马铃薯生物工程育种

• 三、马铃薯外植体的组织培养
• （一）外植体无性系的诱导
• 1. 诱导的一般方法 • 在进行马铃薯再生植株诱导时，选择适宜的外植
体是提高诱导率的前提。
• 采用马铃薯的叶片、叶片轴、植株的地上茎和块 茎作为再生苗诱导的外植体源，容易获得成功。
• 无论采用何种外植体，其诱导的基本方法是一致的。 通常的诱导过程为：选择适宜的外植体→诱导愈伤组 织→诱导再生苗→变异个体选择→变异的遗传检验→ 田间选择。
项目十二 马铃薯生物工程育种
任务一 体细胞无性系变异
• 在众多遗传改良的新技术中，体细胞无性系变异已被认为 是改良植物性状的一种潜在的技术手段。近年来发展起来 的植物细胞和分子技术，如体细胞变异、花药培养、体细 胞杂交和基因工程等，已经大量应用于马铃薯品种改良中。
• 马铃薯栽培种（S. tuberosum subsp.tuberosum）在长期的 进化过程中，为保证植株最大的生活力，现有的无性系均 是遗传上高度杂合的。因此，通过常规杂交改良其抗病性 或其他特殊性状而不丢失其重要的农艺性状是十分困难的。
• （二）原生质体分离溶液和培养基
• （三）马铃薯原生质体培养
• 1. 培养基成分
• （1）无机盐类的改变。 • பைடு நூலகம்2）碳源和渗透剂的选择。
• 2. 培养密度
• 原生质体培养密度为5 000～100 000个细胞／ml。在大多数 马铃薯原生质体培养中，一般的浓度为10 000个细胞／ml。
• 3. 培养方法
• 二、影响体细胞变异的因素
• 1. 外植体来源及其遗传组成
• （1）不同类型外植体，如叶片、块茎，以及由组织培养 条件或悬浮细胞培养获得的再生植株的叶片提取的原生质 体等诱导成的再生植株，均表现出不同程度的基因变异和 形态变异。
• （2）植株的倍性和遗传组成对再生植株的形态和染色体 变异类型的影响。
• 2. 培养基成分
• （1）植物生长激素，特别是植物生长素和细胞分裂素， 是诱导细胞分裂的必备条件。植物生长素和细胞分裂素的 浓度，能影响马铃薯原生质体培养或愈伤组织培养再生植 株的倍性和表型变化。
• （2）培养基中高浓度盐类的影响，如氯化钙（CaCl2）和 EDTA能增加细胞培养过程中的染色体异常率。高浓度的糖 （10g/L或20～30g/L）能够导致单倍体叶片诱导的愈伤组 织细胞出现多倍化现象，但对双单倍体和四倍体材料则无 该现象发生。
• 有时也采用外植体不经过愈伤组织阶段，直接诱导再 生植株的方式来获得变异的体细胞无性系。
• 利用这种方法可以获得有益突变体，且突变的无性系 在不同的无性世代和不同的种植环境均表现稳定。
• 利用外植体诱导再生植株时，应注意以下几个主要环节：
• （1）选择适宜的外植体。较多的是利用马铃薯叶片、叶 片轴、茎和块茎，在实践中均获得了较好的效果。
• 一、体细胞变异在马铃薯育种中的意义
• 体细胞变异可从单个DNA碱基对的突变到多基因控制的遗 传性状的各种水平上存在。这种变异也包括遗传变异、非 遗传变异和不稳定的遗传变化。体细胞变异的优势为：变 异频率较高，能出现特异性变异个体和可利用的农艺性状， 最终获得新的品种。
• 至今，还没有报道生产上利用体细胞变异育成的马铃薯品 种。但是，在其他作物上，如番茄、芹菜等，利用体细胞 变异已经育成了品种。
• （2）选择适宜的培养基。培养基在外植体诱导中主要有 两个作用，一是能否获得较高比例的再生苗；二是能否获 得变异频率较高的再生植株群体。以前的研究结果多是侧 重培养基成分的选择，因此，已经有了多种培养基的配方。 这些配方均是以MS培养基为基础，只是在有机添加物和 植物激素的种类和浓度上进行调整。
• 2. 马铃薯外植体再生植株诱导
• 5. 细胞壁形成和持续分离
• 细胞壁再生是核和细胞分裂的先决条件。细胞壁再生的速率 和调节，决定于植物种类和用于原生质体游离的受体细胞的 分化状况。控制细胞壁合成，除了遗传因子之外，培养基成 分对细胞壁再生也有重要作用。
• 6. 植株再生
• 原生质体再生主要在茄科植物上取得了成功。马铃薯 原生质体培养获得再生的成功例子较多。从愈伤组织、 细胞悬浮体、叶、茎尖和花瓣游离的原生质体都能再 生成植株。
• （二）外植体无性系的变异
• 通过外植体诱导产生的再生植株群体中，可能有一定数量的 变异体。为了科学、准确地区分真正的变异或环境影响的差 异，用严格的田间试验。通常采用的试验设计方法有：
• 1. 多年多点田间试验 • 2. 环境控制试验
• （三）选择方法
• 诱导再生植株的目的是要得到性状改良的植株，或作为育种 亲本，或作为新品种选育的基础材料。但是，在选择再生苗 的当代，必须严格淘汰畸形和生活力弱的个体，对留下来的 再生苗，经过扩繁后，再在田间选择。
• 通用的原生质体培养方法如下：
• （1）小液滴培养方法
• 这个方法用倒置显微镜进行观察极为方便。新鲜培养基 易直接加入正在发育的悬浮体中，每5～7d加一次。
• （2）琼脂培养法
• 使用这个方法，原生质体处在固定位置，避免原生质体 堆积，可以追踪观察分散的原生质体。
• 4. 原生质体活力试验
• 原生质体活力试验是一个重要手段，只有保持了原生质体的 活性，才能达到持续有丝分裂、再生愈伤组织，直至形成再 生植株的目的。
• （1）通过愈伤组织诱导再生植株。 • ① 基础材料准备。 • ② 消毒。 • ③ 培养。 • ④ 培养基。 • （2）外植体培养直接诱导再生植株。 • ① 外植体。 • ② 叶片外植体再生植株的诱导。
• （3）以块茎为外植体的诱导。 • ① 一般采用三步培养的方式。 • 其各阶段所用的培养基为： • 第一培养基。 • 第二培养基。 • 第三培养基。 • ② 培养过程。
• 四、原生质体培养
• 通过马铃薯原生质体诱导是获得无性变异的又一有效途径。 马铃薯原生质体培养必须具备相应的条件，其中比较重要 的有以下几个方面。
• （一）供体植株
• 为了取得可靠的结果，大都采用在严格控制的环境和营养 条件下来栽植供体植株。研究结果表明，在标准湿度、营 养条件、温度和光照条件下的人工气候室栽培的植株方可 作为较好的供体植株。这些严格的条件是保证原生质体分 离和培养成功所必须的。