淋巴细胞标志检测
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细胞免疫学检测 （cellular immunoassay）
一、淋巴细胞表面标志物检测 (Assay of membran molecules for
lymphocytes）
一、免疫细胞分离技术 (Technic of separation for immunocyte)
二、免疫细胞表面标志检测技术 （Assay of membran molecules for ～ ）
二、方法(method)： 1、自然沉降法
（直立静置RT30～60min，紧贴红细胞层上的白 膜层） 2、聚合物加速沉降法
（加某些高分子物使RBC凝集成串加速沉降，如 明胶）
人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）的分离
加入对倍稀释的血液样本
三、免疫细胞功能检测技术 （Assay for Immunocyte Tuntion ）
四、细胞因子与黏附分子检测技术 （Assay for Cytokine and Adhesion
mHale Waihona Puke Baidulecule）
免疫系统(Immune system)
免疫器官(Immune Organs) 免疫细胞(Immunocyte)★ 免疫球蛋白(Immunoglobulin) 主要组织相容性复合体
前应去除死细胞；上分离柱前，充分振荡混悬细胞， 打散细胞团块。 用分离柱分选，应用真空抽滤水，减少水中气泡，使 分离柱不被气泡阻滞
Lymphocytes + sRBC , centrifugation----T lympho-cytes(底) / B lympho-cytes（界面）
2、黏着性（理化）： B淋巴细胞易黏附聚酰胺纤维（尼龙纤维）表面，而T 淋巴细胞则不易附着～
（例）尼龙棉柱分离 — 直接流出的是T淋巴细胞。 3、免疫学：用特异性抗体并使其固相化，捕获具特定
由下而上的逐减的连续密度梯 度(density gradient)
淋巴细胞纯度98%, 单核细胞 纯度78%
流程长, 步骤繁, 成本高
人外周血淋巴细胞(亚群)的分纯 (purificcation)
人外周血单个核细胞（PBMC）主含淋巴细胞, 但混有 单核细胞、粒细胞、红细胞和血小板等。淋巴细胞的分纯： （一）红细胞的去除（0.83%氯化铵、蒸馏水） （二）血小板的去除（离心、洗涤） （三）单核、粒细胞的去除（黏附去除，羰基铁粉吞噬） （四）淋巴细胞亚群的分离★
水平式离心20min时结果
聚蔗糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque)
(1.077±0.001g/L)
分离人外周血淋巴细胞以密度为1.077±0.001/g/L
Percoll混悬液(处理过的硅胶 颗粒)
原液密度(density)为 1.135g/L+等量PBS, 高速离心
(centrifugation)
②与FACS 相比，本方法操作简单、省时、经济；可用 做FACS分选前的预分离，以减少FACS所用时间。
③另外连续两次过柱分选可进一步提高分选细胞纯度， 通常可达95－99％。
注意事项（Attentions）
如果分离细胞用作培养，全过程在超净台中完成。 分离柱一般只能一次应用，再用时分离效率降低。 抗体包被磁珠和死细胞常有非特异性结合，因而分选
(Major Histocompatibility Complex; MHC) 细胞因子(Cytekine) 白细胞分化抗原和粘附分子(Leukocyte
Differentiation Antigen and Adhesion molecule)
免疫细胞(immune cells)
指:所有参与免疫应答或与免疫应答有 关的细胞
淋巴细胞亚群的分离
分离依据： 1、淋巴细胞不同亚群其细胞表面标志（ specific membrane molecule/surface marker） 2、淋巴细胞不同亚群其细胞分化抗原（antigen of cluster differentiation ；CD）
分离方法：
1、
Precipitation of E rosette
Erythrocyte Rosette forming cell; ERFC
The sueface of T lymphocyte contains the receptor (CD2) of sheep erythrocyte ,which is called E receptor for short . T lymphocytes can form E rosette with sheep erythro-cytes by its E receptor.
