肿瘤精准靶向治疗

循环肿瘤细胞（CTC）检测
循环肿瘤细胞
循环肿瘤细胞指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞。
循环肿瘤细 胞（CTC） 循环肿瘤 微栓 （CTM） 凋亡的CTC 侵入血管外 (CTC) 转移到骨 髓和其他 器官 肿瘤细胞 扩增 血管生成 间质－上皮 转化 （MET） 播散肿瘤细胞 （DTC）微转 移休眠灶
野生型 高表达/表达阳性
基因表达量（mRNA）检测
——指导个体化化疗
可使标准化疗方案得到个体化应用
mRNA检测主要技术特色
• 采用荧光定量PCR技术，采用内参比 RNA作为质控对照，应用beta-actin作 为内对照，定量检测检测目的基因 mRNA表达水平。
•
适用于各种肿瘤组织检测，包括石蜡标 本、穿刺标本、冰冻活检标本等。
检测方法：RT-PCR, FISH, PCR-测序等
靶向EGFR的抗肿瘤药物
类别一：小分子酪氨酸激酶抑制剂（ EGFR －TKI)
作用机制：抑制EGFR胞内区酪氨酸激酶活 性，阻断EGFR信号通路； 药物代表：吉非替尼（阿斯利康）；厄罗替 尼（罗氏）。
类别二：单克隆抗体(mAb)
作用机制：与EGFR胞外区结合，阻断配体与 EGFR的结合； 药物代表：西妥昔（默克）；贝伐单抗（罗 氏）。
World J Gastroenterol. 2011 November 21; 17(43): 4779-4786.
基因KRAS热点突变位点
KRAS主要突变在： 外显子2（密码子12，13 ），3（密码子61） 10
个体化检测平台
基因突变检测
——ARMS技术，测序等
ARMS技术——普通PCR
靶向药物
曲妥珠单抗 索拉菲尼 伊马替尼 舒尼替尼
HER-2; PTEN mRNA表达水平，2项 PDGFRβ; VEGFR mRNA表达水平，2项 C-kit (4项); PDGFRα(2项) 基因突变，6项 PDGFRβ mRNA表达水平，1项
VEGFR; PDGFRβ mRNA表达水平，2项
C-kit (4项); PDGFRα(2项) 基因突变，6项
STMN1表达检测意义
• 疗效：
低表达接受长春瑞滨/顺铂治疗 的效果较好，中位生存期较长；
STMN1高表达接受长春瑞滨/顺铂 的疗效较差。 • 预后： 表达水平越高，患者的生存率越 低，肿瘤发生转移的风险越高。
Elizabeth A et al. Cancer Res. 2002;62:6864-6869
• 国内采用校准RNA（Calibrator RNA）方法进行基因表达定量。
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Q-PCR检测基因表达数据库
基础：>5000例样本
人种：中国患者样本
标准：正态分布 定位：精确到1% 统计：p<0.05
RRM1表达与吉西他滨疗效相关的临床数据
NCCN 2012年版临床治疗指南明确 指出： 患者接受吉西他滨化疗前进行 RRM1 mRNA检测可提高治疗有 效率和患者生存率。
等位基因特异性扩增法（Allele Specific Amplification，ASA） 建立于1989年，是PCR技术应用的发展，也称扩增阻滞突变系统 （Amplification Refractory Mutation System ， ARMS）、等位 基因特异性PCR（Allele Specific PCR， ASPCR）等。
1869年 Aust Med J， Ashworth最早在转移性癌
原发肿瘤血管 生成侵润
侵入血管内
症患者血液中观察到。
