拟鲶高原鳅黄河和大通河种群的遗传多样性和分化水平研究

拟鲶高原鳅黄河和大通河种群的遗传多样性和分化水平研究晁燕;申志新;王国杰;杨成;祁得林
【摘要】[Objective] The research aimed to investigate the genetic diversity and differentiation of T. Siluroides populations from Yellow River and Daitong River. [ Method] The complete sequences of the mitochondrial cytochrome b gene of T. Siluroides were obtained by using of PCR and DNA sequencing. [ Result ] The complete sequences of Cyt 6 gene (1140 bp) were obtained from forty seven individuals of T. Siluroides, representing two populations from Yellow River and Daitong River, and a total of 12 haplotypes were identified. The genetic diversity of population from Yellow River was low than that of population from Daitong River. [ Conclusion ] The decline in genetic diversity of T. Siluroides population maybe related to human activities and introduction of exotic fishes. The significant genetic differentiation between populations from Yellow River and Daitong River suggested that the two populations should be managed and preserved separately.%[目的]探究拟鲶高原鳅(Triplophysa siluroides)黄河种群与大通河种群的遗传多样性和分化水平.[方法]采用聚合酶链式反应(PCR)和直接测序方法获得拟鲶高原鳅线粒体DNA( mtDNA)细胞色素b(Cyt b)基因的全序列.[结果]拟鲶高原鳅2个种群共47个个体均获得Cyt b基因的全长序列(1140 bp),共定义了12个单倍型.拟鲶高原鳅黄河种群遗传多样性低于大通河种群.[结论]人类活动的影响和引入外来种可能引起了拟鲶高原鳅黄河种群遗传多样性的下降；同时,拟鲶高原鳅黄河种群和大通河种群间存在显著的分化,建议在实践中应将2种群分开管理和保护.
【期刊名称】《安徽农业科学》
【年(卷),期】2011(039)023
【总页数】3页(P14139-14140,14212)
【关键词】拟鲶高原鳅;线粒体细胞色素b基因;遗传多样性;种群分化
【作者】晁燕;申志新;王国杰;杨成;祁得林
【作者单位】青海大学农牧学院动物科学系,青海西宁810016;青海省渔业环境监测站,青海西宁810012;青海省渔业环境监测站,青海西宁810012;青海省渔业环境监测站,青海西宁810012;青海大学农牧学院动物科学系,青海西宁810016
【正文语种】中文
【中图分类】S965
拟鲶高原鳅（Triplophysa siluroides）隶属于鳅科（Cobitidae）条鳅亚科（Nemacheilinae）高原鳅属（Triplophysa），主要分布于黄河上游的干支流和附属湖泊中，由于其对青藏高原极端环境独特的适应性，以及其肉味鲜美细嫩等原因而在高原渔业发展中具有重要意义［1］。

但是，关于拟鲶高原鳅以往的研究主要集中于传统分类学、生物学特性等方面［1-4］，而在种群遗传多样性和分化方面的研究还未见相关报道。

为此，笔者通过PCR扩增和直接测序方法获得拟鲶高原鳅线粒体DNA（mtDNA）细胞色素b（Cyt b）基因的序列全长，分析拟鲶高原鳅黄河和大通河种群间的遗传多样性和分化程度，旨在为拟鲶高原鳅种质遗传资源的客观评价、种质资源保护和合理开发利用提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 材料拟鲶高原鳅样本采集于黄河上游龙羊峡和青海省门源县大通河（表1）。

野外采样时，取肌肉或者鳍组织，暂时保存于 -20℃车载冰箱或液氮中，带回实验室后于-70℃下保存备用。

1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取。

取肌肉或鳍组织20 mg左右，肌肉置于干净、灭菌
的玻璃板上切碎，鳍组织置入灭菌研钵中研磨;然后转入1.5 ml离心管中，用常规SDS/蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提、乙醇沉淀总DNA;获得的DNA经空气干燥后
加入适量无菌ddH2O溶解，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，估计DNA浓度后4℃
保存备用。

表1 采样点以及样本信息Table 1 Information of samples and their localities 种群Population采集地点Collection location水系Drainage物种/种群代码Species/Population Code样本量/GenBank登录号Sample size/GenBank accession No.外群马口鱼AY646648 Outgroup种群1 青海龙羊峡黄河TSLYX 27 Population 1种群2 青海门源大通河 TSDTH 20 Population 2
1.2.2 PCR扩增和测序。

拟鲶高原鳅Cyt b基因全序列PCR扩增采用1对通用引物L14724:5＇-GACTTGAAAACCACCGTTG-3＇和 H15915:5＇-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3＇，由上海生工生物工程技术服务有限公司
合成。

PCR扩增反应体系30 μl，包括 1.0 U TaKaRa EX Taq（TaKaRa），2.5 mmol/L dNTPs 1.0 μl，10 × Taq Buffer（TaKaRa，含 Mg2+）3.0 μl，10 mmol/L 引物各0.5 μl，模板DNA 0.2 μg，最后加入ddH2O补齐30 μl。

PCR
扩增程序及检测与祁得林的方法［5］相同，扩增产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.3 数据处理序列的比对排序采用CLUSTAL X和DNA STAR软件包的 Editseq 5.0及MegAlign 5.0软件（DNASTAR Inc.）。

