芹菜素对氧糖剥夺损伤小胶质细胞的抗炎作用(一)

芹菜素对氧糖剥夺损伤小胶质细胞的抗炎作用(一)

作者：李泽宜,韩书珍,王果,陈翔

【摘要】目的探讨芹菜素对氧糖剥夺(OGD)损伤后复氧复糖(OGD/R)小胶质细胞中白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)产生的影响。方法将原代培养的小胶质细胞随机分为正常组、二甲基亚砜(DMSO)组及芹菜素(10、25、50μmol/L)组,其中DMSO组和芹菜素组小胶质细胞进行OGD8h,之后加入相应药物培养基,观察24h后,收集细胞上清,用双抗夹心酶联免疫吸附法检测上清中IL-1β、TNF-α含量。结果24h后DMSO组细胞上清中IL-1β、TNF-α含量增多(P＜0.01)。芹菜素组TNF-α、IL-1β分泌量明显低于DMSO组。芹菜素可以抑制OGD后小胶质细胞的炎症反应,且呈剂量依赖性。结论芹菜素可以通过减少OGD/R小胶质细胞中IL-1β、TNF-α的产生而发挥神经保护作用。

【关键词】氧糖剥夺；芹菜素；小胶质细胞；白细胞介素-1β；肿瘤坏死因子-α

Abstract：ObjectiveTostudytheneuroprotectiveeffectofapigeninonmicrogliawhichwasexposedtooxygengluco sedeprivationandreperfusion(OGD/R),whichwascharacterizedbyitsinfluenceonIL-1βandTNF-αexpr ession.MethodsPrimarymicroglialcultureswerepreparedfromnewbornratbrain.Thepurityofisolate dcellswereidentifiedbyGSA-IB4.Thecellswererandomizedinto5groups：normalgroup,DMSOgroupandapigenin-treatedgroups(10,25,50μmol/L).ThecellsofDMSOgroupand apigenin-treatedgroupwereexposedto8hofOGDand24hofreperfusioninthepresenceorabsenceofa pigeninatarangeofconcentrations.CulturesupernatantswerecollectedandIL-1βandTNF-αweredetec tedbyELISAassay.ResultsTheexpressionofIL-1βandTNF-αweresignificantlyhigherinDMSOgroup(P＜0.01),however,apigeninconcentration-dependentlysuppressedIL-1βandTNF-αproductionofmicrogl ial.ConclusionApigeninmayplayaneuroprotectiveeffectwhichwasrelatedwithdepressionofIL-1βand TNF-αproductioni nOGD/Rmicroglia.

Keywords：oxygenglucosedeprivation；apigenin；microglia；IL-1β；TNF-α小胶质细胞是中枢神经系统中数量第三的细胞,是重要的免疫感受与效应细胞,具有抗原提呈、分泌多种细胞因子、吞噬病原体和坏死组织以及神经修复的作用。近年来对脑缺血再灌注的研究逐渐升温,而小胶质细胞在此过程中扮演一种特殊的免疫活性细胞,发挥着双重作用。一方面,激活的小胶质细胞分泌白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)等炎症因子,加重脑损伤；另一方面,激活的小胶质细胞还可转化为吞噬细胞,清除死亡的神经元,同时分泌转化生长因子-β(TGF-β)、胰岛素样生长因子1(IGF1)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、神经细胞粘附分子(NCAM)等神经营养因子,支持神经元的存活,重建缺血区内的稳态1]。因此,脑缺血后适度的小胶质细胞反应可能有神经保护和抑制凋亡的作用,深入研究小胶质细胞在脑缺血过程中的作用,可为临床治疗脑缺血提供新的途径。本研究采用了体外氧糖剥夺(OGD)后复氧复糖模型(OGD/R)来模拟小胶质细胞在体内缺血缺氧状态,与体内实验相比,可以更好地单独研究小胶质细胞在缺血缺氧中的变化2]。芹菜素(apigenin)属黄酮类化合物,有“植物雌激素”之称,大量存在于水果、蔬菜、豆类、茶叶中,其中芹菜中含量最高。芹菜素的化学结构为4,5,7-三羟黄酮,其分子式为C15H10O6,相对分子质量为270,其4,5,7位置的3个羟基和C2C3双键决定了其独特的药理学效应和生物学特性。研究发现,芹菜素具有神经保护、抗氧化、自由基清除剂、抗肿瘤、抗炎、碳水化合物代谢促进因子、免疫调节剂等作用3]。本实验目的在于研究芹菜素单独作用于体外缺血缺氧小胶质细胞,对其细胞活化和细胞因子分泌的影响。