上皮－间质 转化 （EMT） 侵润
2005年 N Engl J Med，
血管内增殖 (CTM)
Cristofanilli证实治疗前
CTC数目是转移性乳腺癌 患者无进展生存期和总生 存期的独立预测因子。
Ⅲ、Ⅳ期患者：放/化疗+手术 局部晚期患者：Байду номын сангаас术、化疗、放疗、靶向
肿瘤个体化治疗
分子分型
标本→基因检测→遗传特性 →选择化疗/靶向药物
克唑替尼的靶标——EML4-ALK融合基因
EML4和ALK两个基因分别位于人类2号染 色体的p21和p23带
已发现并确认至少9种EML4-ALK融合基因的突变体： v1、v2、v3a、v3b、v4、v5a、v5b、v6、v7
比较完整的个体化诊疗解决方案逐步诞生
肿瘤个体化治疗发展趋势
肿瘤治疗相关基因检测
肿瘤分子诊断 1.肿瘤个体化治疗 循环肿瘤细胞
2. 肿瘤个体化治疗 发展趋势
临床上治疗肿瘤的方法
• 患者对药物是否敏感？毒性是否可耐受？ • 患者治疗后转移复发风险有多高？
个体化治疗：医学概念。应用它不仅降低并发症的发生,还
降低医疗费用。 肿瘤标准化治疗
病理分型
Ⅰ期患者：手术/化疗
化疗药物敏感性解决方案
药物名称
卡铂/顺铂/奈 达铂/奥沙利铂 5-Fu/卡培他滨/培美曲赛 紫杉醇/多西紫杉醇/长春瑞滨/长 春新碱/多西他赛/卡巴他赛
化疗药 物
吉西他滨 依托泊苷 阿霉素/脂质体多柔比星 丝裂霉素 替莫唑胺 卡莫司汀/司莫司汀/洛莫司汀
检测靶点 ERCC1; BRCA1 XRCC1(2项); ERCC1; ERCC2; GSTP1; GSTM1; MRP2 TS MTHFR; TS; GSTP1 TUBB3; STMN1; Tau GSTP1; GSTM1; GSTT1 RRM1 RRM1 TOP2A MDR1 TOP2A MDR1; GSTP1; GSTM1; GSTT1 NQO1 MGMT, ERCC2 MGMT MDR1 ERCC1; ERCC2
样本溶血及结块不能用于CTC检测！
送检样本要求
基因表达类
肿瘤分子诊断 基因突变/多态性类 CTC
手术组织/活检组织/石蜡切片/蜡块
全血/手术组织/活检组织/石蜡切片
外周血7.5mL，专用的Cellsave管
结
语
肿瘤个体化用药是发展趋势
肿瘤个体化用药分子靶标及靶向药物开发的关 联研究越来越多 部分基因检测近年已逐步在临床推广
RRM1 mRNA
No. Patients
Median Survival
P
<1.4
>1.4
8
8
15.5 mos
6.8 mos
0.0028
ERCC1表达与铂类药物疗效相关 的临床数据
ERCC1低表达患者，能从铂类辅助化疗中获益.
BRCA1/2表达与铂类药物疗效 相关的临床数据
BRCA1过度表达
•铂类耐药的预测因子 •抗微管类药物的敏感因子
基因EGFR热点突变位点
•EGFR主要突变在：外显子18，19，20，21 •耐药突变：T790M
靶向药物西妥昔单抗靶标——K-ras基因检测
NCCN明确指出西妥昔单抗（爱必妥）用药 之前须检测K-ras基因突变检测； 野生型 突变型 K-ras突变型患者并不能从抗EGFR治疗（爱 必妥）中获益,反而徒增不良反应危险和治 疗费用； 中国人群中K-ras基因突变率15% ！ 15%的病人不应该使用爱必妥！
•化疗后CTC数量少于阈值的患者无进展生存期和总生 存期明显高于CTC数量大于阈值的患者。 •化疗前后CTC数量都少于阈值 的患者无进展生存期和 总生存期明显高于只有一次测出CTC数量少于阈值的患 者。
乳腺癌阈值5，结直肠癌阈值3，前列腺癌阈值5
为什么要选择使用CTC系统?
