芹菜素对氧糖剥夺损伤小胶质细胞的抗炎作用(一)

芹菜素对氧糖剥夺损伤小胶质细胞的抗炎作用(一)
作者：李泽宜,韩书珍,王果,陈翔
【摘要】目的探讨芹菜素对氧糖剥夺(OGD)损伤后复氧复糖(OGD/R)小胶质细胞中白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)产生的影响。

方法将原代培养的小胶质细胞随机分为正常组、二甲基亚砜(DMSO)组及芹菜素(10、25、50μmol/L)组,其中DMSO组和芹菜素组小胶质细胞进行OGD8h,之后加入相应药物培养基,观察24h后,收集细胞上清,用双抗夹心酶联免疫吸附法检测上清中IL-1β、TNF-α含量。

结果24h后DMSO组细胞上清中IL-1β、TNF-α含量增多(P＜0.01)。

芹菜素组TNF-α、IL-1β分泌量明显低于DMSO组。

芹菜素可以抑制OGD后小胶质细胞的炎症反应,且呈剂量依赖性。

结论芹菜素可以通过减少OGD/R小胶质细胞中IL-1β、TNF-α的产生而发挥神经保护作用。

【关键词】氧糖剥夺；芹菜素；小胶质细胞；白细胞介素-1β；肿瘤坏死因子-α
Abstract：ObjectiveTostudytheneuroprotectiveeffectofapigeninonmicrogliawhichwasexposedtooxygengluco sedeprivationandreperfusion(OGD/R),whichwascharacterizedbyitsinfluenceonIL-1βandTNF-αexpr ession.MethodsPrimarymicroglialcultureswerepreparedfromnewbornratbrain.Thepurityofisolate dcellswereidentifiedbyGSA-IB4.Thecellswererandomizedinto5groups：normalgroup,DMSOgroupandapigenin-treatedgroups(10,25,50μmol/L).ThecellsofDMSOgroupand apigenin-treatedgroupwereexposedto8hofOGDand24hofreperfusioninthepresenceorabsenceofa pigeninatarangeofconcentrations.CulturesupernatantswerecollectedandIL-1βandTNF-αweredetec tedbyELISAassay.ResultsTheexpressionofIL-1βandTNF-αweresignificantlyhigherinDMSOgroup(P＜0.01),however,apigeninconcentration-dependentlysuppressedIL-1βandTNF-αproductionofmicrogl ial.ConclusionApigeninmayplayaneuroprotectiveeffectwhichwasrelatedwithdepressionofIL-1βand TNF-αproductioni nOGD/Rmicroglia.
Keywords：oxygenglucosedeprivation；apigenin；microglia；IL-1β；TNF-α小胶质细胞是中枢神经系统中数量第三的细胞,是重要的免疫感受与效应细胞,具有抗原提呈、分泌多种细胞因子、吞噬病原体和坏死组织以及神经修复的作用。

近年来对脑缺血再灌注的研究逐渐升温,而小胶质细胞在此过程中扮演一种特殊的免疫活性细胞,发挥着双重作用。

一方面,激活的小胶质细胞分泌白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)等炎症因子,加重脑损伤；另一方面,激活的小胶质细胞还可转化为吞噬细胞,清除死亡的神经元,同时分泌转化生长因子-β(TGF-β)、胰岛素样生长因子1(IGF1)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、神经细胞粘附分子(NCAM)等神经营养因子,支持神经元的存活,重建缺血区内的稳态1]。

因此,脑缺血后适度的小胶质细胞反应可能有神经保护和抑制凋亡的作用,深入研究小胶质细胞在脑缺血过程中的作用,可为临床治疗脑缺血提供新的途径。

本研究采用了体外氧糖剥夺(OGD)后复氧复糖模型(OGD/R)来模拟小胶质细胞在体内缺血缺氧状态,与体内实验相比,可以更好地单独研究小胶质细胞在缺血缺氧中的变化2]。

芹菜素(apigenin)属黄酮类化合物,有“植物雌激素”之称,大量存在于水果、蔬菜、豆类、茶叶中,其中芹菜中含量最高。

芹菜素的化学结构为4,5,7-三羟黄酮,其分子式为C15H10O6,相对分子质量为270,其4,5,7位置的3个羟基和C2C3双键决定了其独特的药理学效应和生物学特性。

研究发现,芹菜素具有神经保护、抗氧化、自由基清除剂、抗肿瘤、抗炎、碳水化合物代谢促进因子、免疫调节剂等作用3]。

本实验目的在于研究芹菜素单独作用于体外缺血缺氧小胶质细胞,对其细胞活化和细胞因子分泌的影响。

1实验材料
1.1动物
新生SD大鼠(出生48h以内),温州医学院实验动物中心提供。

1.2药物及试剂
DMEM/F12高糖培养基,特优级胎牛血清(吉诺公司),盐酸利多卡因(10mL注射液,有效含量0.12g,分子量288.182),青霉素-链霉素(100×,上海碧云天生物技术有限公司),多聚赖氨酸(上海碧云天生物技术有限公司),0.25%Trypsin-EDTA(Gibco公司)。

