第五章目的基因的制备1
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目的基因的制备基因文库法ppt课件
组织或细胞染色体DNA 限带的所有基 因组DNA片段的集合.
克隆载体 重组DNA分子
受体菌 含重组分子的转化菌
genomic library
每个细胞含有一个基因组 DNA片段与载体的重组DNA分 子，许多细胞组成一个含有基 因组的色概率基因 该种生物所有基因 应用范围 ◆ 基因原始结构功能的研究 ◆ 对比分析内含子、外显子及调控区域 ◆ /46
逆转录
以单链RNA为模板合成双链DNA的反应。
DNA mRNA
14/46
逆转录病毒细胞内的逆转录现象：
RNA 模板 逆转录酶
RNA酶
DNA-RNA 杂化双链
Байду номын сангаас
单链DNA
双链DNA
逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样具
有遗传物质的传代与表达功能。
15/46
逆转录酶的应用:
应用于基因工程
基因
mRNA 蛋白质多肽链
7/46
2.经验值
Transcription 从cDNA中获得的是经过剪切去除内含子的基因。
ln(1－P)
start codon Plasmid or phage
N=
非翻译区的序列特征对基因的表达具有重要的调控作用，编码序列则是合成基因产物—蛋白质模板。
ln(1－f/g) 某细胞的mRNA分子数为500 000，某个丰度为3500拷贝/细胞的mRNA基因，最小值为500 000/3500=143，丰度为14拷贝/细胞的mRNA
58330
人
3.2×109
320000
1473652
128000
589459
71111
327476
10/46
食品微生物学---第五章_微生物的遗传变异
烟草花叶病毒的拆开与重建实验 （部分病毒为RNA）
1.经典转化实验（肺炎双球菌）
S型菌株：有致病性，菌落表面光滑，有荚膜 R型菌株：无致病性，菌落表面粗糙，无荚膜
（1）动物实验 对小鼠注射活R菌或死S菌 ————小鼠存活 对小鼠注射活S菌————————小鼠死亡 对小鼠注射活R菌和热死S菌 ———小鼠死亡
（二）微生物的诱变育种
1.出发菌株选择：对诱变剂敏感、变异幅度广、产量高 的菌株。
2.同步培养：使菌悬液中细胞达到同步生长状态 3.单细胞悬液制备：先收集菌体并洗涤，然后用生理盐
水或缓冲液配制，振荡使分散度90％以上。 4.诱变处理：物理诱变、化学诱变 5.中间培养 ：使细胞内原有酶量稀释，以得到纯的变
h
36
普遍性转导过程： 噬菌体侵染供体细胞 供体染色体断裂，
噬菌体蛋白质衣壳和DNA合成 衣壳包裹供体 DNA片段 侵染受体菌株
供体DNA片段整合到受体DNA上——完全转导
供体DNA片段不能整合到受体 DNA上，也不能复制，但能表达 ——流产转导
特异性转导过程： 噬菌体侵染供体细胞 供体细胞溶源化 噬菌体和供体菌染色体间发生交换 转导型 噬菌体（转导颗粒） 侵染受体菌
R菌＋S菌 只有R菌
只有S型细菌的DNA才能将R型转化为S型。且 DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转 移给R型菌株的，是遗传因子。
2.噬菌体感染实验
h
8
85
3.植物病毒的拆开与重建实验
将TMV拆成蛋白质外壳与RNA，分别对 烟草进行感染试验，结果只有RNA能感染 烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还 能分离出正常病毒粒子。
（2）细菌培养实验 热死S菌———不生长 活R 菌———长出R菌
1.经典转化实验（肺炎双球菌）
S型菌株：有致病性，菌落表面光滑，有荚膜 R型菌株：无致病性，菌落表面粗糙，无荚膜
（1）动物实验 对小鼠注射活R菌或死S菌 ————小鼠存活 对小鼠注射活S菌————————小鼠死亡 对小鼠注射活R菌和热死S菌 ———小鼠死亡
（二）微生物的诱变育种
1.出发菌株选择：对诱变剂敏感、变异幅度广、产量高 的菌株。
2.同步培养：使菌悬液中细胞达到同步生长状态 3.单细胞悬液制备：先收集菌体并洗涤，然后用生理盐
水或缓冲液配制，振荡使分散度90％以上。 4.诱变处理：物理诱变、化学诱变 5.中间培养 ：使细胞内原有酶量稀释，以得到纯的变
h
36
普遍性转导过程： 噬菌体侵染供体细胞 供体染色体断裂，
噬菌体蛋白质衣壳和DNA合成 衣壳包裹供体 DNA片段 侵染受体菌株
供体DNA片段整合到受体DNA上——完全转导
供体DNA片段不能整合到受体 DNA上，也不能复制，但能表达 ——流产转导
特异性转导过程： 噬菌体侵染供体细胞 供体细胞溶源化 噬菌体和供体菌染色体间发生交换 转导型 噬菌体（转导颗粒） 侵染受体菌
R菌＋S菌 只有R菌
只有S型细菌的DNA才能将R型转化为S型。且 DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转 移给R型菌株的，是遗传因子。
2.噬菌体感染实验
h
8
85
3.植物病毒的拆开与重建实验
将TMV拆成蛋白质外壳与RNA，分别对 烟草进行感染试验，结果只有RNA能感染 烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还 能分离出正常病毒粒子。
（2）细菌培养实验 热死S菌———不生长 活R 菌———长出R菌
分子生物学-第5章-分子生物研究法(上)精选全文完整版
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)
一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸 水解酶
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
分类: Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
命名
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae 自主 复制能力的 DNA分子（ vector），如 病毒、噬菌体 和质粒等小分 子量复制子都 可以作为基因 导入的载体。
1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处 理后，能有效地吸收λ噬菌体DNA。
1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细 胞同样能够摄取质粒DNA。
把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端（进行末端标记 实验或用来进行DNA的连接 在双链核酸的3'末端加上多聚单核苷酸
从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸
从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸 切除位于DNA链5'或3'末端的磷酸基团
1972 - Paul Berg,
Produced first recombinant DNA using
5.1 重组DNA技术回顾 5.2 DNA基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用 5.5 基因克隆技术 5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术
5.1 重组DNA技术回顾
三大成就 ：
1. 40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体 是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；
• 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒 或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之 进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续 稳定的繁殖和表达。
