葡聚糖酶酶活测定
β-1,3 葡聚糖酶(β-1,3-GA活性检测试剂盒说明书__可见分光光度法UPLC-MS-4216
β-1,3葡聚糖酶（β-1,3-GA）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法：UPLC-MS-4216：50T/24S试剂名称规格保存条件提取液液体50mL×1瓶2-8℃保存试剂一粉剂×2支2-8℃保存试剂二液体42mL×1瓶2-8℃保存标准品粉剂×1支2-8℃保存溶液的配制：1.试剂一：临用前取1支加1.6mL蒸馏水溶解，用不完的试剂2-8℃保存4周；2.标准品：10mg无水葡萄糖。
临用前加入1mL蒸馏水溶解，配制成10mg/mL葡萄糖溶液备用，2-8℃保存2周。
β-1,3-GA(EC3.2.1.73)主要存在植物中，催化β-1,3-葡萄糖苷键水解。
在植物染病或处于其他逆境条件下，可诱导细胞大量合成β-1,3-GA，因此β-1,3-GA活性测定广泛应用于植物病理和逆境生理研究。
β-1,3-GA水解昆布多糖，内切β-1,3-葡萄糖苷键，产生还原末端，通过测定还原糖生成速率，来计算其酶活性。
Fucoidanβ-1,3-GA Reducing SugarReducing Sugar+3,5-Dinitrosalicylic Acid3-Amino-5-Nitrosalicylate（540nm）注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、超声破碎仪、冰和蒸馏水。
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。
12000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2.细菌或细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率200w超声3s，间隔10s，重复30次）；12000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
β-葡聚糖酶活性测定
β-葡聚糖酶活性测定β-葡聚糖是由葡萄糖单体通过β-1，3和β-1，4糖苷键连接而成的D型葡萄糖聚合物，它主要存在于单子叶禾本科谷实中的糊粉层和胚乳细胞壁中。
β-葡聚糖酶属于水解酶类，能有效地降解β-葡聚糖分子中的β-1，3和β-1，4糖苷键，使之降解为小分子。
由于在饲料中，大麦的β-葡聚糖含量较高，难以被单胃动物消化利用，而且对饲料中各种养分的消化利用具有明显的干扰和抑制作用，成为麦类饲料中的抗营养因子。
在饲料中添加β-葡聚糖酶，能有效地消除β-葡聚糖的抗营养作用，促进饲料中各种养分的消化和吸收利用，增进畜禽健康。
在啤酒生产中，添加β-葡聚糖酶可以加快麦汁和啤酒的过滤速度、提高麦汁得率、增加可发酵糖的含量。
此外，β-葡聚糖酶在造纸工业、日化工业等其它许多方面也有着广泛的应用，对β-葡聚糖酶的研究将越来越受到人们的重视。
β-葡聚糖酶活力的测定方法主要有3种：还原糖测定法（分光光度法）、粘度测定法和底物染色法。
其中还原糖测定法简便实用，比较准确，而且结果重复性好，是广泛使用的一种酶活测定方法。
其原理是：β-葡聚糖酶能将β-葡聚糖降解成寡糖和单糖，其具有的还原基团在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应，显色的深浅与还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中β-葡聚糖酶的活力成正比，因此，可以利用比色测定反应液的吸光度值来计算还原糖的生成量，从而得出β-葡聚糖酶的活力。
但在该测定方法的具体操作中存在一些影响酶活力测定结果的因素，本文即对还原糖法测定β-葡聚糖酶活力的几个重要影响因素进行研究，并得出最佳测定条件。
1 材料与方法1.1 菌株与培养基1.1.1 发酵产酶菌株黑曲霉（Aspergillus niger）A47菌株，由本实验室保藏。
1.1.2 固态发酵培养基麸皮70 g、米糠27 g、NH4NO3 2.95 g、微量元素液0.05 ml、蒸馏水100ml，pH值5.0，121 ℃灭菌20 min。
酶活力测定方法
蛋白酶活力测定: 参照中华人民共和国专业标准SB/ T10317-1999蛋白酶活力测定方法( Asha 等, 2007)。
纤维素酶DNS酶活力测定方法DNS, 活力, 纤维素酶, 测定1 定义1g固体酶粉在40℃和pH值4.2条件下，每分钟水解纤维素生成1微克葡萄糖的量为1个酶活力单位，以u/g表示。
2 原理纤维素酶分解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将3，5二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量，表示酶的活力。
