HPLC法测定盐酸二甲双胍中有关物质双氰胺的含量_王金平

1.前言
盐酸二甲双胍是一种降血糖药，具有提高Ⅱ型糖尿病患者的血糖耐受性，降低基础和餐后血糖的作用。

美国糖尿病协会和欧洲糖尿病协会于2006年共同提出建议，Ⅱ型糖尿病患者一经确诊应尽早开始使用盐酸二甲双胍；世界上绝大多数的糖尿病治疗指南都将其列为首选用药，也是中国成年Ⅱ型糖尿病人用得最多的口服处方降糖药。

盐酸二甲双胍的作用机理不同于其它类型的口服抗血糖药，它可减少肝糖的产生，降低肠对糖的吸收，并且可通过增加外周糖的摄取和利用而提高胰岛素的敏感性，与磺酰脲类药物不同的是，盐酸二甲双胍不会使Ⅱ型糖尿病患者或正常血糖的患者产生低血糖症。

盐酸二甲双胍治疗后，胰岛素的分泌保持不变，而降低了空腹胰岛素水平及每日血浆胰岛素水平。

盐酸二甲双胍为药典品种，其中收载了有关物质双氰胺的测定方法，限度为0.02%[1]，但该法有一定的局限性，如色谱分离时双氰胺的保留时间较短，难于和溶剂峰基线分离，给定量的工作带来不便，色谱条件重现性欠佳等；近年来，关于盐酸二甲双胍中双氰胺含量测试也有文献报道[2-5]，但在实际应用上由于色谱条件要求高，成本高等亦存在部分局限性；本文主要参照药典方法，并作了一些条件的改动以适应实际测定的需要。

2.仪器与试药
仪器：色谱仪:Agilent1200series高效液相色谱仪；紫外检测器：Agilent G1314A VWD；电子天平:CPA225D(赛多利斯)；pH计：PB-10(赛多利斯)。

试剂：盐酸二甲双胍原料药(A、B制药企业分别提供3批)；盐酸二甲双胍对照品(批号：100664-200401中国药品生物制品检定所)、双氰胺对照品(批号：100206-200302中国药品生物制品检定所)；水为超纯水；磷酸二氢铵(分析纯)，磷酸(分析纯)。

3.方法与结果
3.1色谱条件的选择
流动相：3.4%(W/V)磷酸二氢铵缓冲液(用磷酸调pH值至2.5)；色谱柱：Agilent SCX(250 mm×4.6mm，5μm)；检测波长：218nm；流速：1.0 ml/min；柱温30℃，进样量：10μl。

HPLC法测定盐酸二甲双胍中有关物质双氰胺的含量
王金平1李红星2陈建英2刘荣立1
(1.重庆市中药研究院重庆400065；2.重庆医药工业研究院有限责任公司重庆400061)
摘要:目的：本文建立了HPLC法测定盐酸二甲双胍中的有关物质双氰胺的含量。

方法：采用Agilent SCX (250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，以3.4%(W/V)磷酸二氢铵缓冲液(用磷酸调pH值至2.5)为流动相，流速1.0ml/min，检测波长218nm，柱温30℃，进样量10μl。

结果：本法中双氰胺浓度在0.05～25.12μg/ml范围内呈良好线性关系，相关系数r=0.9999；可以用外标法对盐酸二甲双胍中的有关物质双氰胺进行准确测定。

所测样品中盐酸二甲双胍的有关物质双氰胺均小于0.02%。

结论：该方法灵敏、准确、可靠、方便、专属性好，适用于盐酸二甲双胍中有关物质双氰胺的含量测定。

关键词:HPLC盐酸二甲双胍有关物质双氰胺
3.2方法专属性的考察
本实验以水为溶剂，按上述色谱条件进溶剂空白，记录色谱图(图1)，取双氰胺对照品适量，用水溶解并用流动相稀释制成浓度为5.024μg/ml的溶液，按上述色谱条件进样，记录色谱图(图2)，理论板数按双氰胺峰计算为12869；由空白溶剂图谱和双氰胺对照品色谱图可知，双氰胺与溶剂峰能达到完全基线分离；另取双氰胺对照品和盐酸二甲双胍对照品适量，加流动相溶解并稀释制成10.0432μg/ml 和10.0480μg/ml的混合溶液，按上述色谱条件进样，记录色谱图(图3)，由图谱得知双氰胺和盐酸二甲双胍分离符合要求。

图1(空白溶剂色谱图)
图3(双氰胺与二甲双胍的分离色谱图)图2(双氰胺对照品色谱图)
3.8双氰胺含量测定结果
对2家不同制药企业的6个批次的盐酸二甲双胍进行双氰胺含量的测定，结果在表2中列出。

由表2可知，6个批次的样品中双氰胺的含量均小于0.02%，符合国家标准；但各批次之间双氰胺的含量还是存在差异。

3.3最低检测浓度的确定
取双氰胺对照品适量，以水为溶剂，稀释至适合浓度，按上述色谱条件进样，以信噪比3:1时相应的双氰胺的量确定为双氰胺的最低检测浓度0.04μg/ml 。

3.4精密度试验
取双氰胺对照品适量，以水为溶剂，配制成浓度为1μg/ml 的溶液，按上述色谱条件，重复进样6次，记录峰面积，双氰胺峰面积的RSD 为0.57%。

3.5溶液的稳定性
取方法专属性的考察项下的双氰胺和盐酸二甲双胍对照品混合溶液，分别于0h 、3h 、6h 、9h 、12h 精密取溶液10μl,按上述色谱条件测定双氰胺和盐酸二甲双胍的峰面积，考察溶液的稳定性，结果溶液中双氰胺和盐酸二甲双胍峰面积的RSD 分别为0.76%和0.81%。