目的基因的制取
（四）化学合成法
DNA 合 成 仪 的 发 明 ， 使 人 工 合 成 DNA 成为一种常规技术。如果已知某基因的核苷 酸序列，或者基因产物的氨基酸序列，推导 出该多肽编码基因的核苷酸序列，就都可以 用化学方法合成该基因的核苷酸片段。人工 化学合成法一般合成200bp，如果基因较大， 可先合成若干个短DNA片段，再连接成一 个长的完整基因。
N E.coli=1.06×103 N人类= 6.9×105
有哪些可能的原因使一个基因在 DNA库中丢失？
假定这个基因在高拷贝数的载体上， 由于它的产物太多，而对宿主是有毒 的；
在部分消化中，某个基因中含有所用 酶的切点；
酶切位点离基因太远，结果由于DNA 片段太的总mRNA合成
单链酶法： 碱基GC比AT之间稳定性高。当用
加热或其他变性试剂处理DNA时，双 链上AT配对较多的部位先变成单链， 应用单链特异的S1核酸酶切除单链， 再经氯化铯超速离心，获得无单链切 口的DNA。
例如：海胆的rDNA含较多的G C碱基 对，在对海胆细胞的DNA加热处理时， 双链DNA上的A=T碱基对部分首先变 性，这部分局部地分开成为单链，而G C碱基对较多的部分在这一温度下仍保 持其双链状态，用专门作用于单链 DNA的S1核酸酶切去单链区段，再进 行密度梯度离心，要的克隆数目。
N：所需的重组载体数（克隆数） p: 包含了整个基因组DNA的概率（99%） f: 插入载体的DNA片段的平均长度占整个基因 组
DNA的百分数
G：Genome大小； f：fragment大小
较大的插入片段、较小的基因组可减少重组 体的数量。 例如：大肠杆菌和人类的基因组 分别是4.6×106bp、3×109bp，若插入DNA 片段的平均长度如果是20kb ,则
chap05 基因的克隆和分离
复杂、量大
多
5.3 目的基因的分离
5.3.1 功能克隆法
生化特征→功能蛋白
纯化→AA序列→cDNA
混合探针杂交
Designing oligonucleotide probes based on protein sequence
An isolated protein is digested with a protease, trypsin, which specifically cleaves peptide bonds on the C-terminus of Lys and Arg. The resulting peptides are separated, and several are partially sequenced from their N-terminus by Edman degradation. The determined sequences then are analyzed to identify the 6- or 7-aa region that can be encoded by the smallest number of possible DNA sequences. Because of the degeneracy of the codon, the 12-aa sequence (light green) shown here theoretically could be encoded by any of the DNA triplets below it, with the possible alternative bases at the same position indicated. The region with the least degeneracy for a sequence of 20-mer is indicated by the red bracket. There are 48 possible DNA sequences in this 20-base region that could encode the peptide sequence 39. Since the actual sequence of the gene is unknown, a degenerate 20-mer probe consisting of a mixture of all the possible 20-base oligonucleotides is prepared. If a cDNA is screened with this degenerate probe, the one oligonucleotide that is perfectly complementary to the actual coding sequence (blue) will hybridize to it.
第5章 目的基因制取
bank），是指汇集某一 基因组所有DNA 序列的重组 DNA 群体。 高等真核生物染色体基因组文 库通常是以λ噬菌体作为载体 构建的，有时也可以柯斯质粒 作为载体构建。
通常基因组DNA被超声波或内切酶 处理成随机处理成大小不同的片段， 这些片段和载体连接后制备成基因 组，用于测序、拼装。也称为 “鸟枪法”。
3 cDNA 法cDNA :是指汇集以某生物成熟mRNA 为模板逆转录而成 的cDNA 序列的重组D样大得多。 在真核生物基因组中合有大量的间隔序列或内含子，大肠杆 菌不能从真核生物基因的初级转录本中去除间隔序列，即不 能表达真核生物DNA 。而在真核生物成熟mRNA 中已不存在间 隔序列（已在拼接过程中被去除），以真核生物成熟mRNA 为 模板，逆转录而成的cDNA 可被大肠杆方法。
末端转移法（同聚物引导法）
利用末端转移酶在cDNA第一链3‘端加同聚核苷酸尾 巴（如多聚G），以多聚C为引物合成第二链（在多聚C 的5’端可以加入酶切位点，利于后续克隆操作）。
★克隆筛选方法 ：同基因组缺点： 由于克隆过程经多步分离、纯化，低丰度cDNA可能损 失，被克隆的几率很小（借助PCR解决，P177图） mRNA容易被部分降解，很难得到全长cDNA.（合成 全长cDNA)
CG AG C
array probes
C Mask 2
A
A ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ A A
Probe Synthesis
A 3×3 array
CG AC G
Nucleotide Deposition Sequence ACG
AC ACG AG
CG AG C
array probes
G Mask 3
A
A A A A
通常基因组DNA被超声波或内切酶 处理成随机处理成大小不同的片段， 这些片段和载体连接后制备成基因 组，用于测序、拼装。也称为 “鸟枪法”。
3 cDNA 法cDNA :是指汇集以某生物成熟mRNA 为模板逆转录而成 的cDNA 序列的重组D样大得多。 在真核生物基因组中合有大量的间隔序列或内含子，大肠杆 菌不能从真核生物基因的初级转录本中去除间隔序列，即不 能表达真核生物DNA 。而在真核生物成熟mRNA 中已不存在间 隔序列（已在拼接过程中被去除），以真核生物成熟mRNA 为 模板，逆转录而成的cDNA 可被大肠杆方法。
末端转移法（同聚物引导法）
利用末端转移酶在cDNA第一链3‘端加同聚核苷酸尾 巴（如多聚G），以多聚C为引物合成第二链（在多聚C 的5’端可以加入酶切位点，利于后续克隆操作）。
★克隆筛选方法 ：同基因组缺点： 由于克隆过程经多步分离、纯化，低丰度cDNA可能损 失，被克隆的几率很小（借助PCR解决，P177图） mRNA容易被部分降解，很难得到全长cDNA.（合成 全长cDNA)
CG AG C
array probes
C Mask 2
A
A ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ A A
Probe Synthesis
A 3×3 array
CG AC G
Nucleotide Deposition Sequence ACG
AC ACG AG
CG AG C
