酵母工艺学酵母菌的培养原理

生长和分裂的第一步是能量代谢产物的积累，由A物质执行，它自身也 就转变为B物质。第二步是繁殖分裂，由B物质执行，然后自身转变为A 物质。
在稳定状态下， 这两部分生物物质处于平衡状态。由于限制性基质只与 第一步过程执行的长短有关，当培养液中限制性基质供应丰富时，就可 以用比较低比例的A物质来摄取基质生长能量，供给高比例的B物质不断 繁殖子细胞，得到较高的生长速率。
例：已知某酿酒酵母菌种对葡萄糖的基质饱和常数为 Ks=0.15g/L，最大比生长速率为μmax=0.30h-1，理论最高 生长得率（即不产生乙醇时）YG=0.5 g细胞/g葡萄糖。试 比较当控制培养液中的葡萄糖浓度分别为0.3g/L和1.0g/L 时的产酒精情况。
解：当培养液中的糖浓度S=0.3g/L时 比生长速率：
比生长速率μ的物理意义是单位菌体的生长速率，也即单位菌体(g)在单位时间 (h)内所新增的菌体量(g)，其因此为时间的倒数。
半饱和常数Ks是比生长速率等于最大比生长速率的一半时的限制性底物浓度。
当Cs＜＜Ks时，μ=μmax Cs/Ks，酵母菌的比生长速率与限制性底物浓度之间 呈线性关系。
当Cs＞＞Ks时，μ=μmax。但对于某些酵母菌，当限制性底物浓度很高时，对 生长有抑制作用，因而当μ达到某一值时，再提高限制性底物浓度，比生长速 率反而下降。
由于酵母具有克雷布特效应，酵母的生长与代谢不仅取决于是否有氧，而且与 糖的浓度有关。当培养液中糖含量高时，即使在有氧条件下，酵母在生长的同 时，也会产生大量乙醇，从而使酵母对糖的得率下降。
为了得到最高的酵母得率，一般认为培养液中的糖浓度必须低于0.0004%，而 这在实际生产中是不现实的，因为在这样低的糖浓度下，酵母的生长速率将很 低。
Bijkerk和Hall模型对酵母细胞生长的描述是以指数生长为前提的，没有 考虑接种后的停滞期和两个生长阶段之间的停滞期。Pamment等提出了 停滞的数学模型，作为Bijkerk和Hall模型的修正。
第二节 间歇培养
酵母菌的间歇培养，又称分批培养，是指一次性投料和一 次性收获产品的批式操作。由于其培养液中的初始糖浓度 较高，即使在溶解氧浓度足够高的情况下，酵母在生长的 同时，也会产生大量的乙醇。而大量乙醇的产生势必影响 酵母对糖的收得率，因此，间歇培养一般仅用于酵母生产 中的纯种培养阶段。在纯种培养阶段采用一次性投料的间 歇培养，其好处是：
第一节 酵母生长动力学模型
Monod方程 酿酒酵母两步生长动力学模型
前言 酵母菌生长在各种各样的物理和化学环境中，它们的生长和
生理活性实际上是对其所在物理和化学环境的一种响应。 酵母生长动力学就是研究酵母菌生长过程的速率及影响其生
长速率的各种因素，并用数学方程来描述这一过程。
Monod方程
葡萄糖和乙醇浓度（g/L) 细胞干物质浓度(g/L)
12
3.5
10
3
8
2.5
2 6
1.5
4
1
2
0.5
0
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
时间(h) 图1.5.4 酿酒酵母分批培养过程浓度变化曲线
葡萄糖 乙醇 细胞
第三节 流加培养（半连续培养、补料分批培养）
流加培养，属于半连续培养。它是以分批培养为基础，通过间歇或连续地方式 小流量添加原料的一种培养方法。
酵罐。
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《酵母工艺学》
第一章 酵母概况 第二章 酵母菌的微生物学概要 第三章 酵母菌的代谢与生长 第四章 酵母菌的营养 第五章 酵母菌的培养原理 第六章 活性干酵母ADY的生产 第七章 酵母菌的代谢工程