生物素标记GSA-IB4(BS-1IsolectinB4BiotinConjugate,Sigma公司),HRP-链酶亲和素(北京中杉公司),DAB显色试剂盒(北京中杉公司)。

芹菜素(陕西慧科植物开发有限公司),用100%二甲基亚砜(DMSD,Sigma公司)作为溶剂,配制成40mmol/L的浓缩液,滤器过滤除菌,-20℃备用。

实验当日用完全培养基配制成芹菜素工作液,质量浓度分别为10、25、50μmol/L,DMSO终浓度在0.2%以下。

1.3仪器
ThermoForma310系列CO2培养箱,倒置显微镜及照相系统(Nikon公司),ThermoHERAcell三气培养箱。

2实验方法
2.1混合胶质细胞培养
采用McCarthy混合胶质细胞培养方法4],并加以改良。

新生SD大鼠冰上麻醉10min,无菌环境下开颅取脑,冷DMEM/F12溶液清洗血污,并用小毛刷仔细剔除脑膜及血管。

剔除小脑保留全部大脑,剪碎至1mm3的组织块,用预热至37℃的0.125%Trypsin-EDTA37℃消化5min,完全培养基终止消化后吸管吹打混匀,1000r/min离心5min,弃上清,加入含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基制成细胞悬液。

血球计数板计数并调整细胞密度至5×105/cm2,接种于预先涂布多聚赖氨酸的培养瓶(75cm2,250mL)。

37℃、5%CO2培养箱培养。

根据细胞代谢情况,2～3d换液1次,每次1/3体积。

2.2小胶质细胞分离纯化
待原代培养第7～9日,细胞充分分层生长后,用无血清DMEM/F12培养基配制盐酸利多卡因注射液至工作浓度(12mmol/L),调整pH值至7.2～7.4,0.22μm滤膜过滤除菌后,置于37℃水浴箱中待用。

吸除混合胶质细胞培养瓶中的培养液,加入盐酸利多卡因溶液,静置3～5min,轻摇培养瓶约2min,镜下观察,待大量细胞悬浮后,收集细胞悬液,1000r/min离心5min。

收集细胞,接种于6孔培养板,10min后完全换液1次,去除未贴壁细胞5]。

2.3小胶质细胞培养及鉴定
分离纯化培养的小胶质细胞以3×104/cm2的密度种植于预先涂布多聚赖氨酸的6孔培养板,加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液继续培养,取纯化后第3日的细胞做GSA-IB4免疫细胞化学染色鉴定纯度。

操作步骤：①培养于盖玻片上的细胞,PBS漂洗5min×3次。

②用4%多聚甲醛室温固定30min,PBS漂洗5min×3次。

③3%过氧化氢孵育10min,封闭内源性过氧化物酶的活性,PBS漂洗5min×3次。

④加入正常山羊血清工作液室温封闭20min。

⑤吸去血清,不洗,加入生物素标记的同工凝集素GSA-IB4(1∶200稀释),4℃湿盒内过夜,PBS漂洗5min×3次。

⑥滴加HRP标记的链酶亲和素(1∶100),37℃孵育1h,PBS漂洗5min×3次,DAB显色,封片。

对照实验：用PBS或二抗同种动物血清代替一抗,其他步骤不变。

鉴定纯度达98%以上可做下一步实验。

2.4氧糖剥夺模型的建立
选取纯化后3d的小胶质细胞建立OGD/R模型。

先用PBS将培养板中的细胞洗2遍,加入事先用95%N2＋5%CO2置换30min的无糖DMEM,迅速置于37℃、94%N2＋1%O2＋5%CO2低氧培养箱中。

缺氧培养8h后,按下述分组加入相应药物培养基,重新放入37℃、5%CO2细胞培养箱给予复氧24h2,6]。

2.5分组
将OGD/R小胶质细胞随机分为４组。

A1组：芹菜素终浓度为10μmol/L。

A2组：芹菜素终浓度为25μmol/L。

A3组：芹菜素终浓度为50μmol/L。

DMSO组：DMSO终浓度为0.12%,作为对照组。

正常组：纯化后3d未做任何处理的细胞。

每组4个复孔。

缺氧前及缺氧结束后对各组细胞进行图像采集。

2.6双抗夹心酶联免疫吸附法检测细胞培养上清中肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β水平
于上述观察时间收集各组细胞上清,保存于-20℃。