1实验材料

1.1动物

新生SD大鼠(出生48h以内),温州医学院实验动物中心提供。

1.2药物及试剂

DMEM/F12高糖培养基,特优级胎牛血清(吉诺公司),盐酸利多卡因(10mL注射液,有效含量0.12g,分子量288.182),青霉素-链霉素(100×,上海碧云天生物技术有限公司),多聚赖氨酸(上海碧云天生物技术有限公司),0.25%Trypsin-EDTA(Gibco公司)。生物素标记GSA-IB4(BS-1IsolectinB4BiotinConjugate,Sigma公司),HRP-链酶亲和素(北京中杉公司),DAB显色试剂盒(北京中杉公司)。芹菜素(陕西慧科植物开发有限公司),用100%二甲基亚砜(DMSD,Sigma公司)作为溶剂,配制成40mmol/L的浓缩液,滤器过滤除菌,-20℃备用。实验当日用完全培养基配制成芹菜素工作液,质量浓度分别为10、25、50μmol/L,DMSO终浓度在0.2%以下。

1.3仪器

ThermoForma310系列CO2培养箱,倒置显微镜及照相系统(Nikon公司),ThermoHERAcell三气培养箱。

2实验方法

2.1混合胶质细胞培养

采用McCarthy混合胶质细胞培养方法4],并加以改良。新生SD大鼠冰上麻醉10min,无菌环境下开颅取脑,冷DMEM/F12溶液清洗血污,并用小毛刷仔细剔除脑膜及血管。剔除小脑保留全部大脑,剪碎至1mm3的组织块,用预热至37℃的0.125%Trypsin-EDTA37℃消化5min,完全培养基终止消化后吸管吹打混匀,1000r/min离心5min,弃上清,加入含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基制成细胞悬液。血球计数板计数并调整细胞密度至5×105/cm2,接种于预先涂布多聚赖氨酸的培养瓶(75cm2,250mL)。37℃、5%CO2培养箱培养。根据细胞代谢情况,2～3d换液1次,每次1/3体积。

2.2小胶质细胞分离纯化

待原代培养第7～9日,细胞充分分层生长后,用无血清DMEM/F12培养基配制盐酸利多卡因注射液至工作浓度(12mmol/L),调整pH值至7.2～7.4,0.22μm滤膜过滤除菌后,置于37℃水浴箱中待用。吸除混合胶质细胞培养瓶中的培养液,加入盐酸利多卡因溶液,静置3～5min,轻摇培养瓶约2min,镜下观察,待大量细胞悬浮后,收集细胞悬液,1000r/min离心5min。收集细胞,接种于6孔培养板,10min后完全换液1次,去除未贴壁细胞5]。

2.3小胶质细胞培养及鉴定

分离纯化培养的小胶质细胞以3×104/cm2的密度种植于预先涂布多聚赖氨酸的6孔培养板,加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液继续培养,取纯化后第3日的细胞做GSA-IB4免疫细胞化学染色鉴定纯度。操作步骤：①培养于盖玻片上的细胞,PBS漂洗5min×3次。②用4%多聚甲醛室温固定30min,PBS漂洗5min×3次。③3%过氧化氢孵育10min,封闭内源性过氧化物酶的活性,PBS漂洗5min×3次。④加入正常山羊血清工作液室温封闭20min。⑤吸去血清,不洗,加入生物素标记的同工凝集素GSA-IB4(1∶200稀释),4℃湿盒内过夜,PBS漂洗5min×3次。⑥滴加HRP标记的链酶亲和素(1∶100),37℃孵育1h,PBS漂洗5min×3次,DAB显色,封片。

对照实验：用PBS或二抗同种动物血清代替一抗,其他步骤不变。鉴定纯度达98%以上可做下一步实验。

2.4氧糖剥夺模型的建立

选取纯化后3d的小胶质细胞建立OGD/R模型。先用PBS将培养板中的细胞洗2遍,加入事先用95%N2＋5%CO2置换30min的无糖DMEM,迅速置于37℃、94%N2＋1%O2＋5%CO2低氧培养箱中。缺氧培养8h后,按下述分组加入相应药物培养基,重新放入37℃、5%CO2细胞培养箱给予复氧24h2,6]。

2.5分组