实验一 质粒DNA的提取和鉴定

实验步骤
1、将含有质粒的DNA细菌在LB培养基中培养过夜。取1.5ml LB培养液倒入1.5mleppendorf管中，4℃下12000g离心30秒。 2、弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。 3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中（需剧烈振荡）。 4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl，盖紧管口，快速温和颠倒 eppendorf管数次，以混匀内容物（千万不要振荡），冰浴 2分钟。 5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，颠倒混匀，冰浴中 5-10分钟，4℃下12000g离心5-10分钟。 6、上清液（450uL）移入干净eppendorf管中，加入等体积的 饱和酚（1:1），充分颠倒混匀，4℃下12000g离心10分钟。
溶液Ⅲ
• 5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O 28.5ml，定容至100ml，并高压灭菌。溶液 终浓度为：K+3mol/L，Acˉ5mol/L。
溶液III——中和溶液，复性质粒DNA；
酚/氯仿（1:1）
分为两层，上层为水层，下层为酚氯仿 混合液。吸取时不要震荡。
酚——变性蛋白质； 氯仿——萃取溶液中的酚；
a) 滤纸及其他纤维薄膜电泳，如醋酸纤维素、玻璃 纤维、聚氯乙烯纤维 b) 凝胶电泳，如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚 丙烯酰胺凝胶电泳 c) 粉末电泳，纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳 d) 丝状电泳，如尼龙丝、人造丝电泳
5. 按支持物的装置形式不同
a) 平板式电泳
b) 垂直板式电泳
c) 垂直柱式电泳
迁移率（ Mobility)——带电颗粒在单位 电场强度下的泳动速度。
V Q M= = E 6 r
五、影响电泳速度的因素
1.电场强度（E） E↑→电流↑→热效应→支持介质上的水分蒸发→样品 的热变性 E↓→电泳速度慢→延长电泳时间→样品扩散→区带模 糊不清→分辨率下降 2. 带点颗粒的半径 r ↑→阻力↑→电泳速度变慢 3. 支持物介质——吸附作用；电渗作用；分子筛作用 4 缓冲液 离子强度（I）：I↑→缓冲能力越大→缓冲液所载的分 电流增加，而样品所载的电流相应减少→电泳速度减 慢 pH ： pH 值决定了化合物解离的程度，也决定了质点 所带的净电荷。
分类： 单拷贝质粒； 多拷贝质粒； 紧密控制型； 松弛控制型；
质粒DNA的提取方法
概括起来主要是用非离子型或离子型去 污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处 理。 • 碱裂解法；
• 煮沸裂解法；
• 酚氯仿抽提法；
基本思路
1. 培养细菌使质粒扩增；
2. 收集和裂解细菌；
3. 分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA， 根据实验所需)
细菌培养与质粒扩增
1. 挑单克隆E.coli菌株接种到斜面培养基上（活化菌 种），37℃过夜培养
2. 从斜面培养基上挑E.coli菌株，接种于25毫升液体 培养液内（含氨苄青霉素），37℃振荡过夜培养 3. 从中取4毫升种子菌液于含M9培养基中（含Ap）， 37℃振荡培养3-4小时（OD600＝1.0）
溶液I：重悬细菌； 葡萄糖：比重大，使细菌不易沉淀； Tris－HCl：缓冲体系； EDTA：螯合金属离子；
溶液Ⅱ
• 0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/LNaOH 母液稀释），1％SDS
溶液II——破膜，变性基因组DNA和蛋Hale Waihona Puke Baidu质； SDS——破膜作用，变性蛋白质； NaOH——破膜，变性基因组DNA；
四、电泳的基本原理
• 一个分子，如能解离或能吸附带电质点，在电
场中便会向正极或负极移动。
移动速度——以蛋白质分子为例:
F= EQ （Q：有效电荷; E：电位梯度） F’=6rv （F’：摩擦阻力; v：在介质粘度η中半径 为r的颗粒的移动速度） F=F’ EQ=6rv EQ v= ———— 6r
• 其中超螺旋结构泳动最快； • 其次为线性结构； • 最慢的可能是复制中间体（没有复制完的两 个质粒连在一起）；
染料——EB
• 溴化乙锭（EB）是一种荧光染料(3,8-二氨 基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌 入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激发 下，发出橙色荧光。
注意
• EB是诱变剂，配制和使用EB染色液时，应 带乳胶手套或一次性手套，并且不要将该 染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污EB的 器皿或物品，必须进行清洗或弃去。
7、将水相（400uL）移入干净eppendorf管中，加入等体积酚 /氯仿，颠倒混匀，12000rpm离心10min。 8、将水相（350uL）移入干净eppendorf管中，加入2倍体积 的无水乙醇，振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后 4℃下12000g离心10分钟。 8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出， 加入0.5ml 70％乙醇洗沉淀一次，4℃下12000g离心5-10分 钟。 9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干 燥10分钟或室温干燥。 10、将沉淀溶于10μl TE缓冲液（pH8.0，含20μg/ml RNaseA） 中，储于-20℃冰箱中。
6.根据电泳系统pH是否连续
• 连续pH电泳—指电泳过程中pH保持不变；
• 不连续pH电泳—指电极缓冲液和电泳支持物的不
同区段也有不同的pH ；
电泳技术的特点:
• 凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分 离,并可进行定性或定量分析; • 样品用量极少; • 设备简单; • 可在常温进行; • 操作简便省时; • 分辨率高.
