碱（agropine） 类。
Ti质粒携带着既能分解又能合成这些化合物的酶类和相应 基因，然而冠瘿碱合成基因却不能在根癌农杆菌中表达， 它们只有进入植物细胞后才能表达，Ti质粒上的冠瘿碱分 解基因产物却能分解冠瘿碱，为宿主细胞提供能源、氮源 和碳源。
子的刺激，Ti质粒vir区毒性
基因被激活和表达。
目前已经发现9种信号因子，均为水溶性酚类化合物。 其中乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）和羟基乙酰 丁香酮（OH-AS）的作用较强，儿茶酚、原儿茶酚、没 食子酸、焦性没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酚和对羟 基苯酚处理农杆菌时也对Vir区的基因表达起促进作用。
脂碱型根癌农杆菌Ti质粒中TDNA的左右两侧是一段24bp 的重复序列,构成T-DNA的边 界序列(border sequence), 分别称为左边界(left border,LB)和右边界(right border,RB).在某些章鱼碱型 根癌农根癌农杆菌Ti质粒中TDNA是以两个分开的独立片 段形式存在，即T-DNA左边 区段和T-DNA右边区段。研 究表明，插入在T-DNA边界 序列之间的任何DNA都可被 转到植物染色体中。因此Ti质 粒可用做外源目的基因的载 体。
农杆菌介导转化法
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• 基本原理是把T区（即Ti质粒能整合到植物 基因组中去的一段DNA，总长度约为23kb） 片段克隆到普通载体pBR322上，把外源基 因插入到该T区后再导回受体细胞中，使外 源DNA转移到Ti质粒上，再经根癌土壤杆菌 转化植物把该外源片段导入植物体内。
• 任何适合于克隆在pBR322质粒中的外源DNA片 段都可以通过与pBR322质粒DNA的同源重组而 被共整合到Onc-Ti质粒载体上。
改造后的Ti质粒的基本结构
a. DNA复制 起始位点
b. 选择标记 基因
c. T-DNA的 边界序列
d. 多克隆位 点
左边界序列
右边界序列
植物表达载体构建—中间载体的构建
根癌农杆菌介导的植物基因遗 传转化技术
常用的植物基因转化技术
• 农杆菌介导法 • 植物病毒载体介导法（如CaMV） • DNA直接导入法（PEG介导法、脂质体法、基因
枪法、电激法、激光微束法、 显微注射法等） • 种质系统介导基因转化（花粉管通道法等） • 其中农杆菌介导法以其费用低、拷贝数低、重
• 野生型Ti质粒不能直接用作克隆外源基因的载 体：1.质量过大 2.酶切位点多 3.T-DNA区Onc基 因干扰宿主激素平衡 4.不能在大肠杆菌中复制 5冗余基因
• Onc卸甲载体：无毒的Ti质粒载体。切除了TDNA中的Onc致癌基因。缺失部分被大肠杆菌 的常用质粒pBR322区段（含Ampr)取代。
• 发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）：含有Ri (rootinducing plasmid)质粒，能够诱导被侵染的植物细胞产生 毛发状根。
• 根癌农杆菌的Ti 质粒和发根农杆菌Ri 质粒都具有一段转 移DNA (transfer DNA，又称T-DNA)，在农杆菌侵染植物 时，T-DNA 可以插入到植物基因组中，使其携带的基因 在植物中得以表达。由于T-DNA 能够进行高频率的转移， 而且Ti 质粒和Ri 质粒上可插入大到甚至150kb 的外源基 因，因此，Ti 质粒和Ri 质粒已成为植物基因转化中的理 想载体系统。
花粉管通 道法
卵细胞
有
无
无
无
无
简单
无
10-2~10-1 10-5~10-4 10-5~10-4 10-2~10-1 10-3~10-2 10-1~101
有
无
无
无或有
多