array probes
G Mask 3
A
A A A A
基因工程 第五章目的基因的获取
oligo(dT)引导的DNA合成法：
利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入1220个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶 合成cDNA的第一链。
3’AAAAAAA mRNA 5’ TTTTTTT cDNA 反转录酶 Oligo dT引物
5’
随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) ：
1）4bp的内切酶 平均每44（256）bp一个切点。
随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。
2）6bp的内切酶 平均每46（4096）bp一个切点。 ② 内切酶粘性末端 能与常用克隆位点相连。
（Sau3A—BamH I）
2. 机械切割法 （1）超声波
超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp 的随机片断。
同 一 限 制 酶 切 位 点 连 接
GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割
G CCTAG G CCTAG
Bam HⅠ切割反应
GATCC G 载体DNA用Bam HⅠ切割
+
GATCC G GATCC G
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
1. 优点 由于带有粘性末端，产物可以直接与载 体连接。 2. 缺点 目的基因内部也可能有该内切酶的切点。 目的基因也被切成碎片！
BamH I
BamH I
BamH I
gene
二、随机片断化 1. 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基 因组中的酶切位点只有一部分被随机 切开。 （1）限制性内切酶的选用原则 ① 内切酶识别位点的碱基数 影响所切出的产物的长度和随机程度。
利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入1220个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶 合成cDNA的第一链。
3’AAAAAAA mRNA 5’ TTTTTTT cDNA 反转录酶 Oligo dT引物
5’
随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) ：
1）4bp的内切酶 平均每44（256）bp一个切点。
随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。
2）6bp的内切酶 平均每46（4096）bp一个切点。 ② 内切酶粘性末端 能与常用克隆位点相连。
（Sau3A—BamH I）
2. 机械切割法 （1）超声波
超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp 的随机片断。
同 一 限 制 酶 切 位 点 连 接
GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割
G CCTAG G CCTAG
Bam HⅠ切割反应
GATCC G 载体DNA用Bam HⅠ切割
+
GATCC G GATCC G
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
1. 优点 由于带有粘性末端，产物可以直接与载 体连接。 2. 缺点 目的基因内部也可能有该内切酶的切点。 目的基因也被切成碎片！
BamH I
BamH I
BamH I
gene
二、随机片断化 1. 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基 因组中的酶切位点只有一部分被随机 切开。 （1）限制性内切酶的选用原则 ① 内切酶识别位点的碱基数 影响所切出的产物的长度和随机程度。
目的基因的制备
3) 免疫法分离编码特异性蛋白基因：核糖体 沿mRNA进行转译时产生多肽链，通过特异性抗 体与核糖体－mRNA－多肽链复合体结合，然后 分离纯化抗体－核糖体－mRNA－多肽链复合体， 获得特定基因的mRNA。 4)酶促反转录分离特定基因：在反转录酶的作 用下，合成双链DNA，获得一定大小的基因片 断。
•编码区： 翻译起始密码（ATG）：位于SD序列后4-9bp 多肽链编码区： 翻译终止密码（TAG，TGA,TAA）：某些基因后 面只有一个终止密码，某些基因后面有两个终止 密码.
•转录终止区
终止子：原核生物基因在转录终止前的一段提供 转录终止信号的DNA序列（Terminator）. 特点：回文结构，转录后可形成发夹状的结 构，从而使聚合酶减慢或停止前进. a）不依赖于终止因子的终止子（简单终止子） 含有寡聚T序列和一段富含GC的序列 b）依赖于终止因子（）的终止子.
SV40基因组的结构
2）重复基因
在某些生物基因组中，某些基因存在多个拷贝的 现象 * 真核生物基因组中组蛋白基因
3）加倍基因
同一细胞中至少含有两套完全或基本相同的基因
* 高等生物含有两倍以上的染色体 * 细菌质粒DNA * 蓝藻染色体
4）基因重排
在生物的发育过程中，同一基因簇中的基因在 不同的细胞中的排列顺序发生改变的现象.它与 细胞功能的分化及表达有关.
SDS-PAGE analysis of proteins translated by cell-free translation system. Lane 1: protein marker; Lane 2,without mRNA; Lane 3 to 7: translation products of total mRNA from mammalian cells
目的基因的名词解释_制备方法_制备流程
目的基因的名词解释_制备方法_制备流程目的基因的名词解释把需要研究的基因称为目的基因。
(一般把需要分析的基因称靶基因，在基因克隆过程中有时两者均称为插入基因，有时三者含义相近。
所以有时有些书本上也笼统的称“用限制性核酸内切酶切割目的基因(靶基因)”)。
目的基因的制备方法从细胞核中直接分离简单的原核生物目的基因可从拟核中直接分离得到，但人类的基因分布在23对染色体上，较难从直接法中得到。
直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。
这种方法有如用猎枪发射的散弹打鸟，无论哪一颗弹粒击中目标，都能把鸟打下来。
鸟枪法的具体做法是：用限制酶(即限制性内切酶)将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞所提供的DNA(外源DNA)的所有片段分别在受体细胞中大量复制(在遗传学中叫做扩增)，从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来。
如许多抗虫，抗病毒的基因都可以用上述方法获得。
用“鸟枪法”获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。
染色体DNA的限制性内切酶酶解II型限制性内切酶可专一性地识别并切割特定的DNA顺序，产生不同类型的DNA末端。
若载体DNA与插入的DNA片段用同一种内切酶消化，或靶DNA与载体DNA末端具有互补的粘性末端，可以直接进行连接。
DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。
当限制酶在识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平末端。
人工体外合成简短的目的基因可在了解DNA一级结构或多肽链一级结构氨基酸编码的核苷酸序列的基础上人工合成。
用逆转录酶制备cDNA大多数的目的基因是由mRNA合成cDNA(反转录DNA)得到。