按试剂盒说明书方法检测。

3统计学方法
计量资料以—x±s表示,用SPSS16.0统计软件处理数据。

多组间均数比较采用最小显著差异(LSD)t检验。

4结果
4.1芹菜素对氧糖剥夺/复氧复糖后各组小胶质细胞释放白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α的影响(见表1)
表1OGD/R24h后各组小胶质细胞释放IL-1β、TNF-α含量比较(略)
4.2氧糖剥夺/复氧复糖前后小胶质细胞的形态变化
OGD/R前小胶质细胞多数为静息状态,表现为胞体较小,可见长短不一的细胞突起,突起多呈不对称分布,也有细胞呈单极状,或者双极状,且此类单极和双极细胞的突起一般较长。

OGD/R 后小胶质细胞明显活化,表现为胞体增大,突起变短,整个细胞呈荷包蛋样,有些细胞整个胞体回缩成外周光滑的圆形或椭圆形,胞体比荷包蛋样细胞小很多,且折光性强。

5讨论
脑缺血是危害人类的重要疾病之一,而小胶质细胞在脑缺血中发挥的作用正受到越来越多的关注。

OGD/R是一种模拟体内缺血缺氧再灌注过程的稳定实验模型,广泛应用于神经元的体外缺血缺氧的模拟。

有实验发现,小胶质细胞对OGD/R的耐受与神经元不同,与星形胶质细胞类似,但比星形胶质细胞更耐受OGD/R7]。

但小胶质细胞体外培养的时间会对OGD/R的损伤程度有很大影响,体外培养早期的小胶质细胞更容易受到OGD/R的损害8]。

因此,本实验统一采用了体外培养3d的小胶质细胞,以提高小胶质细胞对OGD/R的易感性和保证损伤程度的一致性。

对脑缺血第一个做出反应的炎症细胞是脑内固有的小胶质细胞,它们的来源尚有争议,但大多认为它和外周巨噬细胞有共同的谱系。

在正常发育成熟的大脑中的小胶质细胞是分枝状的,此种状态被称为静息态,表现为胞浆浓缩、伸出多个细长突起,广泛而规律地分布在大脑灰、白质及脊髓、视网膜中,占胶质细胞总数的20%左右。

此时细胞提呈抗原、激活T细胞的功能减低,TNF-α基因表达减少,胞浆内无吞噬体,无非特异性酯酶活性,不产生自由基,不具备吞噬功能,杀伤活性低,使大脑组织不易受到免疫反应介导的损害。

但保留了有效的吞饮功能和一定的迁移能力,可以清除代谢废物,灭活和处理损伤细胞释放的毒性物质,以维护组织稳定。

当中枢神经系统受到损伤时,小胶质细胞表面的膜感受器与病原分子或其他活化物结合后,迅速被激活,变成阿米巴状,发挥其吞噬功能,清除脑内将要死亡的细胞释放的有毒物质,吞噬病原体和细胞碎片,抵御感染。

当损伤痊愈后又恢复为静息状态。

本实验通过体外培养小胶质细胞,并利用OGD/R模型发现了类似的改变。

培养3d的小胶质细胞大多呈静息的分枝状,而OGD/R后明显活化,变成阿米巴状或杆状。

脑缺血后,小胶质细胞作为脑中重要的固有免疫效应细胞,发挥着损害和保护的双重作用,分泌大量炎症因子是它发挥损害作用的途径之一。

这些炎症因子被认为是脑缺血后神经元继发死亡的主要祸首。

其中,两个十分重要的炎症因子IL-1β和TNF-α主要来源于小胶质细胞。

虽然传统观念认为二者是起损害作用的,但体内和体外实验都有证据表明二者也具有神经保护作用。

有文献报道,在体外培养的小胶质细胞OGD4h后,TNF和IL-1β的RNA转录水平分别增加了5.57倍和10.99倍9]。

本实验通过检测OGD/R24h后的细胞上清也发现二者显著升高,
与文献报道相符。

我们前期体内实验已表明,芹菜素对大鼠缺血再灌注后脑组织有保护作用,并进一步证明这种保护作用的发挥可能与抑制大鼠缺血再灌注后脑组织中的NF-κB的表达及抑制iNOS活性有关10]。

有文献报道,芹菜素是通过抑制小胶质细胞的活化来减少神经元的死亡11]。

本实验结果显示：小胶质细胞在正常状态下很少分泌IL-1β和TNF-α,OGD8h/R24h后,二者的分泌量明显增加。

目前,许多研究都认为免疫炎症反应参与了脑缺血后的脑损伤,而我们的实验结果表明,小胶质细胞在缺血后通过分泌炎症因子主动参与了脑损伤过程。

在OGD8h后立即加入芹菜素作用24h后,小胶质细胞TNF-α、IL-1β分泌量比DMSO组明显减少(P＜0.01),说明芹菜素可以抑制OGD后小胶质细胞的炎症反应,且呈剂量依赖性。

有研究报道,芹菜素抑制LPS激活的小胶质细胞的TNF-α分泌呈剂量依赖性12],与我们发现的芹菜素抑制OGD后小胶质细胞分泌TNF-α的规律基本相同。

我们推测,这是芹菜素保护缺血后神经元的可能途径之一。

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