第五章 酵母菌的培养原理
第一节 酵母生长动力学模型 第二节 间歇培养 第三节 流加培养 第四节 连续培养 第五节 生长速率与酵母浓度的限制
发酵过程中比生长速率逐渐下降的原因：
供氧不足; 局部营养不足; 抑制剂的积累; 渗透压的提高; 生物空间的不足。
高浓度培养的主要措施: 提高发酵设备的供氧速率; 采用丰富的培养基，在供氧充足的情况下，增加主碳源及其
他营养物质的供给量; 加大接种量; 引出部分发酵液，分离菌体后进行洗涤，复活处理后返回发
恒化法是监控对象不同于恒浊法的另一种连续培养方式。恒化法是通过 控制培养基中营养物，主要是生长限制因子的浓度，来调控微生物生长 繁殖与代谢速度的连续培养方式。
在单级连续培养中，在较高酵母收得率下，其生产速率会下降。采用 多级连续培养，则可解决酵母收得率与生产速率之间的矛盾。这是因 为采用多级连续培养时，可在第一级或前几级培养中采用适当高的糖 浓度，允许产生一定的酒精；在最后一级的培养中控制很低的糖浓度 ，酵母又可利用其生成的酒精，这样可在提高生产速率的同时保证较 高的酵母收得率。
在实际生产中，酵母的多级连续培养一般为2～5级。与一般多级连续培 养不同的是，培养基并不是全部从第一级加入，而是从各级加入，并分 别控制各级的基质浓度和生长速率。
第五节 生长速率与酵母浓度的限制
生长速率的限制 酵母浓度的限制
生长速率的限制
为了获得较高的酵母收得率，不仅发酵性糖的浓度必须限 制，而且还必须控制酵母的生长速率。这是因为酵母的比 生长速率与基质浓度有关，从Monod方程可知，要提高比 生长速率，就必须提高限制性底物（糖）的浓度。而糖的 浓度的提高，会促使酵母产生较多的乙醇，从而使酵母对 糖的收得率下降。
生长耗糖速率： 0.261 0.522 YG 0.5
（g葡萄糖/g细胞•h）
乙醇的生产速率：
PE 0.155 0.123ln(1.0) 0.155 （g乙醇/g细胞•h）
生产耗糖速率：
180 0.155 0.303 2 46
（g葡萄糖/g细胞•h）
用于酒精发酵所占总葡萄糖消耗的比例为：
第一阶段，培养基中的糖含量较高，这时酵母细胞利用培 养液中的糖生长，并分泌大量乙醇。在此阶段，细胞生长 迅速，出芽细胞接近100%，同时积累乙醇。
第二阶段，当培养液中的糖被耗尽时，出现一个短暂的停 滞期，接着进入同化利用所分泌乙醇的第二生长期。此时 细胞的呼吸活性上升。在此阶段，细胞的生长速率较慢， 单个细胞比例较大。
第四节 连续培养
连续培养即在微生物培养系统中，连续添加培养基同时连续收获产品 的操作。与分批培养比较，连续培养具有如下特点：
优点： ①培养过程总处于对数生长期，设备生产能力高； ②反应器中各组分浓度及操作参数不随时间而变，易实现自动控制； ③辅助时间少，劳动生产率高。
缺点： ① 对设备的合理性和加料设备的精确性要求甚高； ② 营养成分的利用较分批发酵差，产物浓度比分批发酵低； ③ 杂菌污染的机会较多，菌种易因变异而发生退化。
此外，采用多级连续培养还便于控制酵母产品的质量。在单级培养时， 酵母菌都处于对数生长期，出芽率较高，这样的酵母没有完全成熟，不 利于贮藏，所以，活性干酵母的生产是不能采用单级连续培养的。而在 多级连续培养中，则可分别控制各级反应器的条件，在最后一级培养中 不加或少加营养物质，减少通风量，使酵母细胞成熟，从而可保证酵母 产品的质量。
连续培养包括单级连续培养和多级连续培养，其中单级连续培养包括恒 浊法与恒化法两类。
恒浊法是以培养器中微生物细胞的密度为监控对象，用光电控制系统来 控制流入培养器的新鲜培养液的流速，同时使培养器中的含有细胞与代 谢产物的培养液也以基本恒定的流速流出，从而使培养器中的微生物以 最高生长速率进行生长且在保持细胞密度基本恒定的条件下进行培养的 一种连续培养方式。