从RNA入手，先从细胞提取总RNA，然后根据大多数真核mRNA含有多聚腺嘌呤(polyadenylic acid ,polyA)尾的特点，用寡聚dT纤维素柱将mRNA分离出，以mRNA为模板，在多聚A尾上结合12-18个dT 的寡聚dT片段，作为合适的起始引物，在逆转录酶作用下合成第一条。
第五章目的基因的获取
的基因流程
目的标签法、非目的标签法
五、图位克隆（mapbased cloning）获 得目的基因
图位克隆：又叫定位克隆，1986年首先由剑
桥大学的Alancoulson提出。
根据目的基因在染色体上的位置进行分离基因，
无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先
六、mRNA差别显示技术（mRNA differential display）获得差异表达的基因
mRNA差别显示技术：对组织特异性 或诱导专一性表达基因进行分离的有效方 法之一。将mRNA逆转录和PCR技术相 互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技 术，也称为DDRT-PCR，
DDRT-PCR理论基础
3’ 5’
template templat因库（gene pool）：特定生物体全基因组的
集合（天然存在）e bank） 通过克隆的方法将某一基因组DNA或mRNA 保存于适当宿主菌中形成的转化子群。所有重 组DNA组合代表该基因组的全序列。
探针：目的基因局部片段、由氨基酸序列
获得的简并序列、近缘物种的同源序列
四、转座子标签法获得目的基因
（一）转座子的相关知识
转座子（transposon,Tn）:指位于染色体上
可以从基因组的一个位置转移到另一个位置的 DNA片段或基因。（jumping gene）
简单转座子：除转座所需基因外不携带任何
实验结果： 240组在能分出20000多条带！ 如果每条带相当于一种特定mRNA， 20000 mRNA基本上反映了一种特定细 胞中全部的mRNA。
DDRT-PCR操作步骤
*差异分离目的基因程序
利用两组细胞mRNA经过DDRT-PCR
后，分析比较cDNA种类的差异，分别回收 cDNA测序隆新基因。
目的标签法、非目的标签法
五、图位克隆（mapbased cloning）获 得目的基因
图位克隆：又叫定位克隆，1986年首先由剑
桥大学的Alancoulson提出。
根据目的基因在染色体上的位置进行分离基因，
无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先
六、mRNA差别显示技术（mRNA differential display）获得差异表达的基因
mRNA差别显示技术：对组织特异性 或诱导专一性表达基因进行分离的有效方 法之一。将mRNA逆转录和PCR技术相 互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技 术，也称为DDRT-PCR，
DDRT-PCR理论基础
3’ 5’
template templat因库（gene pool）：特定生物体全基因组的
集合（天然存在）e bank） 通过克隆的方法将某一基因组DNA或mRNA 保存于适当宿主菌中形成的转化子群。所有重 组DNA组合代表该基因组的全序列。
探针：目的基因局部片段、由氨基酸序列
获得的简并序列、近缘物种的同源序列
四、转座子标签法获得目的基因
（一）转座子的相关知识
转座子（transposon,Tn）:指位于染色体上
可以从基因组的一个位置转移到另一个位置的 DNA片段或基因。（jumping gene）
简单转座子：除转座所需基因外不携带任何
实验结果： 240组在能分出20000多条带！ 如果每条带相当于一种特定mRNA， 20000 mRNA基本上反映了一种特定细 胞中全部的mRNA。
DDRT-PCR操作步骤
*差异分离目的基因程序
利用两组细胞mRNA经过DDRT-PCR
后，分析比较cDNA种类的差异，分别回收 cDNA测序隆新基因。
《目的基因的制备》课件
表达
让目的基因在目标生物体 中得到表达，产生所需的 蛋白质或产物。
常用的制备方法
1
PCR法
通过聚合酶链式反应扩增目的基因，需设计引物与模板DNA配对。
2
连接法
通过连接酶催化，将目的基因与载体DNA连接，形成重组DNA。
3
重组法
利用重组酶切割DNA，然后将目的基因嵌入到载体DNA中。
PCR法的制备步骤
重组法的制备步骤
1. 将目的基因和载体DNA以及重组酶一起反应。 2. 重组酶切割DNA，使目的基因与载体DNA形成黏性末端。 3. 将目的基因嵌入载体DNA中，即形成重组DNA。 4. 将重组DNA转化入宿主细胞，进行表达。 5. 检测表达产物的功能和纯度。
目的基因的应用
科学研究
目的基因的制备使得科学家可 以深入研究细胞、生物体和人 类基因等重要领域。
1. 设计引物，使其与目的基因的序列互补。 2. 提取模板DNA。 3. 设置PCR反应体系，包括引物、酶、酶缓冲液等。 4. 进行PCR扩增，包括变性、退火、延伸等步骤。 5. 检测PCR产物的纯度和大小。
连接法的制备步骤
1. 准备目的基因、载体DNA和连接酶。 2. 将目的基因与载体DNA进行切割，暴露黏性末端。 3. 用连接酶将目的基因与载体DNA连接。 4. 转化连接产物入宿主细胞，形成重组DNA。 5. 筛选含有目的基因的克隆，进一步分析。
医学研究
目的基因的制备有助于研究疾 病发生机制、疾病基因与药物 治疗的关系，推进医学进步。
农业应用
通过改良作物品种，提高产量 和抗病能力，目的基因的制备 对农业发展具有重要意义。
常见问题及解决方法
1 降低质量
使用高质量的试剂和操作规范可以减少目的基因制备过程中的质量问题。
基因工程原理练习题及其答案
基因工程复习题题型：名词解释（10个）30分；填空（每空1分） 20分；选择题（每题1分）10分；简答题（4个）20分；论述题（2个）20分。
第一章绪论1.名词解释：基因工程：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。
遗传工程广义：指以改变生物有机体性状为目标，采用类似工程技术手段而进行的对遗传物质的操作，以改良品质或创造新品种。
包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程和基因工程等不同的技术层次。
狭义：基因工程。
克隆：无性(繁殖)系或纯系。
指由同个祖先经过无性繁殖方式得到的一群由遗传上同一的DNA分子、细胞或个体组成的特殊生命群体。
2．什么是基因克隆及基本要点?3.举例说明基因工程发展过程中的三个重大事件。
A) 限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志着DNA重组时代的开始）；B) 载体的使用；C) 1970年，逆转录酶及抗性标记的发现。
4.基因工程研究的主要内容是什么？基础研究：基因工程克隆载体的研究基因工程受体系统的研究目的基因的研究基因工程工具酶的研究基因工程新技术的研究应用研究：基因工程药物研究转基因动植物的研究在食品、化学、能源和环境保护等方面的应用研究第二章基因克隆的工具酶1.名词解释：限制性核酸内切酶：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
回文结构：双链DNA中的一段倒置重复序列，当该序列的双链被打开后，可形成发夹结构。
同尾酶：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。
同裂酶：不同来源的限制酶可切割同一靶序列和具有相同的识别序列黏性末端：DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样的DNA末端，称为粘性末端。
平末端：DNA片段的末端是平齐的。
目的基因的制备方法
目的基因的制备方法1. 目的基因合成法：目的基因合成法是一种通过化学合成的方式来制备目的基因的方法。
该方法通常用于制备较短的目的基因（小于1000bp），优点是速度快，产量高，并且可以轻松地对目的基因进行修改。
