毕赤酵母表达手册(详细)
毕赤酵母分泌表达报告
实验报告毕赤酵母分泌表达报告订单号：«订单号»客户：«客__户»日期：«日__期»目录1 材料与方法 (1)1.1 菌株的保存与培养 (1)1.2 载体构建 (1)1.3 质粒电转毕赤酵母 (1)1.4 转化子筛选 (2)1.5 转化子表达小试 (4)1.6 最优转化子扩大表达 (6)1.7 蛋白鉴定与纯化 (7)2 结果与分析 (9)2.1 转化子筛选 (9)2.2 转化子表达小试 (9)2.3 最优转化子扩大表达 (10)2.4 蛋白纯化与浓度测定 (10)1．材料与方法1.1 菌株的保存与培养大肠杆菌（Eschrichia coli）菌株TOP10于LB培养液摇菌后保存成20%的甘油菌于-80℃冷冻保存。
大肠杆菌于37℃培养箱中培养。
毕赤酵母（Pichia pastoris）菌株X-33于YPD培养液摇菌后保存成25%的甘油菌于-80℃冷冻保存。
毕赤酵母于28℃培养箱中培养。
1.2 载体构建1）目的基因信号肽预测，采用SignalP 4.0和5.1预测，去除信号肽序列；2）根据毕赤酵母表达系统进行密码子优化，避开SacI酶切位点；3）基因合成至pPICZαA，目的基因紧挨着载体α-factor，C端带上6×His。
1.3 质粒电转毕赤酵母1.3.1 目的载体线性化1）按下表配制载体酶切体系：组分体积（ul）质粒（5-10 ug）6 ug10×buffer 5SacI 1 ulddH2O 补到502）37℃酶切过夜；3）琼脂糖凝胶电泳检测，以未酶切的质粒作为对照；4）检测酶切成功后，65℃ 20 min灭活。
1.3.2 线性化载体纯化回收1）按下表配置载体纯化体系：组分体积（ul）酶切产物50核酸助沉剂103 M NaAc，pH=5.2 6无水乙醇1652）-20℃静置35 min以上；3）4℃ 12000 rpm离心15 min，弃上清，此时可以观察到壁上有白色沉淀；4）加入400 ul预冷的80%乙醇重悬沉淀；5）4℃ 12000 rpm离心10 min，弃上清，开盖干燥；6）加入10 ul ddH2O溶解沉淀。
毕赤酵母手册
毕赤酵母表达实验手册作者：Jnuxz 来源：丁香园时间：2007-9-5大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。
然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。
大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。
另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。
包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。
大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。
但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。
近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。
因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。
［1］。
同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。
酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。
1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。
干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。
毕赤酵母实验操作手册
毕赤酵母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。
然而，许多蛋白质在翻译的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。
大肠杆菌缺少适合用于表达结构复杂的蛋白质。
另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。
包含体的形成虽然简化了产物的纯的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。
因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。
大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过其主要优点是成本低、产量高、易于操作。
但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。