3.试剂和溶液3.1 1％葡萄糖标准溶液（同β－葡聚糖酶酶活测定）3.2 羧甲基纤维素钠(CMC)溶液取1g羧甲基纤维素钠（粘度300～600厘泊）,加入pH4.2的磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液(甲液414ml和乙液586ml并用pH计校正至pH为4.2)混合均匀,水浴加热至溶,冷却后用2M 盐酸或氢氧化钠调节pH到4.2,定溶至100ml,再用二层纱布过滤，此溶液在4℃冰箱贮存，有效期3天。
取滤液100ml，20ml，蒸馏水40ml，混匀，贮冰箱备用。
3.3 DNS 试剂（同β－葡聚糖酶酶活测定）4仪器和设备4.1恒温水浴锅(40℃±0.2℃)4.2分光光度计含10mm比色皿，可在550nm处测量吸光度。
5测定步骤5.1 标准曲线绘制分别吸取1%葡萄糖标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml于50ml容量瓶中，用蒸馏水制成每ml分别含有葡萄糖0、200、400、600、800、1000、1200mg的稀标准液。
各取不同浓度的稀标准液0.5ml于试管中，加入CMC溶液1.5ml、DNS试剂3.0ml，于沸水浴中沸腾7min，取出后立即加入蒸馏水10ml混匀。
冷却后，用10mm比色皿，在波长550nm处用分光光度计分别测定其吸光度。
以吸光度为纵坐标，相对应的葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。
基因工程菌EGs2产β-葡聚糖酶条件优化及产酶特性
农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2007,15(4):708~712*基金项目： 国家自然科学基金 （No.20276064） 资助。
**通讯作者。
Author for correspondence.教授， 博导， 主要从事食品微生物相关的研究。
Email:<gqhe@>. 收稿日期：20061225 接受日期： 20070316 ·研究论文· 基因工程菌 产 茁 葡聚糖酶条件优化及产酶特性 *李青青 1 , 陈启和 1 , 蒋孝燕 1, 张秀艳 2 , 李 婷 1 , 何国庆 1 ** (1.浙江大学食品科学与营养系， 杭州 310029； 2.华中农业大学食品安全与微生物学系， 武汉 430070)摘要： 用乳清粉作为主要培养基组成， 采用正交试验对大肠杆菌 （ ） 重组菌 的发酵条件进行了优化，并 对粗酶液的酶学性质进行了研究。
重组菌 的最佳发酵条件为： 摇床转速 170r/min ， 接种量 1%， 发酵培养基初始 pH 6.0，种龄12h 。
重组菌茁 葡聚糖酶的表达与菌体生长呈正相关， 发酵 14h 后， 菌体生物量最高可达1.71g/L ， 茁 葡聚糖酶活力最高可达 321.56U/mL 。
所得粗酶液的最适反应温度 60 ℃,pH 6.0， 在 70 ℃以下保温20min 后， 残余酶活力均在 80%以上。
在pH 5.0～9.0放置48h 后仍能保持均90%以上的残余酶活力。
关键词： 茁 葡聚糖酶；重组菌 EGs2； 发酵条件； 酶学性质 中图分类号: S182 文献标识码:A 文章编号:10061304(2007)04070805Optimization of Recombinant Fermentation ConditionAffecting 茁glucanase Production and Its Characteristics of Enzyme LI Qingqing 1 ,CHEN Qihe 1 ,JIANG Xiaoyan 1 ,ZHANG Xiuyan 2 ,LI Ting 1 ,HE Guoqing 1**The fermentation conditions of mutant obtained from directed evolution for thermostable 茁glucanase for 茁glucanase production were investigated by orthogonal experiment.Fermentation was conducted in 250mL flask,each containing 30mL of medium contained whey 10g/L,yeast extract 5g/L,NaCl 10g/L,the temperature was 37 ℃.The optima culture conditions were as following:initial pH 6.0,shaking speed 170r/min,inoculation volume 1%and inoculation time 12h. 茁 glucanase production by mutantwas associated with cell growth and biomass. 