无
简单
简单
复杂
更复杂
复杂
简单
便宜
便宜
昂贵
昂贵
昂贵
简便
高
低
低
更低
高
低
若干主要的植物细胞转化方法的比较
方法 农杆菌介导法 化学法及电激法
Ti质粒介导转化的过程
• 农杆菌吸附于植物的表面伤口部位 • 受酚类物质（乙酰丁香酮或羟基乙酰丁香
酮）的诱导，vir区基因被激活，virD基因 编码的核酸内切酶分别将T-DNA的RB序列和 LB序列切出单链切口，释放出T-DNA的单链 线性拷贝（T-链） • T-链在RB序列的引导下定向穿过农杆菌的 细胞膜、细胞壁、进入植物细胞壁并整合 到植物的染色体基因组中 • T-DNA在植物细胞中表达
基因枪法 显微注射法
优点
缺点
转化效率高 主要以单拷贝或低拷贝形式插入 不需要特殊的专用设备
操作简单 转化效率高 同一实验可处理许多样品 化学法不需要特殊的专用设备
不受物种界限的约束 可用于不同的转化样品，如根、茎 、叶、愈伤等
不受物种界限的约束 可用于不同的转化样品，如根、茎 、叶、愈伤等
只能以T-DNA插入的方式导入寄主 细胞
细胞时从Ti 质粒上切割下来转移到植物细 胞的一段DNA，含有编码植物激素和冠瘿碱 的基因； • ②Vir 区：Vir 区上的基因能激活T-DNA 转移，使根癌农杆菌表现出毒性； • ③Con 区(接合转移编码区)：该区段上存 在与细菌间接合转移的有关基因，调控Ti 质粒在农杆菌之间的转移； • ④Ori区(复制起始区)：Ori区上的基因调 控Ti 质粒的自我复制。
整个过程大致可分为以下几个步骤
①根癌农杆菌对植物细胞的识别和附着； ②根癌农杆菌对植物信号物质的感受； ③根癌农杆菌Ti 质粒上的vir 基因以及染色
体上操纵子的活化； ④T-DNA 复合体的产生； ⑤T-DNA复合体的转运； ⑥T-DNA整合到植物基因组中。
植物表达载体构建— Onc卸甲载体（受体Ti质粒）的构建
Ti质粒
• Ti质粒（tumor-inducing plasmid）：Ti 质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质， 为双链共价闭合的环状DNA分子。Ti质粒中 有一段DNA，称为T-DNA（transfer-DNA）， 能转移并整合到植物基因组中，并导致冠 瘿瘤的形成
• Ti 质粒可分为4 个功能区域： • ①T-DNA区：T-DNA是根癌农杆菌侵染植物
外源DNA重排率高，常为多拷贝形 式插入 化学法需通过原生质体培养及其再 生体系，才能产生 有体细胞克隆变异的风险
需复杂的专用设备 外源DNA重排率高，常为多拷贝形 式插入
需昂贵的专用设备 需接受专门训练的技术人员进行操 作
与植物基因转化有关的农杆菌
• 根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）：含有Ti (Tumor-inducing plasmid)质粒，能诱导被侵染的植物细 胞形成肿瘤，即诱发冠瘿瘤。
根癌农杆菌(Agrobacterium
tumefaciens)
• 在植物基因工程的发展中, 研究最清楚和应用 最成功的是根癌农杆菌介导的遗传转化, 在已 获得的近200种转基因植物中约80%是由该菌 介导完成的. 起初, 人们认为农杆菌仅能转化双 子叶植物、裸子植物以及少数几种单子叶植物 ;而近几年, 由于在一些重要的单子叶植物以及 在真菌中应用农杆菌转化获得了成功,该方法 以转基因低拷贝、遗传稳定以及能够转化大片 段DNA等优点又受到了人们极大的关注.
复性好、基因沉默现象少、转育周期短及能转 化较大片段等独特优点而备受科学工作者的青 睐
若干主要的植物细胞转化方法的比较
评价内容
受体材料 宿主限制 培养条件 转化频率 嵌合体
操作 设备要求 工作效率
农杆菌 法
外植体
植物转化方法 PEG法 电击法 微注射法 原生质体 悬浮细胞 细胞或组织
基因枪 法
外植体