近年程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵间题［1］。
与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的们对酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外宿主．1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得素和胰岛素已大量生产并在人群中广泛应用，但很大部分表达由实验室扩展到工业规模时，培养基数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降，而大多数外源基因的高效表达需要高拷贝数的量下降。
同时，实验室用培养基复杂而昂贵，采用工业规模能够接受的培养基时，往往导致产量的酵母的局限，人们发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源来发展最为迅速，应用也最为广泛，已利用此系统表达了一系列有重要生物学活性的蛋自质。
毕赤酵母表达知识
很好，需要好好研究一下原文地址：毕赤酵母表达知识01转载于丁香作者：思时尔非a.配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有这么3种方案：1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；3、水浴加热，温度不能高于50度。
D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。
在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。
天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。
b.有几个比较迷惑的问题请教大家：(很典型的小问题）1、制感受态细胞，OD多少比较好？pyrimidine 战友的方法：取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP 管中。
说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低2、关于高效转化法，文献说用(LiAc)，而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用，要用LiCl。
Lithium acetate does not work with Pichia pastoris. Use only lithium chloride.3、YNB到底能高温灭么？有的说能有的说不能。
过滤灭菌的怎么操作？我是把滤器装好膜绑到瓶口用纱布盖上，报纸包上，瓶盖放烧杯里单灭。
然后把配好的溶液用注射器一点点推进去。
4、葡萄糖为什么在YPD里一起灭颜色很深，单灭则不会。
该115度还是121度灭？网上搜了下，都有人用！5、电转化参数用400欧还是200欧？有的用400，有的还专门说不是用400。
都是从园里看到的！电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400）6、电转后，在MD平板上长的应该就是整合了目的基因的重组子了吧？如果不想筛高拷贝的，是否PCR验证一下即可？网友的回答：ynb最好不灭菌，我是0.22um过滤处理的。
毕赤酵母表达系统资料整理
毕赤酵母表达零碎之相礼和热创作Mut+和Muts毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶——AOX1及AOX2，细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产品，甲醇可紧密调理、诱导AOX1基因的高程度表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上.AOX1基因调控分两步：抑制/往抑制机制加诱导机制.简单来说，在含葡萄糖的培育基中，即便加入诱导物甲醇转录仍受抑制.为此，用甲醇进行优化诱导时，引荐在甘油培育基中培育.留意即便在甘油中生长(往抑制)时，仍缺乏以使AOX1基因达到最低程度的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达程度所必须的.AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达.AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，经过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株.在YPD(酵母膏、蛋白胨、葡萄糖)培育基中，不管是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的工夫大约为2h.Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的状况下生长速率是一样的，存在甲醇的状况下，Mut+在对数期增殖一倍的工夫大约为4至6个小时，Muts在对数期增殖一倍的工夫大约为18个小时.菌株GS115、X-33、KM71和SMD1168的区别GS115、KM71和SMD1168等是用于表达外源蛋白的毕赤酵母受体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使蛋白过糖基化，糖基化后有利于蛋白的溶解或构成正确的折叠结构.GS115、KM71、SMD1168在组氨酸脱氢酶位点(His4)有渐变，是组氨酸缺陷型，假如表达载体上携带有组氨酸基因，可抵偿宿主菌的组氨酸缺陷，因而可以在不含组氨酸的培育基上挑选转化子.这些受体菌自发渐变成组氨酸野生型的概率一样平常低于10-8.GS115表型为Mut+，重组表达载体转化GS115后，长出的转化子可能是Mut+，也可能是Muts(载体取代AXO1基因)，可以在MM和MD培育基上鉴定表型.SMD1168和GS115类似，但SMD1168基因组中的Pep4基因发生渐变，是蛋白酶缺陷型，可降低蛋白酶对外源蛋白的降解作用.其中X-33由于是野生型，因而耐受性比较好，假如担心转化率的话可以考虑这种酵母菌，而X33与GS115一样都是属于MUT＋表示型，也就是说可以在含甲醇的培育基中快速生长，但是听说会对外源基因表达有影响，KM71的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因(arg4)有渐变，在不含精氨酸的培育基中不克不及生长.用野生型ARG4基因(约2kb)拔出到克隆的野生型AOX1基因的BamHI(AOX1基因15/16密码子)及SalI(AOX1基因227/228密码子)位点，取代了AOX1基因16-227密码子，此结构转化至KM71亲本菌(arg4his4)中，分离发生KM71 MutsArg+His-菌株，Arg+转化子遗传分析表现野生型AOX1被aox1::ARG4结构所取代，以是KM71全部转化子都是Muts表型.AOX1位点没有被完全缺失，理论上可用你的目的结构经过基因取代方法更换aox1::ARG4结构，这样重组菌株的表型是His+MutsArg-，这意味偏重组菌株生长时需精氨酸.但仅添加精氨酸其实不克不及完全缓和arg4渐变的影响，arg4菌株在含精氨酸的最小培育基中不克不及很好地生长.因而不引荐在KM71中经过取代aox1::ARG4结构来获得His＋转化子.一样平常来说，假如是胞内表达，应尽量用Muts细胞，这样得到的蛋白产品中醇氧化酶蛋白量较少而目的蛋白量绝对较多，使卑鄙纯化更易进行.而对于分泌蛋白的表达，无论是甲醇利用慢(Muts)还是甲醇利用快(Mut+)的细胞都可运用.基因重组Pichia.pastoris酵母菌体内无自然质粒，以是表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以完成外源基因的表达，包含启动子、外源基因克隆位点、停止序列、挑选标识表记标帜等.细菌内同源重组被以为是重组质粒构建过程的难点，由于未线性化的环状质粒之间发生同源重组的几率非常低，以是重组转移载体必须用特定的限定性内切酶进行线性化处理.这种处理的目的是防止随机拔出重组时质粒在功能区断开，形成目的基因表达失活，让同源重组以指定的方式发生.表达载体次要分为以下几类：(1)胞内表达载体次要有pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWO10，pGAPZ、pGAPZa(Invitrogen)等.该类载体可以将目的基因表达在胞内，可以防止毕赤酵母的糖基化，次要得当于那些不克不及被糖基化相关基因的表达；(2)分泌型表达载体次要有pPIC9、pHIL-S1、pPICZα、pYAM75P等.由于毕赤酵母本人的泌内源蛋白非常少，将外源蛋白分泌到胞外，非常有利于目的蛋白质的纯化及积存.经常运用的分泌的信号序列次要是由89个氨基酸组成的α交配因子(α-factor)的引导；(3)多拷贝拔出表达载体如pPIC9K，pPIC3.5K.在某些状况下，毕赤酵母中重组基因多拷贝整合可添加所需蛋白的表达量.该载体均可用于在体内(pPIC3.5K, pPIC9K)或体外(pAO815)发生并分离多拷贝拔出，同时可检测添加重组基因的拷贝数能否添加蛋白表达量.体内整合可经过高遗传霉素抗性挑选可能的多拷贝拔出，而体外整合可经过连接发生外源基因的串联拔出.在GS115中挑选His+Mut+转化子：用SalI或StuI线性化质粒转化GS115后，大多在His4位点上发生重组，大多数转化子是Mut+表型；但是由于质粒含有AOX1基因序列，有可能在AOX1位点发生重组，毁坏野生型AOX1基因，发生His+Muts转化子，则必要在MD及MM平板上检测可证明His+ Mut+转化子.