在该方法中，目的基因的序列首先被设计并确定，然后通过化学合成的方式进行合成。
通常将该序列分成几个较短的片段，并逐一地进行合成和连接，直到完整的目的基因被制备出来。
2. PCR扩增法：PCR扩增法是一种广泛应用于制备目的基因的方法。
该方法利用特定引物的作用下，在体外反应体系中将目的基因的DNA序列扩增至所需的数量。
优点是产量高，适用于中等长度的目的基因，且可以进行定向的修饰。
在该方法中，首先设计引物，确定PCR反应体系中目的基因的起始和终止位置。
然后，通过PCR扩增反应，将模板DNA中的目的基因序列扩增至所需数量。
通过纯化和测序等处理，制备出干净的目的基因。
3. 基因克隆法：基因克隆法是将目的基因分子克隆至载体DNA上的一种方法。
该方法通常适用于较长的目的基因（大于1000bp），优点是产量高，重复性好，并且可以进行定向的修饰。
在该方法中，需准备一种能够接受目的基因的载体DNA，并将其线性化。
然后，在体外反应体系中，将目的基因的DNA序列与线性化载体DNA连接，形成重组DNA。
通过将重组DNA转化至感受态细胞中并筛选，制备出所需的目的基因。
4. 基于CRISPR技术的编辑法：基于CRISPR技术的编辑法是在生物体内或外对目的基因进行编辑的方法。
该方法利用CRISPR-Cas9等系统以及其引导RNA的作用，直接在目的基因序列中进行特定断裂和编辑。
优点是精度高，易于实现定向编辑。
在该方法中，首先需要设计合适的引导RNA序列，并在细胞内或外表达Cas9蛋白，以引导Cas9与引导RNA结合并特异性切割目的基因的DNA序列。
然后，在切割的断口处，可将外源DNA序列转化进去，实现目的基因的定向编辑。
5. 手工组装法：手工组装法是一种将片段PCR产物或化学合成的短片段组装成完整目的基因的方法。
目的基因的制备
2019/11/7
第一节 目的基因的制备
27
（3）避免外源D禁外源DNA片段之间的连接！！！
为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合： 将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离 用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团 用酶在DNA片段的末端上增补同聚尾末端
2019/11/7
2
二 什么是目的基因
基因工程的主要目的是使优良性状相关的基因聚集在同 一生物体中，创造出具有高度应用价值的新物种。为此 必须从现有生物群体中，根据需要分离出此类基因，即 准备要分离、改造、扩增或表达的基因通常称之为目的 基因。
如抗逆性相关基因（抗病、抗寒等）、生物药和保健品 相关基因、毒物降解相关基因 、工业用酶等相关基因 等体的最大装载量如下： 质粒 l-DNA 考斯质粒 BAC
10 kb 23 kb 4
2019/11/7
第一节 目的基因的制备
24
2.1.5.3 载体与基因组DNA的切割
基因
大小（bp） 合成年代 基因
大小（bp） 合成年代
人胰岛素 126 转运RNA 542 -干扰素 81 肠促胰液肽 162 尿抑胃激素 453 2019-/干11/扰7 素
1978 1979 1981 1982 1982 1984
视紫红质 前脑菲肽 ATP酶 溶菌酶 RNA酶T1 RNA酶Ａ
和固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后
者反应中间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固
相亚磷酸三酯法原理设计的
2019/11/7
12
化学合成的单元操作
DMT： 二甲氧基三苯甲基
DMT O
CH2 O G
HH
基因工程目的基因的制备幻灯片
mRNA。 从mRNA分离目的基因更容易。 可把mRNRNA经反 转录产生的各种cDNA片段分别与克 隆载体重组，贮存在一种受体菌群蛋白质聚合体，与制备好的抗体1 进行免疫反应。再加入抗体1的抗体进行免 疫反应。
分离这种反应产物，再去除蛋白质，剩下 mRNA，反转录后合成cDNA。
cDNA
去蛋白提取RNA， 将DNA酶切成预期大小的片段， 将这些片段与适当的载体连接，转入受
Bam HI切割载体后，电泳或离心将两臂与中 央片段分离，回收两臂。
左臂
中央片段
右臂
II. 在T4 DNA连接酶的作用下载体两臂COS
L COS
BamHI sites
Right arm COS
BamHI
R COS
L COS
回收
R COS
③ 重组DNA分子在体外包装成噬菌体颗粒， 转染宿主后了含有一个基因组DNA
片段, 许多细胞一起组成一个含有基因组 各通过克隆 载体贮存在一个受体菌的群体之很小，一般只有5kb，便 于直接分析插入片段的酶切图谱。
（2）、缺点：
筛选困难：杂交检测难度大，携带外源 片段大，复制困难，拷贝数少。
D、cDNA中无内含子序列可适用于原核 生物的直接转达。
（4）、分类：
表达型：采用表达载体构建，插入的 cDNA片段可表达产生蛋白，具有抗原性 或生物活性。
基因工程目的基因的制备幻灯 片
1
第一节 目的基因的制备 一、直接分离法 1、限制性核酸内切酶酶切分离法 已知序列基因. 酶切后分离 与适当载体重组 转入受体。
BamHI BamHI
plasmid
Plasmid-1
2、物理化学法
密度梯度离心法：不同大小的DNA被分开，再 用探针杂交检验。
分离这种反应产物，再去除蛋白质，剩下 mRNA，反转录后合成cDNA。
cDNA
去蛋白提取RNA， 将DNA酶切成预期大小的片段， 将这些片段与适当的载体连接，转入受
Bam HI切割载体后，电泳或离心将两臂与中 央片段分离，回收两臂。
左臂
中央片段
右臂
II. 在T4 DNA连接酶的作用下载体两臂COS
L COS
BamHI sites
Right arm COS
BamHI
R COS
L COS
回收
R COS
③ 重组DNA分子在体外包装成噬菌体颗粒， 转染宿主后了含有一个基因组DNA
片段, 许多细胞一起组成一个含有基因组 各通过克隆 载体贮存在一个受体菌的群体之很小，一般只有5kb，便 于直接分析插入片段的酶切图谱。
（2）、缺点：
筛选困难：杂交检测难度大，携带外源 片段大，复制困难，拷贝数少。
D、cDNA中无内含子序列可适用于原核 生物的直接转达。
（4）、分类：
表达型：采用表达载体构建，插入的 cDNA片段可表达产生蛋白，具有抗原性 或生物活性。
基因工程目的基因的制备幻灯 片
1
第一节 目的基因的制备 一、直接分离法 1、限制性核酸内切酶酶切分离法 已知序列基因. 酶切后分离 与适当载体重组 转入受体。
BamHI BamHI
plasmid
Plasmid-1
2、物理化学法
密度梯度离心法：不同大小的DNA被分开，再 用探针杂交检验。
目的基因的制取
（2）随机片段化 ①限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基 因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。 ②机械切割法 ⅰ. 超声波：超声波强烈作用于DNA，可 使其断裂成约300bp的随机片段。 ⅱ.高速搅拌：1500转/分下搅拌30min， 可产生约8kb的随机片段。
限制酶局部消化的理论依据是克 隆操作某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合 适的片段，并将所有这些片段都与适当的载体连接， 引入相应的宿主细胞的定向性和专一性，反应 时应将不必反应的基团保护起来，而在每一循 环之后，清除多余的单核苷酸，并将未反应的 固着核苷酸链封闭起来。
（五）PCR扩增法
1. 直接从基因组中扩增 （1）提取基因组DNA作模板 （2）根据目的基因序列设计引物 （3）PCR扩增
适合扩增原核生物基因。 真核生物基因组含有内含子！
2. 从mRNA中扩增: RT-PCR （1）提取total RNA （2）反转录合成总cDNA作模板 （3）根据目的基因序列设计引物 （4）PCR扩增 适合扩增真核生物基因。 原核生物不易得到mRNA，也不含有 polyA尾巴。
问题：