茁glucanase activity was increased significantly when cells entered growth phase.The bacterium began the stable phase after cultured for 14h with the highest biomass 1.71g/L and 茁glucanase activity 321.56U/mL.When 茁 glucanase was used as a substrate,the optimum temperature and pH were 60 ℃ and 6.0,respectively. After 20min incubation at 40,50,55,60,65and 70 ℃ respectively,the residual activity remained at least 80%.After 48h conserva tion at pH 5.0~9.0,the residual activity remained at least 90%.The enzyme was stable below 70 ℃ and at pH 5.0~9.0.茁glucanase;mutant ;fermentation condition;enzyme characteristic茁1,31,4 葡聚糖酶是重要的工业用酶。
病原菌细胞壁诱导下球毛壳菌葡聚糖酶活测定及抑菌试验
ｐａｔ ａ ｏｅ ｅ ａ ｓ ｂ ｔｈ ｎｙ ｅａｔ ｉｅ ｅｅｄ ｆｒ ｔ Ｔ ｅｐ一１ ３一ｇ ｃｎｓ ｃｉ ｔ ｗ ｓ ｉ ｉｃｎ ｌ ｔ ｇｎｃｌｗ ｌ ， ｕ ｅｅ ｚｍ ｃｉ ｔ ｓ ｒ ｉｅｅ ． ｈ ｎｐ ｈ ｌ ｌ ｔ ｖｉ ｗ ｆ ｎ ， ｌ ａ ａｅａｔ ｉ ａ ｇ ｆ ａ ｔ ｕ ｖｙ ｓｎｉ —
ａ ｄ Ｐ．ｇ ｉ ａ ｍｏｅｅｆｃｉｅｙ ｎ ｒ ｅ ｒ ｆ ｔ ｌ ．Ｃ ａ ｔｍｉｍ ｌｂｓ ｍ ｏ ｌ ｒｄ ｃ 一１ ３ 一ｇｕ ａ ａ ｅｕ ｄ ｒｉｄ ｃｉｎ ｗ ｔ ｉ ｓ ｅ ｖ ｈ ｅｏ ｕ ｇｏ ｏｕ ｃ ｕｄ ｐｏ ｕ ｅ Ｂ ， ｌｃ ｎ ｓ ｎ ｅ ｎ ｕ ｔ ｉ ｓ ｏ ｈ ｘ
０ ６ ｆ ｒ １ ａ ｓ ｉ ｄ ｃｉ ｎ ｗｉ ） ｉｕａ ｉ ｒ ｅ ｅｌｗ ｌ ，ｗ ｉ ｈ ｃｉ ｉ ｅ ｒ ｅ ｐ ｃｉｅ ｙ ｍｕ ｈ ｌｗ ｒ ． １ ａｔ ｄ ｙ ｎ ｕ ｔ ｔ Ｐ ， ｃ ｌｒａ ｇ ￣ ａ ｃ ｌ ａｌ Ｕ ｅ １ ｏ ｈ ｒ ｓ ｈ ｌ ｔ ｅ ａ ｔ ｔ ｓｗｅｅ ｒ ｓ ｅ ｔ ｌ ｃ ｏ ｅ ｅ ｖｉ ｖ
显 。在 ６种植 物病 原真 菌细胞壁 诱 导下 ， 球毛 壳 菌可产生 Ｂ一１３一葡聚糖 酶 ， ， 但是 产 酶规律 不 同。
在稻 瘟病 菌 、 立枯 丝核 菌和 尖孢 镰 刀 茵细胞 壁诱 导 下 ， Ｂ一１ ３一葡聚 糖 酶 活要 明 显 高 于杨树 烂 皮 ，
病菌、 核盘 茵和 叶枯 茵。其 中 ， 稻 瘟病 茵 细胞壁诱 导 ｌ 在 １ ｄ后 ， 酶活 达到最 高 ， ０ ６ 而杨树 烂 为 ． １Ｕ； 皮病 菌和 叶枯 茵细胞壁 的诱 导产酶 效果 最差。球毛 壳 菌可作 为生物防 治真 菌。 关 键词 ： 毛 壳菌 ； 球 生物 防 治 ； Ｂ一１３一葡聚糖酶 ， 中图分类 号 ：７ ３ １ ￥６．５ 文献标 识码 ： Ａ 文章编号 ：０ ３— １９ ２ １ ） ３— ０ ０— ４ １０ ７ ７ （０ ０ ０ ０ ５ ０
β-葡聚糖测定方法
β-葡聚糖酶活力测定方法(NY/T911-2004)∙ 1.原理β-葡聚糖酶能将木聚糖降解成还原性糖。
还原性糖在沸水浴条件下可以与3,5-二硝基水杨酸（DNS)试剂反应显色反应。
反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中β-葡聚糖酶的活力成正比。
因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中β-葡聚糖酶的活力。
∙ 2. 操作∙ 2.1.标准葡萄糖曲线的制作2.1.1 吸取PH5.5的0.1M乙酸-乙酸钠+缓冲溶液4.0mL,加入DNS试剂5.0mL，沸水浴加热5min。
用自来水冷却至室温，用水定容至25.0mL,制成标准空白样。
2.1.2 分别吸取葡萄糖溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL和7.00mL,分别用PH5.5的0.1M醋酸缓冲溶液定容至100mL,配制成浓度为0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL、0.40mg/mL、0.50mg、0.60mg/mL和0.70mg/mL葡萄糖标准溶液。
2.1.3 分别取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00mL（做两个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2.0mL缓冲液94.4)和5.0mLDNS试剂。
电磁振荡3s-5s,沸水浴加热5min。
然后用自来水冷却到室温，在用水定溶液至25mL。
以标准空白为对照调零，在540min处测定吸光度A值。
以葡萄糖糖浓度为Y轴、吸光度A值为X轴，绘制标准曲线。