毕赤酵母表达经常运用培育基10×YNB(13.4%的无氨基酸酵母氮源)，134gYNB固体溶于1L蒸馏水，过滤灭菌，4℃保管.YPD完全培育基：酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L(固体培育基含1.5%琼脂).转化培育基RDB：每100mL加入山梨醇18g(186 g/L)，琼脂糖2g(20g/L)121℃灭菌20分钟，然后待温度降至60℃当前在超净台上加入10×YNB 10mL(13.4 g/L)，10×葡萄糖10mL(20 g/L)，500×生物素0.2mL(4×10-4g/L)，100×AA 1mL.混匀，倒平板(灭菌时只加入80ml水即可).选择培育基MD(最小葡萄糖)：配100mL，向80mL水中加入琼脂糖2g(20 g/L)121℃灭菌20分钟，待温度降至60℃当前在超净台上加入10×YNB 10mL(13.4 g/L)，10×葡萄糖10mL(20 g/L)，500×生物素0.2mL(4×10-4g/L).选择培育基MM(最小甲醇)：配100mL，向90mL水中加入琼脂糖2g(20 g/L)121℃灭菌20分钟，待温度降至60℃当前在超净台上加入10×YNB 10mL(13.4 g/L)，500×生物素0.2mL(4×10-4g/L)，0.5mL甲醇(0.5%).诱导表达培育基BMGY：配1L，酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，3g/L K2HPO4，11.8g/L KH2PO4，加水至890mL，121℃灭菌20分钟，然后待温度降至60℃当前在超净台上加入10×YNB 100mL(13.4 g/L)，500×生物素1mL(4×10-4g/L)，甘油10mL.诱导表达培育基BMMY：酵母提取物10g/L，蛋白胨20 g/L，3g/LK2HPO4，11.8g/L KH2PO4，加水至895mL，121℃灭菌20分钟，然后待温度降至60℃当前在超净台上加入100×YNB 100mL(13.4 g/L)，500×生物素1mL(4×10-4g/L)，甲醇5mL.BMGY/BMMY含酵母浸出物及蛋白胨，可波动分泌蛋白，制止或减少分泌蛋白的分解.假如目的蛋白对中性PH蛋白酶敏感的话，可在无缓冲培育基(MGY、MM)中表达.假如没有证据证明你的分泌蛋白对中性PH值蛋白酶敏感，建议开始表达时用BMMY.假如表达蛋白降解了，测验考试在无缓冲培育基中进行表达.假如以上条件仍不克不及无效防止蛋白降解，可将基因转入SMD1168中，该菌株表型是his4pep4，缺失了蛋白酶，转化与表达程序与GS115相反，也可用于大规模发酵.用考马斯亮蓝G-250测蛋白含量。
毕赤酵母发酵工艺手册
毕赤酵母发酵工艺手册1. 引言欢迎使用毕赤酵母发酵工艺手册。
本手册旨在介绍毕赤酵母发酵的基本原理、工艺步骤以及相关注意事项。
通过遵循本手册，您可以更好地理解和掌握毕赤酵母的发酵过程，从而在生产中取得更好的效果。
2. 毕赤酵母发酵基本原理- 毕赤酵母是一种常见的酵母菌，其发酵能力强，适用于多种发酵产品的生产。
- 发酵是指通过酵母菌对底物中的糖类进行代谢，产生酒精和二氧化碳的过程。
- 毕赤酵母在发酵过程中需要适宜的温度、pH值和营养物质等条件。
3. 毕赤酵母发酵工艺步骤1. 发酵前准备：- 准备好所需的发酵基质，包括糖类、氮源和维生素等。
- 对基质进行消毒处理，确保无害菌的存在。
2. 接种毕赤酵母：- 选择合适的毕赤酵母培养液进行接种，注意接种量的控制。
- 将毕赤酵母培养液均匀加入发酵基质中。
3. 发酵条件控制：- 控制发酵温度在合适的范围内，一般为25-30摄氏度。
- 监测发酵基质的pH值，保持在适宜的范围内。
- 提供足够的氧气供给，促进酵母的生长和代谢。
4. 发酵过程监测：- 定期对发酵过程中的温度、pH值和酵母数量等进行监测和记录。
- 根据监测结果及时调整发酵条件，确保发酵过程稳定进行。
5. 发酵结束：- 当发酵基质中的糖类被完全代谢，产物达到预期时，发酵过程结束。
- 将发酵产物经过处理和提取，得到最终的产品。
4. 注意事项- 在发酵过程中，应注意卫生和消毒，以防止杂菌的污染。
- 严格控制发酵条件，避免过高或过低的温度、pH值对发酵效果产生不利影响。
- 根据不同的发酵产品，可能需要调整发酵步骤和条件，建议根据具体要求进行调整。
- 在使用本工艺手册时，请参考其他文献和专业意见，确保准确性和可靠性。
以上是关于毕赤酵母发酵工艺手册的简要介绍。
希望本手册能对您在毕赤酵母的发酵工艺中提供帮助和指导。
如有任何问题，请随时与我们联系。
谢谢！。
GS115毕赤酵母表达菌使用说明
编号
名称
北京华越洋生物 NRR01030 GS115 毕赤酵母表达菌
基 本 信 息 ：
名称：GS115 毕赤酵母表达菌
规格：300ul 甘油菌
储 存 温 度 ： -‐80℃
发突变为组氨酸野生型的概率一般低于 10-‐8。GS115 毕赤酵母可以在 YPD
培养基中生长，或者在补充有组氨酸的 minimal media 中生长，但是无法
在单独的 minimal media 中生长。GS115 毕赤酵母在做质粒转化的时候，
可 采 用 电 转 化 的 方 式 将 质 粒 转 入 。