1. 将含有外源基因组一个酶切片段的质粒称 为一个基因组DNA克隆，各种此类质粒的 集合体称之为构建了一个 。 2. 将含有一个mRNA的DNA拷贝的克隆称作 一个cDNA克隆，源于同一批RNA制备物 的克隆群则构建了一个 。 3. cDNA技术是进行真核生物基因克隆的一 种通用方法，因为它可以用 为模板， 通过反转录合成双链的、无 的基因， 因而有利于在原核细胞中进行功能表达。
cosmid载体： 容量为50 kb
YAC： 容量为100 kb BAC: 容量为300 kb
3.基因组DNA片段化 （1）限制性内切酶法 用限制性内切酶把基因组DNA切成不同 大小的片段。 优点： 由于带有粘性末端，产物可以直 接与载体连接。 缺点： 目的基因内部也可能有该内切酶 的切点。目的基因被切成碎片！
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第五章 目的基因的制备
目的基因：那些已被或者准备要分离、改 造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，编
码蛋白质（酶）的结构基因。
外源基因：插入到载体内的那个特定的片
段基因。
含目的基因 片段的获得
核酸限制 内切酶消化
机械切割
双链 cDNA合成
直接 化学合成
PCR 扩增
体外重组
同聚物加尾 法连接
粘性末端 连接
（3）PCR的基本反应步骤
变性
95˚C
延伸 72˚C
退火
Tm-5˚C
2 利用PCR扩增目的基因
如果知道目的基因的全序列或其两侧的序列，可 以合成一对与模板DNA 互补的引物，利用PCR技 术扩增出含目的基因的DNA 片段。
局限性：
必须知道侧接靶序列的核苷酸序列，以制备引物。
库要有足够多的克隆子数，保证 所有的基因都在克隆子群体中。
☺
以某生物基因组约3106kb，酶切片段平均长度15kb。理论克隆数： 基因组DNA总长 理论克隆子数＝ DNA片段平均长度
3106 / 15 =2 105
实际克隆数：
DNA片段是随机克隆的，因此理论值只是基因组所需 要的最小数值。
3.2 DNA片断的组装
化学合成的DNA片断一般在200bp以内。
3.2.1 互补连接法
1）互补配对
预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同
片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。 2）5’端磷酸化 用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带上磷酸。 （合成的DNA单链的5’端是-OH）
3）连接酶连成完整双链基因构建的基本程序：① DNA提取及片段化，或是cDNA的合成。
② 载体的选择及制备。
③ DNA片段或cDNA与载体连接。
④ 重组体转化宿主细胞。
⑤ 转化细胞的筛选。
基因组DNA
限制性 内切酶
……
克隆、转化、培养、鉴定基因基因技术分离目的基因----未知基因 基因的克隆：获得含重组DNA的宿主细胞
对于高等真核生物而言，基因组DNA十分庞大,基因 可达数万个，且基因组成结构复杂，除编码序列， 还有非编码序列及调控序列，基因间还存在大量的 间隔序列和重复序列.
因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极 其微小，除少数例外，绝大多数基因难以直接分离 得到。
为了解决这个难题，一种可行的方法就是将这
低浓度引物
高浓度引物
4）RT-PCR:
• 提取组织或细胞中的总RNA • 以其中的mRNA作为模 板，以 Oligo（dT）或 随 机引物 或 基因特异性为引 物，利用逆转录酶反转录 成cDNA。 • 以cDNA为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检
测基因表达
5）多重PCR：在一个反应体系中使用一对以上 引物的PCR称，其结果是产生多个PCR产物， 用于检测特定基因序列的存在或缺失。e library)：指某一生物类型全部基因 的集合。以重组体形式出现。基因由外源DNA片段、载体和宿主组成。
一个理想的基因应包括该生物染色体基因组 全部遗传信息(即全部DNA序列)。
B 限制酶消化：选用四或六核苷酸的限制性内切酶，
如： （GATC） Sau3A I或Mbo I、BamH I (GGATCC)等。
优点：直接产生黏性末端，
缺点：片段的随机性较差。
载体的结构
左臂：编码噬菌体头部和尾部蛋白的基因
右臂：复制起始点、转录启动区和其它必须基因
录形成的cDNA片段与某种载体连接 而形成越性
BamH I
BamH I
BamH I
gene
1.2 机械切割法
1）超声波
超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约
300bp的随机片断。
2）高速搅拌
1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机
片断。
目的基因的获取
1 基因组DNA片断化
2 PCR技术扩增目的基因R技术是指在PCR反应体系 中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监 测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知 模板进行定量分析的方法 。
目的基因的获取
1 基因组DNA片断化
2 PCR技术扩增目的基因
平末端 连接
接头或 衔接物分子
T-A 克隆
导入宿 主细胞
重组噬菌体 DNA的转染
重组质粒 的转化
重组噬菌体DNA或柯斯质粒 体外包装成噬菌体颗粒的转导
筛选
遗传标 记检测
转译 筛选
结构分 析筛选
免疫学 筛选
核酸杂 交筛选
免疫印 迹筛选
目的基因序列测定
经典原核克隆体系流程图
目的基因的获取
1 基因组DNA片断化
Template DNA
5 5
5
Primer 1 5 Primer 2
Cycle 1
5 5 5 5
Cycle 2
5
5 5 5
5 5
5 5
Cycle 3
5 5 5 5 5 5 5 5
5 5
5 5
5 5
5 5
25～30 次循环后，模板DNA的 含量可以扩大100万倍以上。
T4多核苷酸激酶 使5’-OH磷酸化
T4 DNA连接酶
完整的DNA双链
3.2.2 互补延伸连接法
预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作 为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成 完整的双链。
5’ Klenow片段 5’
3’
引物
3’ T4DNA连接酶 3’
5’
化学合成法优缺点
优点：准确性极高，合成速度较快 缺点：合成的寡核苷酸链长度短(不大于80 个碱基) 一般用于PCR引物、寡核苷酸探针、人工接 头或衔接物序列、较小基因的合成。 一个完全的基因就必须含有更多的重组体克隆数。
1975年，L. Clark现的机率，一般情况下期望值99％，即0.99
ƒ : 分离的DNA 片段平均大小与基因组大小的比值。
未知序列的目的基因和大片段基因的扩增，则需要特殊类型 的PCR ： 套式PCR、反向PCR、不对称PCR、 多重PCR、锚定PCR、 长程PCR、反转录PCR、荧光定量PCR 和原位PCR等。
1）Nested pcr （套式PCR）
特点: 需要设计两对引物，一对引物扩增稍长片 段，在这一扩增范围内再设计一对引物，扩增的 产物是以第一对引物的产物为模版
中央片段：不含必须基因
Sau3AI或MboI-field gel electrophores1 基因组DNA片断化
2 PCR技术扩增目的基因内外引物进行两次扩增，大大提 高了检测的敏感性
2） 反向PCR（Inverse PCR）
基本原理：
扩增一段已知序列旁侧的DNA，在引物外侧合成 DNA。
未知序列
已知序列
未知序列
连接酶
3）不对称PCR
目的：扩增产生特异长度的单链DNA。
方法：采用两种不同浓度的引物，最佳比例一 般是0.01∶0.5μM。
引物
电 泳
6）原位PCR
a.