用MEGA 3.1软件分析核苷酸的
组成、变异位点和序列间的碱基差异，并构建邻接（NJ）系统发育进化树。

用DnaSP 4.0软件计算种群的单倍型多样度（Haplotype diversity，h）和核苷酸多样度（Nucleotide diversity，π）。

用 Arlequin 3.1软件中的AMOVA方法分析拟鲶高原鳅的种群分化程度。

2 结果与分析
2.1 拟鲶高原鳅种群的序列特征和单倍型分布研究中，拟鲶高原鳅2个种群共
47个个体均获得Cyt b基因的全长序列（1 140 bp）。

经比对后发现，在1 140个位点中存在17个变异位点（1.49%），其中包括8个简约性位点（Parsim-
info sites）和9个单突变位点（Singleton sites）。

所有变异位点均为转换、无
颠换，发生在密码子第3位的变异位点占88.2%（15个），第1位的占11.8%（2个），第2位无变异。

拟鲶高原鳅Cyt b基因序列碱基组成分析显示:A、T、
C和G碱基平均含量分别为26.4%、32.0%、25.3%和16.3%，其中A+T含量（58.4%）明显高于G+C含量（41.6%），表现出明显的反G偏倚。

拟鲶高原鳅47个个体共定义了12个单倍型，单倍型在2个种群中的分布见表2。

在所有单倍型中，只有Hap-2由黄河和大通河2个种群所共有，其余均为种群特有单倍型。

表2 拟鲶高原鳅Cyt b单倍型在2个种群中的分布Table 2 The distribution of cytochrome b gene haplotypes of Triplophysa siluroides in two populations种群Groups Haplotype distribution Hap-1 Hap-2 Hap-3
Hap-4 Hap-5 Hap-6 Hap-7 Hap-单倍型分布8 Hap-9 Hap-10 Hap-11 Hap-12 TSLYX 18 2 7 TSDTH 7 2 2 3 1 1 1 1 1 1
2.2 拟鲶、高原鳅种群遗传多样性和分化水平种群遗传多样性分析显示，拟鲶高原鳅黄河种群的单倍型多样度（h）为0.50±0.09，核苷酸多样度（π）为0.000
8±0.000 6;大通河种群的单倍型多样度（h）为0.86±0.06，核苷酸多样度（π）
为0.003 6±0.002 1。

AMOVA分析显示，拟鲶高原鳅的遗传变异源自种群内的占54.48%，而黄河和大通河种群之间的变异占45.52%，固定系数FST=0.462 7（P＜0.001），表明2
个种群间存在显著的分化（表3）。

表3 拟鲶高原鳅种群分子变异分析Table 3 Analysis of molecular variance among populations of Triplophysa siluroides变异来源Source of variation
自由度df平方和Sum of squares变异组分Variance components变异百分比∥%Percentage of variation种群间Among population 1 22.28 0.921 6 45.52种群内Within population 45 49.64 1.103 0 54.48总体Total 46 71.92 2.024 6
2.3 拟鲶高原鳅种群的系统发育关系以马口鱼（Opsariichthys bidens）为外群构建的邻接系统发育树显示，虽然来自2个种群的单倍型没有严格按照水系形成
相应的族群，但是还是呈现了一定的规律，即来自黄河水系的3个单倍型和1个
共享单倍型聚在一起（图1）。

3 结论与讨论
该研究中，拟鲶高原鳅黄河和大通河2个种群的47个个体中共检测到12个单倍型，其中采集于黄河龙羊峡的种群表现出偏低的单倍型多样度和核苷酸多样度，明显低于长江水系其他鲤科鱼类的单倍型多样度和核苷酸多样度［6-7］，而采集于大通河水系的种群具有较高的单倍型多样度和核苷酸多样度，与祁得林［5］在黄河花斑裸鲤中的研究结果相一致。

其主要原因在于祁得林在花斑裸鲤研究中所采集的样本集中于黄河龙羊峡上游，而该研究中拟鲶高原鳅黄河种群采集于龙羊峡库区。

近几十年来，不但在龙羊峡建成水电站1座，同时引进多种外来鱼（如西伯利亚
高白鲑、虹鳟鱼和池沼公鱼等），大力发展库区渔业生产，其结果使拟鲶高原鳅栖息水域饵料资源、产卵场等环境条件受到了不同程度的影响，致使库区以及下游鲶
高原鳅种群遗传多样性明显降低。

与其相反，大通河位于青海省东北部，由于其特殊的地理位置而几乎没有受到人类活动的影响，为拟鲶高原鳅的栖息繁衍提供了良好的环境条件，因此拟鲶高原鳅大通河种群较黄河种群表现出更丰富的遗传多样性，同时也为种群的发展奠定了良好的基础。

图1 拟鲶高原鳅4个种群Cyt b单倍型的邻接（NJ）系统发育树Fig.1 NJ tree
of Triplophysa siluroides inferred from Cyt b haplotypes among four populations注:单倍型代码同表2，节点上数据表示支持率。

Note:Haplotype codes are the same as.Table 2;the number on the node stards for support percentage.
一般而言，物种遗传多样性和物种完整性的保护在于客观鉴别物种的关键遗传单元（Critical genetic units），然后采用适当的方式管理这些单元［8-9］。

该研究中，AMOVA分析显示，拟鲶高原鳅黄河种群和大通河种群间存在显著的分化，
同时系统发育分析结果也支持了以上结论。

鉴于黄河和大通河在地理上相互隔离以及目前拟鲶高原鳅种群数量急剧下降的趋势，以及随着时间的推移各种群将不断积累具有种群特性的遗传变异，进而可能会演化成进化显著单元，建议在实践中应将2个种群分开管理和保护。

参考文献
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