基 因 组 ：
His4（ 基 因 5 是毕赤酵母菌株，是巴斯德毕赤酵母的一种，属于真核细胞。
一般的针对原核生物的抗生素例如卡那和氨苄对酵母是无效的，因此为了
操作说明：
1，本品包含一份甘油菌，使用本甘油菌时可以不用完全融解，在甘油菌表
面蘸取少量涂板或进行液体培养即可。也可以完全融解后使用，但随着冻融次数
的增加，细菌的活力会逐渐下降。
2，为保证菌种纯正，避免其它细菌污染，尽量先划平板，然后再挑单克隆
菌落进行后续操作。
毕赤酵母适宜的生长温度是 28 至 30 度，温度超过 32 度对蛋白的表
达是有害的，并可能导致细胞的死亡。GS115 毕赤酵母是是组氨酸缺陷型
（His4 基因型），如果表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组
氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。这些受体菌自
养。细菌在 30-‐35℃培养箱中培养 24-‐48h，真菌在 23-‐28℃培养箱中培养 24-‐72h
（必要时，可适当延长培养时间）。
毕赤酵母表达(pichia pastoris expression )实验手册(3)
毕赤酵母表达（pichia pastoris expression ）实验手册（3）液体YPD培养基可常温保存；琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。
加入Ze ocin 100ug / ml，成为YPDZ培养基，可以4℃条件下保存1～2周。
2.4 YPDS + Zeocin 培养基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medi um）：yeast extract 1%peptone 2%dextrose (glucose) 2%sorbitol 1 M+agar 2%+ Zeocin 100 μg/ml不管是液体 YPDS培养基，还是YPDS + Zeocin 培养基，都必须存放4℃条件下，有效期1～2周。
2.5 MGYMinimal Glycerol Medium （最小甘油培养基）（34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素）。
将800ml灭菌水、100ml的 10* YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混匀即可，4℃保存，保存期为2个月。
2.6 MGYHMinimal Glycerol Medium + Histidine （最小甘油培养基 + 0.004%组氨酸）在1000ml的MGY培养基中加入 10ml的100*H母液混匀，4℃保存，保存期为2个月。
2.7 RDRegeneration Dextrose Medium （葡萄糖再生培养基）（含有：1mol/L的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10-5%生物素；0. 005%氨基酸）1. 将186g的山梨醇定容至700ml，高压灭菌；2. 冷却后于45℃水浴；3. 将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液和88ml无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤2 的山梨醇溶液混合。
4℃保存。
2.8 RDHRegeneration Dextrose Medium + Histidine （葡萄糖再生培养基 + 0.004%组氨酸）在RD培养基配制的第三步中，在加入10ml的100*H母液，同时无菌水的体积减少至78ml即可，其余配制方法与RD相同。
毕赤酵母表达操作手册(精译版)
毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。
不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。
它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。
同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。
这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。
与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。
例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。
毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。
甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。