每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线∙ 3. 酶样测定吸取10.0mLβ-葡聚糖溶液,37℃平衡20min。
吸取10.0经过适当稀释的酶液，37℃平衡10min。
∙吸取2.00mL经过适当稀释的酶液（已经过37℃平衡），加入到刻度试管中，再加入5mLDNS试剂，电磁振荡3s-5s。
然后加入8.0g/lβ-葡聚糖溶液2.0ml，37℃保温30min,沸水浴加热5min。
SOD酶活力测定实验
摘要：通过对绿豆种子的研磨破碎获得SOD粗酶，经过硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩等过程，除去粗酶液中的杂质及干扰蛋白，采用葡聚糖（Sephadex G-100）凝胶层析得到纯化的SOD酶。
跟踪提纯过程活性的分布，并评价提取过程各步骤的效率。
实验结果证实随着不断的分离提纯，总活力以及总蛋白不断减小，比活力不断上升，最终得到的结果为总纯化倍数为0.68，活性得率为5.24%。
一、前言：超氧化物歧化酶简称SOD，是一种新型酶制剂，属金属酶。
分布很广，几乎从哺乳动物到细菌，以及植物中均存在。
在微生物中主存于需氧菌。
SOD是催化超氧阴离子（O2-）歧化反应的酶类，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.－），生成H2O2和O2.H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O 和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。
它的存在与生物体内的解毒作用有关，也发现与机体的衰老、肿瘤及免疫性疾病等有关。
自1968 年发现SOD 后，立刻引起科学界的高度重视，近40 年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD 也有了产品.国外从牛红细胞中制得的超氧化物歧化酶，其商品名为Orgotein.不少人研究Orgotein的药理性质，证明它无毒，无抗原性，能抗发炎、抗超氧离子、抗病毒感染。
二十世纪80 年代后期，我国关于SOD 的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。
SOD作为治因而受到医药界的关注。
目前中国国内已进入临床试验阶段。
本实验以绿豆为原料提取SOD，通过各步的分离提纯，应测得酶总活力逐渐减小，比活逐渐升高.通过本实验掌握物质分离纯化的实验设计过程，以及硫酸铵分离、透析除盐、浓缩和葡聚糖凝胶层析等物质分离技术。
二、实验材料与方法：<一>材料:绿豆种子,市售新鲜绿豆种子浸泡蒸馏水24小时备用.<二>试剂:葡聚糖（sephadexG-100）, NaCl（AP）, 磷酸氢二钠（AP）, 磷酸二氢钠（AP）, 三羟甲基氨基甲烷（Tris）, 盐酸（浓盐酸），硫酸铵（AP）, PEG6000 ，考马斯亮蓝G250 , 磷酸，乙醇（95%），牛血清蛋白BSA , 连苯三酚(焦性没食子酸), EDTA(钠盐) , 超氧化物歧化酶（sigma公司）。
饲用木聚糖酶、β—葡聚糖酶活力测定方法的调研
前 言
饲 用 酶 制 剂 在 畜 牧业 上 的广 泛 应 用 使 酶 质
量 的度量 问题 显得 格 外 重要 。酶 活 的测 定方 法 和 酶活 的定 义 密 切相 关 。 为 了适 应 市 场 的需求 ，酶
件 做 了许 多试 验 。Ｂ ｄｏｄ １９ ） 不 同酶 种在 不 ｅｆｒ（９ １对
维普资讯
＜ 料 角 ２０ 年 ５ 饲 广 ｝ ２ 第１期 ０
斟 技 钡 野
饲用 木聚糖 酶 、 一葡 聚糖 酶活力 测定 方法昀 调研 １ ３
王在 贵 － 张 宏福 何瑞 国 －
（－ 中国农业科 学院畜牧研究 所 ； 华 中农业 大学动物科技学 院） ｚ
学 者 的认 可 。 ３ 酶 底 物 的选 择 及底 物 浓 度 ．
＜ 料 角 ２０ 年 ５ 饲 广 ｝ ２ 第１期 ０
缓 冲 液 及 其 浓 度 的 选 择 对 反 应 体 系 的 离 子 强
电 ： １ ６ ７ ６ ６１ ４０６１ ４ ２ ５ ３ 话（０ ８ ５ ６ ２ ５ ２ ５ ２６ ４ ６ ０ ）９ ８ ４ ６ ４ ６ １４
传 ：１） １ ４ 真 （０ ２ ２ １ ０ ６７ ０
团
维普资讯
科 技 钡 野
由表 ２可 知 ，国内外 各单 位对 酶 活 测定 的温 度 一 般 都选 在 ４ ％或 ５ ℃ ， ０ Ｏ 由于动 物 消 化道 的温 度接 近 ４ ℃ ，所 以在 ４ ℃ 条件 下 测 定酶 的 活性 ， ０ ０ 比较 接 近 酶 的生 物学 活 性 。这 一观 点 已得 到许 多
ｐ ５３ ｐ ４ ５ Ｈ ． ，Ｈ ． ｐ ４ ６，Ｈ ． ，Ｈ ． ｐ ４ ８ Ｈ ． ｐ ５ ０ ｐ ７ ２，Ｈ ．
测定方法 的条件都 未统 一 ， 酶活测定方法 的统一存在 一定
酶活测定方法
酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力的测定随着生物技术的发展及环保要求的提高，越来越多的酶制剂应用于制革生产中。