将样品组织切片或细胞涂片，然后固定在载 玻片上； 加热变性，加引物、dNTP、TaqDNA聚合酶 到载玻片上
b.
c.
d.
在原位 PCR仪内进行PCR扩增、检测。
可以检测组织细胞中微量DNA或RNA，且可 精确定位
人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片
7转录形成的cDNA片段与某种载 体连接而形成的克隆的集合。 cDNA (complementary DNA，互补DNA)： 是由生物的某一特定器官或特定发育时期 细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互 补DNA。
外显子
结构基因
内含子 转录、加工修饰
该核苷酸开始与另一核苷酸进行缩合反应， 形成二核苷酸分子
通过酸或碱洗脱其一端的保护基团，再次 与另一个5 ’或3’保护的核苷酸分子进行第 二次缩合反应，形成三核苷酸分子； 再用同样的步骤与下一个核苷酸进行循环 反应。 接长的链始终被固定在不溶的固相载体上， 合成结束后，将寡核苷酸链从固相载体上 洗脱下来。
以上的例子，N值应是： ｌｎ（１－0.99） N= ｌｎ[ 1 -（ 15 / 3106 ）]
= 9105
3106 / 1择
质粒载体可承载 15kb DNA片段
载体 23kb DNA片段 4000 kb
Cosmid 载体 45kb DNA片段YACBAC300 kb
4.1 基因组构建基因组的概念和大小 λ噬1）载体的特点：
λ噬菌体是一种温和噬菌体，可保存在大肠杆菌中。 承载较大外源DNA，约23kb。 有多种限制酶识别位点。
由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列
基因的化学合成
20世纪70年代，Khorana提出，
提出体外扩增DNA
1922-）印度-美国化学家 遗传密码的破译，获 得1968年诺贝尔医学 和生理学奖。
3.1 DNA合成仪的基 本工作原理是：
将要合成的DNA片段3’端的第一个核苷酸 固定于不溶
与λ噬菌体载体重组
重组DNA的包装 转化受体菌
重组克隆的挑选和保存
目的基因DNA片段化
方法：
超声波处理 限制性内切酶部分酶切
A 机械切割法（超声波处理）：
优点：可获得较均一的随机片段，
缺点：DNA片段呈平末端，片段不能直接用于克隆， 需经末端修饰，连上接头后再用限制性内切酶消化 产生黏性末端。
mRNA
克隆、转化、培养、鉴定cDNA4.1 基因组构建基因组的概念和大小 λ噬菌体基因组的构建4.1 基因组的构建
目的基因：那些已被或者准备要分离、改 造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，编
码蛋白质（酶）的结构基因。
外源基因：插入到载体内的那个特定的片
段基因。
含目的基因 片段的获得
核酸限制 内切酶消化
机械切割
双链 cDNA合成
直接 化学合成
PCR 扩增
体外重组
同聚物加尾 法连接
粘性末端 连接
（3）PCR的基本反应步骤
变性
95˚C
延伸 72˚C
退火
Tm-5˚C
2 利用PCR扩增目的基因
如果知道目的基因的全序列或其两侧的序列，可 以合成一对与模板DNA 互补的引物，利用PCR技 术扩增出含目的基因的DNA 片段。
局限性：
必须知道侧接靶序列的核苷酸序列，以制备引物。
库要有足够多的克隆子数，保证 所有的基因都在克隆子群体中。
☺
以某生物基因组约3106kb，酶切片段平均长度15kb。理论克隆数： 基因组DNA总长 理论克隆子数＝ DNA片段平均长度
3106 / 15 =2 105
实际克隆数：
DNA片段是随机克隆的，因此理论值只是基因组所需 要的最小数值。
3.2 DNA片断的组装
化学合成的DNA片断一般在200bp以内。
3.2.1 互补连接法
1）互补配对
预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同
片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。 2）5’端磷酸化 用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带上磷酸。 （合成的DNA单链的5’端是-OH）
3）连接酶连成完整双链基因构建的基本程序：① DNA提取及片段化，或是cDNA的合成。
② 载体的选择及制备。
③ DNA片段或cDNA与载体连接。
④ 重组体转化宿主细胞。
⑤ 转化细胞的筛选。
基因组DNA
限制性 内切酶
……
克隆、转化、培养、鉴定基因基因技术分离目的基因----未知基因 基因的克隆：获得含重组DNA的宿主细胞
对于高等真核生物而言，基因组DNA十分庞大,基因 可达数万个，且基因组成结构复杂，除编码序列， 还有非编码序列及调控序列，基因间还存在大量的 间隔序列和重复序列.