而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。
两种醇氧化酶蛋白：毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。
细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。
甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。
AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。
AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。
表达：AOX1基因的表达在转录水平受调控。
毕赤酵母表达系统资料整理
毕赤酵母表黑系统之阳早格格创做Mut+战Muts毕赤酵母中有二个基果编码醇氧化酶——AOX1及AOX2，细胞中大普遍的醇氧化酶是AOX1基果产品，甲醇可稀切安排、诱导AOX1基果的下火仄表黑，较典型的是占可溶性蛋黑的30%以上.AOX1基果调控分二步：压制/去压制体制加诱导体制.简朴去道，正在含葡萄糖的培植基中，纵然加进诱导物甲醇转录仍受压制.为此，用甲醇举止劣化诱导时，推荐正在苦油培植基中培植.注意纵然正在苦油中死少(去压制)时，仍缺乏以使AOX1基果达到最矮火仄的表黑，诱导物甲醇是AOX1基果可辨表黑火仄所必须的.AOX1基果已被分散，含AOX1开用子的量粒可用去促进编码中源蛋黑的手段基果的表黑.AOX2基果与AOX1基果有97%的共源性，然而正在甲醇中戴AOX2基果的菌株比戴AOX1基果菌株缓得多，通过那种甲醇利用缓缓表型可分散Muts菌株.正在YPD(酵母膏、蛋黑胨、葡萄糖)培植基中，不管是Mut+仍旧Muts其正在对付数期删殖一倍的时间约莫为2h.Mut+战Muts菌株正在不甲醇存留的情况下死少速率是一般的，存留甲醇的情况下，Mut+正在对付数期删殖一倍的时间约莫为4至6个小时，Muts正在对付数期删殖一倍的时间约莫为18个小时.菌株GS115、X-33、KM71战SMD1168的辨别GS115、KM71战SMD1168等是用于表黑中源蛋黑的毕赤酵母受体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使蛋黑过糖基化，糖基化后有好处蛋黑的溶解或者产死粗确的合叠结构.GS115、KM71、SMD1168正在组氨酸脱氢酶位面(His4)有突变，是组氨酸缺陷型，如果表黑载体上携戴有组氨酸基果，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，果此不妨正在不含组氨酸的培植基上筛选变化子.那些受体菌自收突形成组氨酸家死型的概率普遍矮于10-8.GS115表型为Mut+，沉组表黑载体变化GS115后，少出的变化子大概是Mut+，也大概是Muts(载体与代AXO1基果)，不妨正在MM战MD 培植基上审定表型.SMD1168战GS115类似，然而SMD1168基果组中的Pep4基果爆收突变，是蛋黑酶缺陷型，可落矮蛋黑酶对付中源蛋黑的落解效率.其中X-33由于是家死型，果此耐受性比较佳，如果担心变化率的话不妨思量那种酵母菌，而X33与GS115一般皆是属于MUT＋表示型，也便是道不妨正在含甲醇的培植基中赶快死少，然而是传闻会对付中源基果表黑灵验率，KM71的亲原菌正在粗氨酸琥珀酸裂解酶基果(arg4)有突变，正在不含粗氨酸的培植基中不克不迭死少.用家死型ARG4基果(约2kb)拔出到克隆的家死型AOX1基果的BamHI(AOX1基果15/16暗号子)及SalI(AOX1基果227/228暗号子)位面，与代了AOX1基果16-227暗号子，此结构变化至KM71亲原菌(arg4his4)中，分散爆收KM71 MutsArg+His-菌株，Arg+变化子遗传领会隐现家死型AOX1被aox1::ARG4结构所与代，所以KM71所有变化子皆是Muts表型.AOX1位面不被真足缺得，表面上可用您的手段结构通过基果与代要领替换aox1::ARG4结构，那样沉组菌株的表型是His+MutsArg-，那表示着沉组菌株死万古需粗氨酸.然而仅增加粗氨酸本去不克不迭真足缓战arg4突变的效率，arg4菌株正在含粗氨酸的最小培植基中不克不迭很佳天死少.果此不推荐正在KM71中通过与代aox1::ARG4结构去赢得His＋变化子.普遍去道，如果是胞内表黑，应尽管用Muts细胞，那样得到的蛋黑产品中醇氧化酶蛋黑量较少而手段蛋黑量相对付较多，使下游杂化更易举止.而对付于分泌蛋黑的表黑，无论是甲醇利用缓(Muts)仍旧甲醇利用快(Mut+)的细胞皆可应用.基果沉组Pichia.pastoris酵母菌体内无天然量粒，所以表黑载体需与宿主染色体爆收共源沉组，将中源基果表黑框架调整于染色体中以真止中源基果的表黑，包罗开用子、中源基果克隆位面、末止序列、筛选标记表记标帜等.