氯沙坦对高糖诱导NRK-52E细胞结缔组织生长因子及E钙黏蛋白表达作用研究

氯沙坦对高糖诱导NRK-52E细胞结缔组织生长因子及E钙黏蛋白表

达作用研究

摘要目的：探討氯沙坦对高糖诱导大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK-52E 结缔组织生长因子（CTGF）抑制作用。方法：作用72小时后，Western blot检测空白组（0mmol/L葡萄糖）、正常葡萄糖组（5mmol/L葡萄糖）、高糖干预组（25nmol/L葡萄糖）、氯沙坦干预组（10nmol/L氯沙坦）、氯沙坦高糖干预组（10nmol/L氯沙坦预处理后在高糖培养）中CTGF及E钙黏蛋白在NRK-52E细胞表达。细胞ROS含量应用CM2H2DCFDA试剂盒检测。结果：高浓度葡萄糖上调CTGF表达，下调E钙黏蛋白表达，ROS含量显著上升。应用氯沙坦干预后可以下调高糖CTGF表达，上调E钙黏蛋白表达、细胞ROS含量下降。结论：氯沙坦可抑制高糖诱导NRK-52E细胞CTGF表达。

关键词高糖NRK-52E细胞结缔组织生长因子氯沙坦

结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）是即刻早期基因CCN家族的成员之一。CTGF与细胞外基质相互作用，可调节细胞间的粘附迁移、促进有丝分裂的发生、细胞活化和参与血管的生成。CTGF的表达水平与糖尿病多种组织纤维化的发生进展、血管生成及其预后密切关联［1～4］。E钙黏蛋白作为常见调控细胞间黏附能力的调控因子，直接参与着肾小管上皮细胞转分化作用。肾小管上皮细胞转分化是糖尿病肾病纤维化重要病理基础。目前发现高糖主要通过诱导CTGF的表达从而对肾小管导管上皮细胞促进其转分化为纤维化细胞的作用［5］。但血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂作为糖尿病肾病首选药物，对在不同状态葡萄糖的条件下转分化作用如何，有待于深入研究。因此，本实验将观察不同条件葡萄糖状态及氯沙坦干预下大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK-52E中CTGF及E钙黏蛋白表达，同时观察NRK-52E细胞ROS含量情况，以阐明氯沙坦对不同葡萄糖条件对肾小管导管上皮细胞CTGF及E钙黏蛋白的影响。

资料与方法

细胞培养：大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK-52E购自中科院细胞库，培养基配备为DMEM培养液（GIBCO公司）基本配备为含加入10ml进口胎牛血清（Sigma，USA）、1ml双抗（青、链霉素各100U/ml）、1mmol/L EDTA。每周传代2～3次。

实验分组与处理：分组为：①空白对照组（control）：无糖培养基未进行干预。②正常葡萄糖组（5MM glu）：含5mmol/L葡萄糖DMEM培养基培养。③高糖组（25MM glu）含25mmol/L葡萄糖DMEM培养基培养。④氯沙坦干预组（Losartan）：无糖培养基应用10nmol/L氯沙坦（购置于Sigma公司）干预。⑤氯沙坦高糖干预组（Losartan+25MM glu）：经应用10nmol/L氯沙坦预处理3天后，含25mmol/L的DMEM培养基培养。所有分组均在37℃，5% CO2条件下培养72小时。

Western blot检测蛋白表达：进行常规细胞裂解获取蛋白后，与预染蛋白marker一起上样，经分离胶和浓缩胶进行SDS-PAGE电离，完毕后将蛋白质电转印到PVDF膜上，将膜放入含100g/L脱脂奶粉的TBST中封闭，4℃过夜，然后与一抗（CTGF及E钙黏蛋白均购置美国Santa cruz公司）分别按1:75的比例孵育室温90分钟，用TBST液洗膜5分钟，洗3次，PVDF膜别与辣根过氧化物酶标记的相应二抗（1:1000）室温孵育45分钟后，用TBST液洗膜3次，每次5分钟。用ECL显色试剂盒显示目的条带。