唯一的标准化，自动化循环肿瘤细胞计数系统 具可重复性和高敏感度 系统最低检测限度：7.5ml外周血中的1个肿瘤细胞 临床意义
5% +++ +
1% +++ -
0.01% -
耗时 >6h 1.5h >6h
费用 低 中等 中等
+++
+++
+/-
-
-
<2h
中等
测序技术发展历程
Ion Semiconductor Sequencing
（2011）
Next-Gen Sequencing （2005以后） Sanger Sequencing （1977）
一个PCR体系中：1对引物，1条探针
每个位点需要做至少两管PCR扩增！！！
应用：对微量突变进行检测。
SNP位点检测应用
EGFR基因突变检测方法灵敏度的比较
检测方法/ 100% 检测灵敏度 直接测序法 +++ Taqman+++ ARMS® 焦磷酸测序 +++ 法 Taqman QPCR技术
50% ++ +++ ++
预测无进展生存期和总生存期
转移性癌症的监护 疗效监控
复查（早于影像学发现疾病进展情况）
CTC检测样本
使用CellSave储存管采集静脉血液 标本10ml 轻轻颠倒8次，防止凝块 样本室温条件(15-30摄氏度)下96小 时之内接受处理
接受阿霉素治疗的患者给药之后，
至少需要等待7天 术后15天以后
DAPI （细胞核染料）
CD45 （白细胞表面抗原）
+
Anti-EpCAM磁珠 Anti-CD45 变藻蓝蛋白 CD45 Nucleus DAPI (APC)
EpCAM
Nucleus
DAPI CK
Anti-CK-PE 藻红蛋白 (PE)
CTC
白细胞
CTC数量与无进展生存期和总生存期的关系
3
HER2基因检测
——乳腺癌患者预后指标及曲妥珠单抗治疗的 靶点 ——胃癌曲妥珠单抗靶向治疗的靶点
FDA 2013年关于胃癌HER2检测流程建议
ASCO/CAP2013指南关于乳腺癌HER2检测推荐：
IHC检测HER2蛋白表达水平 FISH检测HER2基因扩增
靶向药物敏感性解决方案
药物名称 贝伐单抗 西妥昔单抗 厄洛替尼 检测靶点 K-ras(2项); B-raf; PIK3CA(2项) EGFR(Exon18/19/20/21); K-ras(2项) ; B-raf 检测内容 VEGFR mRNA表达水平，1项 基因突变，5项 基因突变，7项 EGFR mRNA表达水平，1项
检测内容 mRNA水平，2项 基因多态性，7项 mRNA水平，1项 基因多态性，3项 mRNA水平，3项 基因多态性，3项 mRNA水平，1项 基因多态性，1项 mRNA水平，1项 基因多态性，1项 mRNA水平，1项 基因多态性，4项 基因多态性，1项 mRNA水平，2项 甲基化水平，1项 基因多态性，1项 mRNA水平，2项
转移
转移
循环肿瘤细胞（CTC）检测
(Circulating Tumor Cell) 全球唯一一个获得FDA和SFDA认证的循环肿瘤细胞检测 系统
强生CellSearch系统国内注册情况
如何鉴别出CTC?
在CellSearch®检测中，CTC 被设定为： EpCam （上皮来源细胞表面抗原） CK-8,18 和/或19 （肿瘤细胞表面抗原） + +
方法：
2条正向引物（针对正
常DNA，突变DNA）
1条反向引物
2个平行的PCR反应
普通PCR仪
TaqMan-ARMS技术
TaqMan-ARMS探针技术基于实时PCR平台，结合了 ARMS突变富集和Taqman-MGB特异性荧光检测两种技术。
Taqman-MGB：针对SNP位点特异性扩增的探针，可区分一个碱基的突变。
胃肠间质瘤
格列卫（Gleevec）
C-kit第11外显子突变/PDGFR突变
慢性粒细胞白 血病
格列卫（Gleevec） 达沙替尼(Dasatinib) 尼罗替尼(Nilotinib)
ABL
骨髓/全血
无T315I突变
乳腺癌
拉帕替尼（ Lapatinib） 赫塞汀
PI3K Her-2
手术/穿刺/内镜 活检/血浆 病理切片
TS高表达影响氟类和培美曲塞药效
• 低TS mRNA水平的肿瘤 患者接受氟类化疗的效 果较好，中位生存期较 长。 • TS低表达的患者对培 美曲赛的疗效好。
Shirota Y et al. J Clin Oncol. 2001;19:4298-304
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TUBB3高表达对紫杉醇和长春碱类不敏感
• TUBB3阳性表达是抗微管类药物敏感预测因子
Ion Torrent半导体测序原理
Ion Torrent半导体测序平台及芯片
PI芯片：sequence exomes and whole transcriptomes（5Gb）
目前成熟的肿瘤分子靶向药物敏感性基因检测
肿瘤类型 靶向药物 易瑞沙（Iressa） 特罗凯（Tarceva） 非小细胞肺癌 克唑替尼 EML4ALK融合 C-Kit PDGFRA 手术/穿刺/ 胸腹水 手术/穿刺/内镜 活检/血浆 阳性 基因 EGFR KRAS 样本 手术/穿刺/ 胸腹水/血浆 疗效佳的情况 EGFR突变/KRAS野生