比如浸水，脱毛，软化，脱脂等工序都用到大量的酶制剂，从酶的作用性质来看制革生产中用到的主要是蛋白酶和脂肪酶。
啤酒用β-葡聚糖酶高产菌株的选育及发酵条件优化
*基金项目：浙江省科技计划项目(No.011101123)。
郑元平：男，1972年生，博士研究生。
**通讯作者。
Author for correspondence.Email:<yuankp@>.收稿日期：2003-04-28接收日期：2003-08-27。
农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2004,12(3):316~321·研究论文·啤酒用β-葡聚糖酶高产菌株的选育及发酵条件优化*郑元平袁康培**冯明光(浙江大学微生物研究所，杭州310029)摘要：对产β-葡聚糖酶的地衣芽孢杆菌()A302菌株进行紫外线和硫酸二乙酯(DES)复合诱变和选育，获得产β-葡聚糖酶达27.3U/mL 的突变株遥采用均匀实验设计对菌株产β-葡聚糖酶的液体培养基组成及发酵条件进行优化实验，所获优化配方(W/V)为麦麸1.41%，鱼粉0.80%，硝酸钾0.34%，硫酸镁0.11%，起始pH 6.0；用含孢量108个/mL 的种子菌液按体积比3.3%接种上述液体培养基，在36℃下发酵52h ，菌株的产酶活力达到115.1U/mL ，是原出发菌株及培养条件下产酶活力的9.4倍。
对突变株所产β-葡聚糖酶性质的研究表明，该酶最适作用温度为60℃，最适作用pH 为5.5，适用于啤酒生产中的麦芽糖化。
关键词：β-葡聚糖酶；菌种选育；物理化学诱变；均匀设计；发酵Breeding of a Bacterial Strain for Efficient Production of Beer-purposeβ-glucanase and the Optimized Conditions for Its FermentationZHENG Yuan-Ping YUAN Kang-Pei**FENG Ming-Guang(Institute of Microbiology,Zhejiang University,Hangzhou 310029,China)A mutantwas generated from mutagenesis ofstrain A302by inducing ultraviolet radiationand treating with 1%diethyl sulfate solution and could produce β-glucanase at the level of 27.3U/mL.Based on uniformexperimental design and data analysis,components of an ideal liquid medium (W/V)for maximal production ofβ-glucanaseincluded 1.41%wheat bran,0.80%fish meal,0.34%potassium nitrate and 0.11%magnesium sulfate.The optimal conditions for fermentation were determined at 36℃,initial pH of 6.0and seed culture of 2%(V/V)containing 108spores/mL.Based on the optimized medium and conditions for fermentation,a 52h period of incubation allowed the mutant to produce the β-glucanaseat an activity level of 115.1U/mL,which was as high as 9.4folds of the level for the original strain A302.The enzyme functionedoptimally at pH 5.5and 60℃,which indicated that it was fit for beerproduction.β-glucanase;breeding of bacterial strains;physiochemical mutagens;uniform experimental design;fermentationβ-葡聚糖是一种非淀粉性多糖，广泛存在于植物和微生物的细胞壁中，不同来源的β-葡聚糖其糖苷键的结合方式和比例不同。
乳糖诱导基因工程菌产_葡聚糖酶及其酶学特性的研究
206戴易兴，王洪新，吕文平*，孙军涛，秦晓娟（江南大学食品学院，江苏无锡214122）摘要：考察了乳糖替代IPTG 诱导重组大肠杆菌产β－葡聚糖酶的可行性，分别对乳糖作为诱导剂时的终浓度、诱导时机、诱导时间和温度等方面进行了研究。
结果表明，工程菌培养6h （OD 600达到0.7左右）后，加入终浓度为10mmol /L的α－乳糖，升温至41ħ，诱导6h ，酶活可达到830.7U /mL 。
与IPTG 相比，酶活提高2倍左右，发酵周期缩短70%。