因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极 其微小，除少数例外，绝大多数基因难以直接分离 得到。
为了解决这个难题，一种可行的方法就是将这
低浓度引物
高浓度引物
4）RT-PCR:
• 提取组织或细胞中的总RNA • 以其中的mRNA作为模 板，以 Oligo（dT）或 随 机引物 或 基因特异性为引 物，利用逆转录酶反转录 成cDNA。 • 以cDNA为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检
测基因表达
5）多重PCR：在一个反应体系中使用一对以上 引物的PCR称，其结果是产生多个PCR产物， 用于检测特定基因序列的存在或缺失。e library)：指某一生物类型全部基因 的集合。以重组体形式出现。基因由外源DNA片段、载体和宿主组成。
一个理想的基因应包括该生物染色体基因组 全部遗传信息(即全部DNA序列)。
B 限制酶消化：选用四或六核苷酸的限制性内切酶，
如： （GATC） Sau3A I或Mbo I、BamH I (GGATCC)等。
优点：直接产生黏性末端，
缺点：片段的随机性较差。
载体的结构
左臂：编码噬菌体头部和尾部蛋白的基因
右臂：复制起始点、转录启动区和其它必须基因
录形成的cDNA片段与某种载体连接 而形成越性
BamH I
BamH I
BamH I
gene
1.2 机械切割法
1）超声波
超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约
300bp的随机片断。
2）高速搅拌
1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机
片断。
目的基因的获取
1 基因组DNA片断化
2 PCR技术扩增目的基因R技术是指在PCR反应体系 中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监 测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知 模板进行定量分析的方法 。
目的基因的获取
1 基因组DNA片断化
2 PCR技术扩增目的基因
平末端 连接
接头或 衔接物分子
T-A 克隆
导入宿 主细胞
重组噬菌体 DNA的转染
重组质粒 的转化
重组噬菌体DNA或柯斯质粒 体外包装成噬菌体颗粒的转导
筛选
遗传标 记检测
转译 筛选
结构分 析筛选
免疫学 筛选
核酸杂 交筛选
免疫印 迹筛选
目的基因序列测定
经典原核克隆体系流程图
目的基因的获取
1 基因组DNA片断化
Template DNA
5 5
5
Primer 1 5 Primer 2
Cycle 1
5 5 5 5
Cycle 2
5
5 5 5
5 5
5 5
Cycle 3
5 5 5 5 5 5 5 5
5 5
5 5
5 5
5 5
25～30 次循环后，模板DNA的 含量可以扩大100万倍以上。
T4多核苷酸激酶 使5’-OH磷酸化
T4 DNA连接酶
完整的DNA双链
3.2.2 互补延伸连接法
预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作 为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成 完整的双链。
5’ Klenow片段 5’
3’
引物
3’ T4DNA连接酶 3’
5’
化学合成法优缺点
优点：准确性极高，合成速度较快 缺点：合成的寡核苷酸链长度短(不大于80 个碱基) 一般用于PCR引物、寡核苷酸探针、人工接 头或衔接物序列、较小基因的合成。 一个完全的基因就必须含有更多的重组体克隆数。
1975年，L. Clark现的机率，一般情况下期望值99％，即0.99
ƒ : 分离的DNA 片段平均大小与基因组大小的比值。
未知序列的目的基因和大片段基因的扩增，则需要特殊类型 的PCR ： 套式PCR、反向PCR、不对称PCR、 多重PCR、锚定PCR、 长程PCR、反转录PCR、荧光定量PCR 和原位PCR等。
1）Nested pcr （套式PCR）
特点: 需要设计两对引物，一对引物扩增稍长片 段，在这一扩增范围内再设计一对引物，扩增的 产物是以第一对引物的产物为模版
中央片段：不含必须基因
Sau3AI或MboI-field gel electrophores1 基因组DNA片断化
2 PCR技术扩增目的基因内外引物进行两次扩增，大大提 高了检测的敏感性
2） 反向PCR（Inverse PCR）
基本原理：
扩增一段已知序列旁侧的DNA，在引物外侧合成 DNA。
未知序列
已知序列
未知序列
连接酶
3）不对称PCR
目的：扩增产生特异长度的单链DNA。
方法：采用两种不同浓度的引物，最佳比例一 般是0.01∶0.5μM。
引物
电 泳
6）原位PCR
a.
将样品组织切片或细胞涂片，然后固定在载 玻片上； 加热变性，加引物、dNTP、TaqDNA聚合酶 到载玻片上
b.
c.
d.
在原位 PCR仪内进行PCR扩增、检测。
可以检测组织细胞中微量DNA或RNA，且可 精确定位
人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片
7转录形成的cDNA片段与某种载 体连接而形成的克隆的集合。 cDNA (complementary DNA，互补DNA)： 是由生物的某一特定器官或特定发育时期 细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互 补DNA。
外显子
结构基因
内含子 转录、加工修饰
该核苷酸开始与另一核苷酸进行缩合反应， 形成二核苷酸分子
通过酸或碱洗脱其一端的保护基团，再次 与另一个5 ’或3’保护的核苷酸分子进行第 二次缩合反应，形成三核苷酸分子； 再用同样的步骤与下一个核苷酸进行循环 反应。 接长的链始终被固定在不溶的固相载体上， 合成结束后，将寡核苷酸链从固相载体上 洗脱下来。
以上的例子，N值应是： ｌｎ（１－0.99） N= ｌｎ[ 1 -（ 15 / 3106 ）]
= 9105
3106 / 1择
质粒载体可承载 15kb DNA片段
载体 23kb DNA片段 4000 kb
Cosmid 载体 45kb DNA片段YACBAC300 kb
4.1 基因组构建基因组的概念和大小 λ噬1）载体的特点：
λ噬菌体是一种温和噬菌体，可保存在大肠杆菌中。 承载较大外源DNA，约23kb。 有多种限制酶识别位点。
由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列
基因的化学合成
20世纪70年代，Khorana提出，
提出体外扩增DNA
1922-）印度-美国化学家 遗传密码的破译，获 得1968年诺贝尔医学 和生理学奖。
3.1 DNA合成仪的基 本工作原理是：
将要合成的DNA片段3’端的第一个核苷酸 固定于不溶
与λ噬菌体载体重组
重组DNA的包装 转化受体菌
重组克隆的挑选和保存
目的基因DNA片段化
方法：
超声波处理 限制性内切酶部分酶切
A 机械切割法（超声波处理）：
优点：可获得较均一的随机片段，
缺点：DNA片段呈平末端，片段不能直接用于克隆， 需经末端修饰，连上接头后再用限制性内切酶消化 产生黏性末端。
mRNA
克隆、转化、培养、鉴定cDNA4.1 基因组构建基因组的概念和大小 λ噬菌体基因组的构建4.1 基因组的构建