植物黄酮次生代谢中CHS、CHI基因的相关研究

植物黄酮次生代谢中CHS、CHI基因的相关研究
摘要：黄酮类化合物是一类植物的次生代谢产物，有抗炎、抗病毒、利胆、强心、镇静和镇痛等作用外，还具有抗氧化、抗衰老、免疫调节和抗肿瘤等效果，因此，黄酮类化合物在医药、食品、保健品等方面的应用十分广泛。

在生物合成黄酮途径中，查尔酮合成酶和查尔酮异构酶是关键酶和限速酶。

本文介绍了生物合成黄酮类化合物途径中的CHS、CHI两个基因及其作用机制，简述了研究人员从第一次研究CHS、CHI 基因到现今以来对这两个酶的研究进展，通过总结得出，CHS的开放阅读框在1.2kb左右，大约编码399个氨基酸，CHI基因家族的开放阅读框长为600-15000bp，编码200-400个碱基，两个基因的保守性都比较强。

此外，目前的研究还不能完全揭示各种因子对黄酮类化合物代谢关键酶的转录、表达及活性的影响，还需要在这方面作进一步的研究。

关键词：黄酮类化合物；CHS；CHI
The research of the CHS and CHI genes in Plant secondary
metabolism of flavonoids
YANG Huo-Li
College of life and environment science，Minzu University of China
BeiJing 10081
Abstract:Ｆl avones compounds are a class of important secondary metabolites in plants，Having the effect of anti-inflammatory, antiviral, cholagogue function, cardiac, sedation and analgesia, also having theeffect of anti-oxidation, anti-aging, immunomodulatory and antitumor .it is really popularｉｎMedicine, food, health care products．In the biosynthesis of flavonoids way，Synthetase and chalconeisom erase chalcone is the key enzyme and speed limiting enzyme．This article describes the mechanism of CHSａｎｄＣＨＩｉｎthe biosynthesis of flavonoids way．ｔｈｉｓａｒｔｉｃａｌｄｅｓｃｒｉｂｅｓKeywords:Flavones compounds；CHS；CHI．
前言
黄酮类化合物是一类在高等植物中大量存在的重要次生代谢产物,是植物在长期的生态适应过程中为抵御恶劣生态条件、动物和微生物等攻击具而形成的。

黄酮类化合物有很多重要的功能,如参与花色的形成、UV防护、抵抗病原体等。

目前研究表明,它们还与人类的健康有着密切的关系,具有消除氧自由基、抗炎、抗癌、保护心脑血管系统等多种药理作用[1]。

在生物合成黄酮类化合的路径中，查尔酮合酶(CHS)和查尔酮异构酶（CHI)是其中的关键酶和限速酶。

目前，对这两种酶基因的研究已成为植物次生代谢黄酮类化合物合成路径研究的
重点之一，各专家学者对不同植物中的CHS、CHI基因的研究已较为深入。

如已克隆出拟南芥、白菜、水稻、玉米、大豆、高粱、康乃馨、西洋梨、番茄和葡萄等植物的CHS基因[2-7]。

目前，通过对GenBank已登录的这10 种植物中CHS 基因的研究发现，CHS开放阅读框的全长在1.2 kb 左右，大约编码399 个氨基酸[8]。

自1987年CHI基因首先从法国豌豆中利用抗体技术分离出来以来，CHI基因已陆续从矮牵牛、菜豆、玉米、豌豆、紫花苜蓿、翠菊、橙、水母雪莲等多种植物中克隆出来[9-10]。

本文将针对植物中的CHS、CHI基因研究作一个概述。

1.查尔酮合成酶基因（CHS）
1.1CHS的功能和作用机制
查尔酮合成酶介导了黄酮类化合物合成的第一步，催化三个三分子丙二酸单酰-CoA，与一个分子的香豆酰辅酶A缩合成柚皮素查尔酮，在经由CHI的异构作
用衍生出其他黄酮类化合物[11]。