统计学处理方法：所有试验均重复3次以上，Western blot图片检测采用Gel.Doc-It imaging system扫描分析仪扫描凝胶图谱，采用Total Lab分析软件对条带进行密度扫描分析。统计学处理采用SPSS11.5统计软件，采用One-Way ANOV A-SNK法比较总体和组间差异。

结果

不同葡萄糖状态及氯沙坦干预条件诱导NRK-52E细胞株中各种转分化标记物表达影响，Westernblot结果应用图片分析软件分析各组凝胶密度后，提示对比空白组及正常葡萄糖组，高糖能显著上调CTGF表达（P值均＜0.01）、下调E 钙黏蛋白表达（P值均＜0.01）。应用氯沙坦预处理后，高糖组CTGF表达下调（P＜0.05）、E钙黏蛋白表达上调（P＜0.05）。

不同条件下诱导NRK-52E细胞株ROS含量影响结果提示高糖能显著促进ROS含量水平升高。氯沙坦能显著降低高糖的ROS含量（P值均＜0.01）。

讨论

本研究发现，在不同浓度葡萄糖分别作用72小时后，高糖组CTGF表达显著高于正常葡萄糖及空白对照组、E钙黏蛋白低于正常葡萄糖组及对照组（P＜0.01）。CTGF及E钙黏蛋白在肾脏纤维化形成过程中的作用机制已经得到了深入的研究，认为可以促进转分化因子-β1表达，从而诱导细胞转分化为含α-平滑肌激动蛋白（α-SMA）细胞［6］。故此，本研究中CTGF表达在高糖状态表达上调，E钙黏蛋白表达下调提示高糖可通过CTGF作用抑制E钙黏蛋白表达，从而显著促进NRK-52E转分化。而经过氯沙坦干预处理后，高糖中NRK-52E细胞CTGF表达下调，结合Ren等研究发现，血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂Irbesartan能显著抑制CTGF及α-SMA表达，说明氯沙坦可能具有抑制NRK-52E细胞转分化作用。

为进一步阐明高糖对于肾小管导管上皮细胞转分化作用影响，本研究将观察在不同葡萄糖条件及氯沙坦干预NRK-52E细胞株ROS含量，结果发现，高糖NRK-52E细胞ROS含量均显著升高，但应用氯沙坦干预后能显著降低ROS含量，也进一步证实了氯沙坦同样具有抗氧化作用，是NRK-52E细胞免于转分化的主要保护因素。

参考文献

1 Jaffa AA,Usinger WR,McHenry MB,et al.Connective tissue growth factor and susceptibility to renal and vascular disease risk in type 1 diabetes［J］.J Clin Endocrinol Metab,2008,93（5）:1893-1900.

2 Aragno M,Mastrocola R,Alloatti G,et al.Oxidative stress triggers cardiac fibrosis in the heart of diabetic rats［J］.Endocrinology,2008,149（1）:380-388.

3 Kuiper EJ,van Zijderveld R,Roestenberg P,et al.Connective tissue growth factor is necessary for retinal capillary basal lamina thickening in diabetic mice［J］.J Histochem Cytochem,2008,56（8）:785-792.

4 Thomson SE,McLennan SV,Kirwan PD,et al.Renal connective tissue growth factor correlates with glomerular basement membrane thickness and prospective albuminuria in a non-human primate model of diabetes:possible predictive marker for incipient diabetic nephropathy［J］.J Diabetes Complications,2008,22（4）:284-294.

5 Nguyen TQ,Tarnow L,Jorsal A,et al.Plasma connective tissue growth factor is an independent predictor of end-stage renal disease and mortality in type 1 diabetic nephropathy［J］.Diabetes Care,2008,31（6）:1177-1182.

6 Yokoi H,Mukoyama M,Mori K,et al.Overexpression of connective tissue growth factor in podocytes worsens diabetic nephropathy in mice［J］.Kidney Int,2008,73（4）:446-455.