微生物细胞生长速率和培养液中限制性营养物浓度间关系的动力学方 程，首先是由Monod根据经验于1942年得出来的，时至今日仍在广泛 采用。该模型假定培养液中无抑制剂存在，生长速率受某一酶催化步 骤的速率限制所控制。在此情况下微生物比生长速率与基质浓度的关 系可表示为：
μ ——比生长速率（1/h） μmax——最大比生长速率（1/h） KS ——半饱和常数（g/L） Cs——限制性底物浓度(g/L)；
①糖浓度较高，酵母细胞具有较高的繁殖速率，使之通过 几级培养后可迅速获得较多的种子；
②培养过程不流加培养基，有利于控制杂菌污染；
③酵母菌在营养丰富的培养基中生长，同时产生一定量的 乙醇，有利于获得健壮的种子酵母。
两阶段生长
如前所述，当培养液中的糖浓度耗尽时，酵母菌可利用乙 醇进行生长。由此可见，在好氧条件下，酵母菌的间歇培 养可分为两个生长阶段。
在流加培养过程中，培养液中的糖浓度可按工艺的要求控制在较低或很低的水 平。在培养过程中根据酵母的耗糖情况调整流加糖的速度，酵母菌利用多少， 就流加多少，流加糖的速率与酵母的耗糖速率相等，使培养液中的糖浓度保持 在较低的含量。这样，酵母处在低糖溶液中生长，因而酵母的收得率较高；随 着流加培养过程的进行，酵母的浓度也就越来越高。这就是为什么酵母生产普 遍采用流加培养的原理。
max
S Ks S
0.3
0.3 0.15 0.3
0.20
生长耗糖速率：
(1/h)
0.20 0.40 （g葡萄糖/g细胞•h）
Fra Baidu bibliotekYG 0.5
乙醇的生产速率为：
PE 0.155 0.123 ln S
0.155 0.123 ln(0.3) 0.0069 （g葡萄糖/g细胞•h）
生产耗糖速率：
180
180
2 46 PE 2 46 0.0069 0.013
（g葡萄糖/g细胞•h）
用于酒精发酵所占总葡萄糖消耗的比例为： 0.013 100% 3.10%
0.40 0.013
当培养液中的糖浓度S=1.0g/L时：
比生长速率：
0.3 1.0 0.261 (1/h)
0.15 1.0
酿酒酵母两步生长动力学模型
Bijkerk和Hall于1977年提出了S. cerevisiae的动力学模型。 第一步是基质积累，过程的长短决定于限制性底物供用的程度
。第二步是芽的分离形成新的单个细胞，过程的长短与基质无 关。 其模型基本假设是，假定细胞生物物质分为A、B两部分，A物 质即单个细胞，B物质为出芽细胞。在细胞的生长繁殖过程中 ，A物质（细胞）执行摄取基质和供应生物合成能量的功能， B物质（细胞）执行在固定时间内复制DNA和有丝分裂的功能 。
在工业化生产中，主发酵期酿酒酵母的比生长速率控制在 0.15~0.25h-1范围内。一般情况下，当比生长速率超过 0.25h-1时，酵母的收得率将显著减少。
酵母浓度的限制
在工业化生产中，对数生长仅是发酵开始时的一段时间内， 具体长短则视培养条件而定，随后比生长速率迅速减少。
例如在一次工业化发酵生产中，有人发现，发酵开始时，倍 增时间为4小时（比生长速率μ=0.173 h-1），发酵中期倍增 时间为6小时（μ=0.116 h-1）；在18小时发酵的最后一段时 间内，倍增时间为8小时（μ=0.0866 h-1）。
0.303 100% 36.7% 0.522 0.303
从上述计算看，当控制糖浓度从0.3g/L提高至1.0g/L时， 比生长速率从0.2 h-1提高至0.261 h-1，生产速率提高了 30.5%；但同时，用于酒精发酵的葡萄糖比例从3.1%提高 至36.7%，酒精的大量生成，会使酵母收得率下降。