查尔酮合酶的底物大多来源于苯丙氨酸途径的4-香豆素辅酶A，而在少数一些植物中，查尔酮合酶的底物可以是肉桂酰辅酶A 或咖啡酰辅酶A[12]。

查尔酮合酶基因在不同植物类群中保守性较高，基因含有2个外显子和1个内含子。

内含子的大小及序中的位置比较保守，不同物种中的氨基酸水平的一致性很高，约为79%-91%。

CHS基因的启动子具有多个特异的元件，如与接收激发因子诱导所必须的ACE元件，以及负调控的沉默子、维持基因转录水平的P区[13] 。

1.2 CHS基因的研究进展
对CHS基因的研究最早的是矮牵牛中的CHS基因家族，获得8个CHS基因全长序列和4条CHS基因片段序列，组成一个多基因家族[1]。

从此之后，研究人员对各种植物中CHS 基因的研究更加深入。

杨丽，刘雅莉等[14]根据报道的查尔酮合成酶基因的保守序列，设计了特异简并引物，以东方百合Sorbonne盛开的花瓣总RNA为模板，逆转录合成cDNA第一链，用特异引物对此双链cDNA进行PCR扩增，将扩增后的基因片段回收克隆后，测序得到目的序列长873bp，与已发表的百合中CHS基因的同源性达91%，说明克隆的片段属于查尔酮合成酶基因，GenBank上的登录号为DQ471950。

周琳等[15]以牡丹品种“彩绘”为试材，采用RT-PCR和RACE方法从花瓣中获得了一个牡丹查尔酮合成酶基因cDNA全长，命名为Ps-CHS1,GenBank登录号为GQ483511.序列分析结果表明，Ps-CHS1全长1457pb,包含82bp的5’非编码区、
208pb的3’非编码区和一个长度为1185bp编码394个氨基酸的开放阅读框。

氨基酸序列分析显示该基因编码的蛋白具有CHS家族保守存在的所有功能活性位点和特征多肽序列。

序列比对和系统进化分析表明，Ps-CHS1与杨柳科、锦葵科、蔷薇科等植物的CHS亲缘关系较近，相似度达90%以上。

杨俊波等[16]用PCR方法从石笔木中的总DNA中扩增CHS基因外显子2的部分序列，得到12个序列，经排序和系统树的构建分析，所有被测定的序列同源性均高于70％，为CHS基因家族的成员。

研究者预测，山茶科CHS基因家族较大，且有着复杂的进化式样。

PaIlg等[17]克隆得到了银杏CHS的基因G6C月S(GenBank登陆-号AY647263)，该序列全长1295bp．表达产物的相对分子质量为42 kDa,Southern blot显示其属于多基因家族，并且在根、茎、叶等不同部位的表达情况不同。

2.查尔酮异构酶基
2.1CHI功能和作用机制
在异黄酮合成途径中，查尔酮合成酶(CHS)催化合成反应的第一步，查尔酮异构
酶(CHI)催化第二步反应，由一个香豆酰-CoA和三个丙二酸单酰-CoA在CHS的作用下生成查尔酮。

查尔酮再经过CHI的作用形成二氢黄酮，二氢黄酮再在各种酶的催化下转化为其它各种颜色类型的黄烷酮化合物[18]。

查尔酮异构酶也是植物抗毒素生物合成所必需的酶，分子量因植物的种类而异[19]，约24×103-29×103，其多肽链在不同物种间表现出高度的同源性。

不同植物查尔酮异构酶的同源性为49％～82％，不同类型间查尔酮异构酶的同源性仅有50％左右，但同一类型查尔酮异构酶的同源性可达70％以上[20]。

查尔酮异构酶催化分子内的环化反应，其底物为查尔酮合酶催化合成的查尔酮(4，2’，4’，6’一四羟基查尔酮)或6’-脱氧查尔酮(4,2’，4’,6’-四羟查尔酮)。

查尔酮异构酶的催化活性具有立体异构性，它的催化效率随着反应体系中pH的不同而不同。

当pH为7．5时，催化活性为90％；在pH为6.0时，催化活性只有50％。

按CHI作用底物的不同，可将CHI基因分为2类。

TypeI的CHl只能以6-羟基查尔酮(6-hydroxychalcone)底物，如黄瓜中存在的CHI。

TypeII的CHI一般存在于豆科植物中。

TypeII的CHI既可以6-羟基查尔酮底物，也可以6-脱氧查尔酮(6-deoxychalcone)为底物。

Gensheimer等[21]的研究结果表明，可以把真菌和细菌中的3类CHI蛋白基因家族归为TypeI。

CHI基因为多基因家族。

矮牵牛中含有2个CHI基因，同属于Type 。

豆科植物百脉根中含有3种CHI基因，其中CHI2属于Type I，CHI1和CHI3则同属TypeII。

查尔酮异构酶的整体空间结构像是由开面的D一三明治折叠形成的倒置花束。

这种特殊结构在植物中具有唯一性，已被建议作为一种植物特有的基因及结构标记。

2.2CHI研究进展
查尔酮异构酶是类黄酮合成途径中早期阶段的关键酶之一，是植物花色素苷生物合成和豆科异黄酮植物植保素合成所必需的酶，它以单体的形式普遍存在于大多数植物中，其蛋白的三维折叠结构在植物中具有唯一性，已被看成是一种植物特有的基因标记l。