包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核吞噬 细胞、树突状细胞及其他细胞
免疫细胞分离技术 (Separation of immunocytes)
人外周血(peripheral blood )白细胞分离
一、原理(principle)： 红细胞/白细胞比例不同（600～1000）：1， 密度不同，沉降速度不同。
正选（positive selection）法： 磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞
负选（negtive selection）法： 磁珠结合不需要的细胞，游离于上清液的 细胞为所需细胞
一般而言，负选法比正选法的磁珠用量大
评价(evalution)：
①免疫磁珠分离法具有高纯度（8099％），高得率 （9095％）、高细胞活性（99~100%）的特点，仅次 或相当于流式细胞仪（FACS）的分选效率。
膜抗原的细胞～
（例）1、亲和板结合分离 (affinity ～)
2、免疫磁珠分离
（immunomagnetic beads）
3、流式细胞术分离
(FCM)
磁性微珠(magnetic beads):
磁性微珠是以金属离子为核心， 外层均匀包裹高分子聚合体的 固相颗粒。
磁性微珠上既可标记针对某种细 胞表面抗原的特异性抗体（直 接法）; 也可标记羊抗鼠IgG抗 体(间接法），使分离细胞的范 围大大扩大
一、淋巴细胞表面标志物检测 (Assay of membran molecules for
lymphocytes）
一、免疫细胞分离技术 (Technic of separation for immunocyte)
二、免疫细胞表面标志检测技术 （Assay of membran molecules for ～ ）
二、方法(method)： 1、自然沉降法
（直立静置RT30～60min，紧贴红细胞层上的白 膜层） 2、聚合物加速沉降法
（加某些高分子物使RBC凝集成串加速沉降，如 明胶）
人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）的分离
加入对倍稀释的血液样本
三、免疫细胞功能检测技术 （Assay for Immunocyte Tuntion ）
四、细胞因子与黏附分子检测技术 （Assay for Cytokine and Adhesion
mHale Waihona Puke Baidulecule）
免疫系统(Immune system)
免疫器官(Immune Organs) 免疫细胞(Immunocyte)★ 免疫球蛋白(Immunoglobulin) 主要组织相容性复合体
前应去除死细胞；上分离柱前，充分振荡混悬细胞， 打散细胞团块。 用分离柱分选，应用真空抽滤水，减少水中气泡，使 分离柱不被气泡阻滞
Lymphocytes + sRBC , centrifugation----T lympho-cytes(底) / B lympho-cytes（界面）
2、黏着性（理化）： B淋巴细胞易黏附聚酰胺纤维（尼龙纤维）表面，而T 淋巴细胞则不易附着～
（例）尼龙棉柱分离 — 直接流出的是T淋巴细胞。 3、免疫学：用特异性抗体并使其固相化，捕获具特定
由下而上的逐减的连续密度梯 度(density gradient)
淋巴细胞纯度98%, 单核细胞 纯度78%
流程长, 步骤繁, 成本高
人外周血淋巴细胞(亚群)的分纯 (purificcation)
人外周血单个核细胞（PBMC）主含淋巴细胞, 但混有 单核细胞、粒细胞、红细胞和血小板等。淋巴细胞的分纯： （一）红细胞的去除（0.83%氯化铵、蒸馏水） （二）血小板的去除（离心、洗涤） （三）单核、粒细胞的去除（黏附去除，羰基铁粉吞噬） （四）淋巴细胞亚群的分离★
水平式离心20min时结果
聚蔗糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque)
(1.077±0.001g/L)
分离人外周血淋巴细胞以密度为1.077±0.001/g/L
Percoll混悬液(处理过的硅胶 颗粒)
原液密度(density)为 1.135g/L+等量PBS, 高速离心
(centrifugation)
②与FACS 相比，本方法操作简单、省时、经济；可用 做FACS分选前的预分离，以减少FACS所用时间。
③另外连续两次过柱分选可进一步提高分选细胞纯度， 通常可达95－99％。
注意事项（Attentions）
如果分离细胞用作培养，全过程在超净台中完成。 分离柱一般只能一次应用，再用时分离效率降低。 抗体包被磁珠和死细胞常有非特异性结合，因而分选
(Major Histocompatibility Complex; MHC) 细胞因子(Cytekine) 白细胞分化抗原和粘附分子(Leukocyte
Differentiation Antigen and Adhesion molecule)
免疫细胞(immune cells)
指:所有参与免疫应答或与免疫应答有 关的细胞
淋巴细胞亚群的分离
分离依据： 1、淋巴细胞不同亚群其细胞表面标志（ specific membrane molecule/surface marker） 2、淋巴细胞不同亚群其细胞分化抗原（antigen of cluster differentiation ；CD）
分离方法：
1、
Precipitation of E rosette
Erythrocyte Rosette forming cell; ERFC
The sueface of T lymphocyte contains the receptor (CD2) of sheep erythrocyte ,which is called E receptor for short . T lymphocytes can form E rosette with sheep erythro-cytes by its E receptor.
包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核吞噬 细胞、树突状细胞及其他细胞
免疫细胞分离技术 (Separation of immunocytes)
人外周血(peripheral blood )白细胞分离
一、原理(principle)： 红细胞/白细胞比例不同（600～1000）：1， 密度不同，沉降速度不同。
正选（positive selection）法： 磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞
负选（negtive selection）法： 磁珠结合不需要的细胞，游离于上清液的 细胞为所需细胞
一般而言，负选法比正选法的磁珠用量大
评价(evalution)：
①免疫磁珠分离法具有高纯度（8099％），高得率 （9095％）、高细胞活性（99~100%）的特点，仅次 或相当于流式细胞仪（FACS）的分选效率。
膜抗原的细胞～
（例）1、亲和板结合分离 (affinity ～)
2、免疫磁珠分离
（immunomagnetic beads）
3、流式细胞术分离
(FCM)
磁性微珠(magnetic beads):
磁性微珠是以金属离子为核心， 外层均匀包裹高分子聚合体的 固相颗粒。
磁性微珠上既可标记针对某种细 胞表面抗原的特异性抗体（直 接法）; 也可标记羊抗鼠IgG抗 体(间接法），使分离细胞的范 围大大扩大