该酶pH 稳定范围较宽，热稳定性良好，在生理温度（70ħ左右）下活性高，说明乳糖可以作为基因工程菌的高效诱导剂。
关键词：基因工程菌，β－葡聚糖酶，乳糖，IPTG ，酶学特性Expression and characteristic of β－Glucanase inEscherichia coli induced by lactoseDAI Yi －xing ，WANG Hong －xin ，LV Wen －ping *，SUN Jun －tao ，QIN Xiao －juan （School of Food Science and Technology ，Jiangnan University ，Wuxi 214122，China ）Abstract ：The feasibility of expression of β－Glucanase in recombinant E .coli BL 21induced by lactose instead ofIPTG was studied .The main factors of induction such as terminal concentration of lactose ，the optimal time of induction ，the duration and temperature of induction were analyzed .The results showed that the optimal condition was to add 10mmol /L （terminal concentration ）lactose when the cell density achieved to OD 6000.7，changed the temperature from 37ħto 41ħand induce 6h .The maximum enzyme activity of 830.7U /mL induced by lactose was higher 2times than IPTG ，and the period of fermentation shortened 70%.The enzyme was stable at pH 6 8，and thermal stability ，as well as high activity at the physiological temperature （about 70ħ）.The research demonstrated that lactose could be used as an efficient inducer of genetically engineered strain .Key words ：genetically engineered strain ；β－Glucanase ；lactose ；IPTG ；enzyme characteristic中图分类号：TS201.2+5文献标识码：A 文章编号：1002－0306（2011）09－0206－04收稿日期：2010－12－06*通讯联系人作者简介：戴易兴（1986－），女，硕士研究生，研究方向：食品功能因子开发。
真菌葡聚糖酶活力测定
前 言本标准与Novozymes A/S标准方法：EB-SM-0572.02/02 FBG. Fungal Beta-Glucanase activity by Konelab analyzer(英文版)的一致性程度为等同。
附录A为规范性附录。
本标准由诺维信（中国）生物技术有限公司提出。
本标准由诺维信（中国）生物技术有限公司负责起草。
本标准主要起草人：蔺继尚、关越、翟文景。
本标准于2004年04月首次发布。
诺维信分析方法第112部分：用Konelab分析真菌β-葡聚糖酶活力，FBG1 范围本方法规定了使用Konelab分析真菌β-葡聚糖酶活力的步骤。
本方法适用于所有Novozymes内部分析真菌β-葡聚糖酶样品的实验室。
2 原理β-葡聚糖酶能水解β-葡聚糖，生成还原糖。
该反应通过加入含有PAHBAH和铋盐（Bi3+）的碱性溶液中止。
含有的PAHBAH和铋盐能与还原糖形成有颜色的混合物，在405nm下检测。
生成的颜色与β-葡聚糖酶活力成比例。
该过程由Konelan分析仪自动完成。
2.1 反应条件(反应体系中)酶反应β-葡聚糖浓度： 0.50%β-葡聚糖酶浓度： （1-5）FBG/L缓冲液： 28 mM磷酸缓冲液pH： 5.0温度: 50℃时间: 20 min酶空白反应β-葡聚糖浓度： 0.50%β-葡聚糖酶浓度： （1-5）FBG/L缓冲液： 28 mM磷酸缓冲液pH： 5.0温度: 50℃时间: 20 min显色反应PAHBAH浓度： 42 mM酒石酸盐浓度： 56 mM铋盐浓度： 4.5 mMNaOH浓度： 146 mMpH： 碱性温度: 50℃时间: 20 min测定波长： 405 nm2.2 样品条件(样品溶液中)工作范围： （6-30）FBG/LQ/12KF 3568.112-2004定量范围： （13-30）FBG/L3 单位定义1 FBG等于在给定条件下每分钟生成相当于1µmol葡萄糖的还原糖所需的酶的量。