因此，基因调控机制的研究对于了解豆科植物异黄酮生物合成特性和花色形成的分子机制有重要的意义。

1987年，Mehdy等[22]利用抗体技术首次从法国豌豆中分离出C胁基因，1988年van Tunen AJ[23]从矮牵牛中克隆了两个CHI基因：CHIA与CHIB基因。

CHIA基因全长726bp，编码241个氨基酸；CHIB基因全长2170bp，编码220个氨基酸。

在植物的不同组织中，这两个基因的表达具有特异性，通常在成熟的花冠和雄蕊中表达CHIA，在未成熟的花药中表达CHIB。

1994年，Wood AJ等[24]从豌豆上胚轴中克隆得到CHI基因，基因全长986 bp，编码233个氨基酸，其氨基酸组成与矮牵牛和菜豆的氨基酸序列具有较高的同源性。

2006年，Li等[25]从水母雪莲eDNA文库中分离得到CHI基因与其CHI基因组序列相同，都为699bp，没有内含子的存在。

迄今在细菌中也分离到类CHI蛋白，如在人类粪便的厌氧真细菌中也纯化至UCHI蛋白，这种蛋白具有异构化柚皮素、紫铆因、异甘草素的活性，能将这些物质异构化，然后还原、脱水，最后降解成间苯三酚和3-(4-羟基)-丙氨酸。

李军等[26]采用逆转录一聚合酶链式反应(RT．PcR)以及温度非对称交互PCR(TAIL-PCR)方法，从大花美人蕉花瓣组织中扩增查尔酮异构酶基因(CHI)的全长eDNA(678 bp)，编码226个氨基酸，其氨基酸组成与其它已知的高等植物CHI基因具有很高的同源性，与葡萄、草莓、丁香、柑桔．矮牵牛、洋葱及玉米的同源性分别为82％、79％、80％、80％、79％、8l％和76％。

马春雷等[27]采用EST测序技术和T4砌叮A连接酶介导的5'RACE技术，获得了一个茶树儿茶素代谢中的重要基因一查尔酮异构酶(CHI)基因，在GenBank登录(DQ904329)，其序列全长1163bp，其中开放阅读框长723 bp，编码240个氨基酸，3’端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号，推测的蛋白分子量约为26.4 kD，理论等电点为5.19。

序列分析表明它与番茄CHI基因序列的亲缘关系比较近。

周军等[28]从一年生“巨峰”扦插苗中克隆了CHI基因，序列分析表明：CHI基因序列中含有3个内含子，4个外显子。

信息学分析显示，CHI基因编码的多肽链既没有信号肽，也
不存在跨膜结构域，且亚细胞定位于细胞质中。

半定量RT-PCR分析结果表明，CHI基因在果皮、果肉、种子及幼叶和幼根中都表达，但不同的组织中表达方式不同。

迄今，已获得了20余种植物的CHI基因，主要为观赏植物花色育种研究和提高果蔬、药用植物黄酮化合物含量等方面。

3.总结
黄酮类化合物是植物重要的次级代谢产物之一，随着分子生物学尤其是基因测序技术的不断发展，迄今已经克隆、鉴定了许多种植物黄酮类化合物生物合成相关酶的机构基因，并进行了一些黄酮合成代谢的分子调控研究。

有关学者已经对不少植物查尔酮合酶和查尔酮异构酶进行转化研究，以达到了解黄酮类生物合成过程中的相关酶基因的作用机制、表达部位等目的。

然而到目前为止，所克隆的CHS和CHI基因主要集中于草本植物，主要为观赏植物花色育种研究和提高果蔬、药用植物黄酮化合物含量等方面的研究，而对木本植物的基因克隆的研究较少，因而，科研工作者还需加强对木本植物CHS和CHI基因的克隆，尤其是全长cDNA的克隆，为这两个重要基因的应用提供更多方向。

尽管黄酮类化合物生物合成技术已经引起越来多学者的关注，但是，目前的研究还不能完全揭示各种因子对黄酮类化合物代谢关键酶的转录、表达及活性的影响。

因此还需要进一步研究调控黄酮类化合物的信号分子及其调控途径、调控机理，为深入研究黄酮类化合物生理活性的作用机制提供基础。

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