琼脂糖凝胶
• 从琼脂中除去带电荷的琼脂胶后，剩下的不含磺 酸基团、羧酸基团等带电荷基团的中性部分，结 构是链状的聚半乳糖，易溶于沸水，冷却后可依 靠糖基间的氢键引力形成网状结构的凝胶。 • 凝胶的网孔大小和凝胶的机械强度取决于琼脂糖 浓度。因此琼脂糖凝胶可作为分子筛，常用于凝 胶层析和电泳。
电泳鉴定
电泳
• 在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子 筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子 质量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比 关系。 • 凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA， 也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的 DNA分子。
乙醇
无水乙醇（2倍体积）——沉淀质粒 DNA； 70%乙醇——洗涤质粒DNA沉淀， 除去沉淀中的盐分；
电 泳 Electrophoresis
一、定义
电泳—带电粒子在直流电场中向着电性 相反电极移动的现象。
电泳分析技术—利用电泳现象进行物质 分离的技术。
二、电泳分析技术发展概况
• • • • 1809年 1937年 1948年 1980年 发现电泳现象 Tiselius 自由界面电泳 Wieland 滤纸电泳 毛细管电泳
(capiliary electrophoresis)
三、电泳分析技术的分类
1.根据被分离样品的量多少 分析电泳 制备电泳 2.根据电泳电压的高低 常压电泳 0～500 V 高压电泳 500～3000V 3.根据电泳中是否使用支持物 自由电泳—不使用支持物，在溶液中进行。 区带电泳—使用支持物
4. 按支持物的物理性状不同
质粒DNA的提取和纯化
生化与分子生物学系
分子生物学
• 从分子水平上研究生命现象物质基础的学 科。研究细胞成分的物理、化学的性质和 变化以及这些性质和变化与生命现象的关 系，如遗传信息的传递，基因的结构、复 制、转录、翻译、表达调控和表达产物的 生理功能，以及细胞信号的转导等。
基 因 工 程
移液器和EP管
4. 电泳检测；
碱裂解法的基本原理
• 十二烷基磺酸钠(SDS) 可使细胞膜裂解。 • 经SDS处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上， 同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核 酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。 • 当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性， 而共价闭合环状DNA(Covalently closed circularDNA，简称 cccDNA)的两条链不会相互分开。 • 当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性， 而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA 双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解 状态存在于液相中。
质粒
• 质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，独 立于染色体之外的、能自主复制的双链环状脱氧 核糖核酸物质。 • 质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对抗 生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R 质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子) 等都是常见的天然质粒。 • 能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代， 一般不整合到宿主染色体上。 • 现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的， 常含抗生素抗性基因，是重组DNA技术中重要的 工具。
LB液体培养基（Luria-Bertani）
• 称取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物 （Yeastextract）5g，NaCl10g，溶于800ml去 离子水中，用NaOH调pH至7.5，加去离子 水至总体积1升，高压下蒸气灭菌20分钟。
溶液I
• 50mmol/L葡萄糖，25mmol/ L T r i s. Cl（ pH8.0），10mmol/L EDTA（pH8.0）。溶 液Ⅰ可成批配制，每瓶100ml，高压灭菌15 分钟，储存于4℃冰箱