饲用酶制剂的酶活检测方法及评定
饲用酶制剂的酶活检测方法及评定随着我国畜牧业的发展和生物工程技术的不断进步，酶制剂在饲料工业中的应用越来越多。
由于酶制剂能够消除饲料中的某些抗营养因子的负面作用，提高饲料消化率，改善动物生产性能，降低生产成本，因此日益受到饲料界的重视。
但是，由于酶制剂来源比较复杂、分子结构不明确，分离提纯困难等多种原因，使这类产品有国家标准的不多，即使有国标也存在一些问题。
给广大养殖用户和生产企业带来很大不便。
本文简单介绍一下常用的酶活测定方法及测定过程的影响因素，仅供广大饲料工作者提供参考。
1 酶制剂的定义及分类所谓的酶制剂就是通过产酶微生物发酵工程或含酶的动、植物组织提取技术生产加工而成，具有一种或多种底物清楚的酶催化活性，有助于改善动物对饲料营养成分的消化、吸收等，并有功效的生物学评定依据，符合安全性要求，作饲料添加剂用的酶制剂产品（NY/T 722-2003）。
工业上应用的酶制剂大多为水解酶，按作用底物的不同，可分为淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、植酸酶、木聚糖酶、果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等。
按动物体内是否分泌，分为消化酶和非消化酶两大类。
消化酶指动物自身能够分泌的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等，在幼龄动物或特殊生理阶段时，动物也存在消化酶分泌不足需要外源供给的情况。
非消化酶是指动物自身不能够分泌或很少分泌，必须由外源供给的酶，这类酶能消化动物自身不能消化的物质或降解一些抗营养因子，主要有植酸酶、木聚糖酶、果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等。
2 常见的酶活测定方法通常酶制剂活性的检测是采用实验室分析手段来进行评价，它可以用来筛选优质酶制剂、确定复合酶制剂的最佳组方及确定产品的最佳添加量等，酶制剂实验室评价技术是目前饲料厂家应用最为广泛的一种方法。
其操作相对简单，检测所用时间短，便于生产实践应用。
酶活测定结果虽不能完全反映酶的使用效果，但通过检测至少可以避免使用劣质的酶制剂。
我国饲料工业标准中已经确立了饲用植酸酶（GB/T 18634）、纤维素酶（NY/T912）、β—葡聚糖酶（NY/T 911）的测定方法。
β-1,3-葡聚糖酶活性的测定
β-1，3-葡聚糖酶活性的测定在植物染病或处于其他逆境条件下，可诱导细胞大量合成β-1，3-葡聚糖酶。
该酶水解昆布多糖，内切β-1，3-葡萄糖苷键，产生还原末端。
可通过测定还原糖表示酶活力。
1.仪器设备恒温水浴、分光光度计、研钵、高速冷冻离心机、透析袋等。
2.操作方法1)试剂配制①铜试剂：称取12g酒石酸钾钠（NaKC4H4O3·4H2O），24g无水碳酸钠，16g碳酸氢钠，分别溶于200ml蒸馏水中后混匀。
另称硫酸铜4g（CuSO4·5H2O）溶于200ml蒸馏水，缓缓加入并搅拌到上述混合液中。
再称取无水硫酸钠180g，溶于其中，置沸水浴20min，冷却后过滤，最后定容至1000ml备用。
此液易出现结晶，应保存在20℃以上。
②砷钼酸试剂：25g钼酸铵[（NH4）6Mo7O24·4H2O]溶于450ml蒸馏水，加入22ml浓H2SO4，充分混匀。
另称取3g砷酸氢二钠（Na2HAsO4·7H2O），溶于25ml蒸馏水后，与上述钼酸铵溶液混合，37℃保温24~48h，贮于棕色瓶备用。
2）标准还原糖测定：将500μg/ml的葡萄糖溶液准确稀释至150μg/ml，用此再稀释成数种不同浓度的葡萄糖溶液。
然后取几支干净试管，分别加入不同浓度的葡萄糖溶液0.5ml，并加0.5ml铜试剂，置沸水浴10min后，自来水冷却。
加入0.5ml砷钼酸试剂，混匀，再加入3.5ml蒸馏水，于分光光度计660nm处测定光密度，并作光密度-还原糖浓度标准曲线。
3）酶蛋白的提取和活力测定①酶蛋白的提取：将植物材料加5倍量0.05mol/L的乙酸钠缓冲液（pH5.0），充分研磨，于15000×g 离心15min后，将上清液置透析袋中，用提取液在4℃下透析过夜。
经离心取上清液，放于冰箱备用。
②酶活力的测定：取0.4ml的1mg/ml昆布多糖（Sigma公司，溶于上述乙酸缓冲液），加入0.1 ml酶液，于37℃保温15min，立即加入0.5ml铜试剂，混匀，并于100℃水浴10min，置冷水中冷却，再加入0.5ml砷钼酸试剂，呈现蓝色后加蒸馏水3.5ml，660nm处比色，对照标准曲线求出样品液中的还原糖量。
饲用纤维素酶活力的测定方法
物的吸光系数最大，因此一般在 520 纳米处检测 OD 值的变化。这种测定方法的优势在于他利用了一种
据催化反应的类型和结构特性不同，将其主要分为 以下三类：①葡聚糖内切酶（β-1，4- 葡聚糖酶，EC
商品化的，易获得且易被纤维素酶作用的底物。滤纸 酶法测定结果的可靠性主要受到以下因素的影响：
3.2.1.4），这类酶随机水解纤维素分子内部的非结晶 区，将长链纤维素分解为不同长度的非还原性末端