结果表明，双氰胺和盐酸二甲双胍混合液在12h 内稳定性良好。

3.6双氰胺线性试验
精密双氰胺对照品适量，用水溶解并稀释成浓度为25.12μg/ml 的对照品贮备液，分别精密吸取上述对照品贮备液，用水稀释成几个系列浓度的对照品溶液，分别进样，记录色谱图；以双氰胺浓度C （μg/ml ）为横坐标，峰面积A 为纵坐标绘制标准曲线。

线性回归方程为：A=102.15C-4.91，相关系数r=0.9999；结果表明，在0.05～25.12μg/ml 范围内，双氰胺的峰面积与浓度呈良好的线性关系。

3.7双氰胺回收率试验
取盐酸二甲双胍原料药（已知其中双氰胺的含量为0.006%）25mg ，平行9份，分别置于100ml 量瓶中，分别精密加入高、中、低3种浓度的双氰胺对照品（浓度分别为0.5024、1.0048、1.5072μg/ml ）各1ml,每种浓度各3份，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，按上述分析方法测试，计算回收率。

结果见下表1：
称样量（mg ）测定量（μg ）原有量（μg ）加入量（μg ）回收率（%）平均回收率（%）
RSD （%）
25.06
25.1224.9625.9625.3824.8624.3625.8625.55
1.99181.98351.9780
2.54702.56792.44392.9777
3.01602.9885
1.50361.50721.49761.55761.52281.49161.46161.55161.5330
0.50240.50240.50241.00481.00481.00481.50721.50721.5072
99.3
98.399.798.5102.098.8100.699.298.2
99.4 1.2
表1双氰胺的加样回收率试验（n=9）
制药企业
批号双氰胺的含量（%）
A
2009120220091204201001030.0060.0050.007B
200909022010020420100301
0.0040.0060.003
表2不同企业盐酸二甲双胍中双氰胺的含量测试结果（n=6）
等）、心脑血管疾病、免疫性疾病、肿瘤、艾滋病及其它病毒性疾病等，以注射剂、经皮给药、微囊、微球、凝胶剂制剂为重点，开展现代中药制剂技术研究，采用现代的制剂工艺和新的剂型，充分发挥中药复方的多靶点、多层次、对机体整体治疗的优势，研制现代中药。

5.11现代中药创新研究技术平台构建
主要研究内容包括中药活性筛选平台的构建、中药有效物质制备方法学研究和中药新药创制研究；中药及其制剂有效性评价的方法学研究和中药及其制剂安全性评价的方法学研究。

5.12生物技术在中药生药学研究中的应用
21世纪由迅猛发展的生物技术也必然会
深入到中药生药学领域。

研究保存和繁殖珍稀濒危的药用动、植物的生物技术方法；培育常用中药的优良品种，特别是当搞清了中药有效成分和有效部位以后，利用生物技术和基因重组可以培育出优质、抗病力强、产量高的新品种，不断提高中药材的质量；对中药品种进行更深入和客观的鉴定研究，可选择合适的DNA 分子遗传标记技术，进行种质资源的遗传背景研究；生物工程生产和转化活性成分，合成活性强的先导化合物等，将是中药生药学的生物技术研究的热点。

（因版面有限，省略了参考文献部分。

在此，对所有被引用文献的专家、作者们表示感谢！）
（上接第5页）
4.讨论
4.1检测波长的选择
通过对盐酸二甲双胍和双氰胺的溶液紫外扫描可知，
该两组分的紫外吸收均属末端吸收，且双氰胺在215nm 波长处附近有较大吸收，参照中国药典盐酸二甲双胍中有关物质测定波长，我们选用218nm 作为盐酸二甲双胍有关物质双氰胺的测定波长。

4.2流动相的选择
中国药典2010年版二部盐酸二甲双胍中有关物质的测定方法，选用磺酸基阳离子交换键合硅胶为填充剂，在实验中发现以1.7%磷酸二氢铵溶液(用磷酸调pH 值至3.0)为流动相时，盐酸二甲双胍出峰时间晚(约45min)，将磷酸二氢铵溶液浓度调整为3.4%(用磷酸调pH 值至2.5)时盐酸二甲双胍约在20分钟出峰，且溶剂与双氰胺杂质峰能有效分离，故选择流动相为3.4%磷酸二氢铵溶液(用磷酸调pH 值至2.5)。

4.3采用HPLC 法测定
双氰胺为盐酸二甲双胍的一个毒性中间体，本文采用HPLC 法测定盐酸二甲双胍中双氰胺的含量，
结果准确可靠，操作简洁，重现性好，可准确用于盐酸二甲双胍及其制剂中双氰胺的含量测试，有利于进一步控制盐酸二甲双胍及其制剂的质量，以确保临床用药的安全性。

参考文献：
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：化
学工业出版社,2010.
[2]韩杰.HPLC 法测定盐酸二甲双胍片的有关物质[J].
中国新药杂质,2003,12（2）:117-8.
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量[J].中国现代药物应用,2008,2（18）:32-3.
[4]孙桂荣,卢华伟,刘爱云.HPLC 法测定盐酸二甲双胍
缓释片的有关物质[J].中国药业,2004,13（10）：34-5.[5]徐继建,刘华,尚丽江.高效液相色谱法测定复方二
甲双胍格列本脲片中杂质双氰胺的含量[J].中国药房,2006,17(13):1015-1016.。