普遍的方法。滤纸法测定纤维素酶组分总活力见表 1，通常采用柠檬酸钠溶液作为缓冲溶液，在反应体
的酶活方法之间是相互联系的和复杂的，使得确定 酶活力测定的标准化方法非常困难，但是国际纯粹
系 内 的 终 浓 度 常 为 0.05 摩 尔 / 升 ，pH 值 主 要 在 4.8~5.5 之间。反应体系内滤纸为 Whatman 1 号，常用
羧甲基纤维素法测定内切葡聚糖酶酶活力，见 别如磷酸钾缓冲溶液的 pH 值则为 6.2。底物羧甲基
表 2 羧甲基纤维素酶活法测定内切葡聚糖酶活力
纤维素酶来源
反应缓冲溶液
名称
浓度 /（mol/L）
pH值
底物
反应温度 反应时间 波长 /nm
/℃
/min
T.K.Ghose
柠檬酸钠
0.05
4.8
2%羧甲基纤维素钠
素转化成葡萄糖和其他可溶性糖。因此，早在 20 世 纪 50 年代，就开始了对纤维素酶和相关的多糖酶的
物。由 IUPAC 发酵委员创立的 Whatman 1 号滤纸作 为底物的滤纸测定法是测定纤维素酶组分总活力最
研究。纤维素酶的生物技术应用于动物饲料开始于 二十世纪八十年代。尽管测定纤维素酶系的多种酶
与应用化学联合会（IUPAC）发酵委员会基于交换想 大小为 1.0×6.0 厘米（约等于 50 毫克）。测定反应 法和比较结果，1987 年发表了纤维素酶的测定方法。 一般在 37~50℃进行。在 540 纳米处棕红色氨基化合
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
八、Beta—葡聚糖酶活力的测定方法
1 方法：3，5—二硝基水杨酸比色法，简称DNS法。
2 原理：
还原糖能将3，5—二硝基水杨酸分子中的硝基还原成橙黄色的3—胺基5—硝基水杨酸。
溶液橙黄色强度与还原糖量成正比。
3. 主要仪器和设备
天平（感量1mg和0.1mg两种），离心机，恒温水浴锅，磁力搅拌器,分光光度计（722型，符合GB9721的有关规定）。
4. 试剂和溶液
4.1 所用水除特别要求外,均为符合GB/6682—1992规定的三级水, 化学药品除特别要求外,均为分析纯。
4.2 DNS试剂
称取3，5—二硝基水杨酸10g加入500 ml水中，分多次加入氢氧化钠16g，搅拌溶解(温度＜45℃)，再分多次加入酒石酸钾钠300g，搅拌至全溶，冷却后用水定容至1000ml。
室温下棕色瓶储存暗处放置，一周后使用(如有沉淀过滤后使用)。
4.3 0.1mol/L，pH
5.0醋酸—醋酸钠缓冲液
吸取冰醋酸1.8ml于烧杯中,加适量水，加醋酸钠5.78g，溶解, 定容至1000ml，调节PH至5.00±0.01后使用。
室温下存放2个月有效。
4.4 0.1%即1mg/ml葡萄糖溶液
无水葡萄糖于80℃烘至恒重，称取0.1000g于烧杯中,加适量水溶解,转入容量瓶中并定容至100ml。
4.5 0.5%β—葡聚糖溶液
称取β—葡聚糖0.50g于烧杯中,加入适量缓冲液，在沸水浴中搅拌加热溶解后，转入容量瓶中,用缓冲液(4.3)定容至100 ml,置2—8℃冰箱中备用。
有效期三天。
4.6 葡萄糖标准曲线的绘制
吸取1mg/ml无水葡萄糖溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml于试管中，补水至2ml，加DNS试剂3ml，混合后于沸水中煮10min,冷却后定容至15ml,于分光光度计540nm波长下测吸光度（A）。
以吸光度为纵坐标，葡萄糖量为横坐标,绘制标准曲线,三次重复试验的均值用最小二乘法拟合一元线性方程y＝ax﹢b,求出吸光度与葡萄糖量的关系。
5. 待测酶样品的处理
5.1 液体酶:直接吸取酶液做适当稀释，使测定光吸收值在0.25—0.4范围内。
5.2 液体曲：离心上清液做适当稀释，使测定光吸收值在0.25—0.4范围内。
5.3 固体曲：按干重计称取4g于三角瓶中，加水200ml，室温下磁力搅拌浸提
0.5h。
取离心上清液做适当稀释。
5.4 固体粉状酶：称取适量于烧杯中（精确至0.0001g)，用少量水润湿并调成糊状，再用水溶解，离心上清液做适当稀释。
5.5 固体粒状酶：研磨成粉后如5.3处理。
6酶活力测定
取15 ml具塞刻度试管按下面的反应顺序进行操作,在反应过程中,从加入底物(吸取前摇匀) (4.5)开始,向每支试管中加入试剂的时间间隔要绝对一致, 50℃水解10 min.
7酶活力单位计算
酶活力＝(S×D×1000)/（0.2×10）×4 µg/ml(g).min
式中：
S—测得光吸收在标准曲线上对应的葡萄糖量，mg数；
D—酶液或酶粉稀释倍数；
1000— mg和µg之间的换算系数；
0.2—测定所取酶液量，ml数；
10—反应时间，min数；
4—方法换算系数。
8酶活力单位定义及换算
8.1 本方法酶活定义:在本测定条件下，每分钟水解β—葡聚糖产生1µg还原糖（以葡萄糖计）所需酶量定义为一个酶活力单位（u）。
国际酶活单位的定义:在测定条件下,每分钟水解β—葡聚糖产生1µmol还原糖（以葡萄糖计）所需酶量定义为一个酶活力单位（IU）。
8.2 u与国际单位IU 的换算关系：
1 u＝1÷180 IU（µmol糖/ml(g).min）
180: 葡萄糖的分子量
注:β—葡聚糖为中国食品发酵研究院产品。