细菌内共源沉组被认为是沉组量粒构修历程的易面，果为已线性化的环状量粒之间爆收共源沉组的几率非常矮，所以沉组变化载体必须用特定的节制性内切酶举止线性化处理.那种处理的手段是预防随机拔出沉组时量粒正在功能区断开，制成手段基果表黑得活，让共源沉组以指定的办法爆收.表黑载体主要分为以下几类：(1)胞内表黑载体主要有pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWO10，pGAPZ、pGAPZa(Invitrogen)等.该类载体不妨将手段基果表黑正在胞内，不妨预防毕赤酵母的糖基化，主要符合于那些不克不迭被糖基化相闭基果的表黑；(2)分泌型表黑载体主要有pPIC9、pHIL-S1、pPICZα、pYAM75P等.由于毕赤酵母自己的泌内源蛋黑非常少，将中源蛋黑分泌到胞中，非常有好处手段蛋黑量的杂化及聚集.时常使用的分泌的旗号序列主假如由89个氨基酸组成的α接配果子(α-factor)的带领；(3)多拷贝拔出表黑载体如pPIC9K，pPIC3.5K.正在某些情况下，毕赤酵母中沉组基果多拷贝调整可减少所需蛋黑的表黑量.该载体均可用于正在体内(pPIC3.5K, pPIC9K)或者体中(pAO815)爆收并分散多拷贝拔出，共时可检测减少沉组基果的拷贝数是可减少蛋黑表黑量.体内调整可通过下遗传霉素抗性筛选大概的多拷贝拔出，而体中调整可通过对接爆收中源基果的串联拔出.正在GS115中筛选His+Mut+变化子：用SalI或者StuI线性化量粒变化GS115后，大多正在His4位面上爆收沉组，大普遍变化子是Mut+表型；然而由于量粒含有AOX1基果序列，有大概正在AOX1位面爆收沉组，损害家死型AOX1基果，爆收His+Muts变化子，则需要正在MD及MM仄板上检测可证据His+ Mut+变化子.毕赤酵母表黑时常使用培植基10×YNB(13.4%的无氨基酸酵母氮源)，134gYNB固体溶于1L蒸馏火，过滤灭菌，4℃保存.YPD真足培植基：酵母提与物10 g/L，蛋黑胨20 g/L，葡萄糖20 g/L(固体培植基含1.5%琼脂).变化培植基RDB：每100mL加进山梨醇18g(186 g/L)，琼脂糖2g(20g/L)121℃灭菌20分钟，而后待温度落至60℃以去正在超洁台上加进10×YNB 10mL(13.4 g/L)，10×葡萄糖10mL(20 g/L)，500×死物素0.2mL(4×10-4g/L)，100×AA 1mL.混匀，倒仄板(灭菌时只加进80ml火即可).采用培植基MD(最小葡萄糖)：配100mL，背80mL火中加进琼脂糖2g(20 g/L)121℃灭菌20分钟，待温度落至60℃以去正在超洁台上加进10×YNB10mL(13.4 g/L)，10×葡萄糖10mL(20 g/L)，500×死物素0.2mL(4×10-4g/L).采用培植基MM(最小甲醇)：配100mL，背90mL火中加进琼脂糖2g(20 g/L) 121℃灭菌20分钟，待温度落至60℃以去正在超洁台上加进10×YNB 10mL(13.4 g/L)，500×死物素0.2mL(4×10-4g/L)，0.5mL甲醇(0.5%).诱导表黑培植基BMGY：配1L，酵母提与物10 g/L，蛋黑胨20 g/L，3g/L K2HPO4，11.8g/L KH2PO4，加火至890mL，121℃灭菌20分钟，而后待温度落至60℃以去正在超洁台上加进10×YNB 100mL(13.4 g/L)，500×死物素1mL(4×10-4g/L)，苦油10mL.诱导表黑培植基BMMY：酵母提与物10g/L，蛋黑胨20 g/L，3g/LK2HPO4，11.8g/L KH2PO4，加火至895mL，121℃灭菌20分钟，而后待温度落至60℃以去正在超洁台上加进100×YNB 100mL(13.4 g/L)，500×死物素1mL(4×10-4g/L)，甲醇5mL.BMGY/BMMY含酵母浸出物及蛋黑胨，可宁静分泌蛋黑，遏止或者缩小分泌蛋黑的领会.如果手段蛋黑对付中性PH蛋黑酶敏感的话，可正在无缓冲培植基(MGY、MM)中表黑.如果不凭证道明您的分泌蛋黑对付中性PH 值蛋黑酶敏感，修议开初表黑时用BMMY.如果表黑蛋黑落解了，测验考查正在无缓冲培植基中举止表黑.如果以上条件仍不克不迭灵验预防蛋黑落解，可将基果转进SMD1168中，该菌株表型是his4pep4，缺得了蛋黑酶，变化与表黑步调与GS115相共，也可用于大规模收酵.用考马斯明蓝G-250测蛋黑含量。
毕赤酵母表达手册(详细)
毕赤酵母表达（pichia pastoris expression ）实验手册2010-07-15 10:54:56| 分类：毕赤酵母| 标签：|字号大中小订阅一．毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制二．毕赤酵母表达的培养基配制三．主要试验环节的操作 3.1 酵母菌株的分离纯化 3.2 pPICZαA原核宿主菌TOP10F’的活化培养 3.3毕赤酵母表达的试验方法 3.4 毕赤酵母电转化方法 3.5 Pichia酵母表达直接PCR鉴定重组子的方法 3.6 毕赤酵母基因组提取方法 3.7 Mut+表型重组酵母的诱导表达实验关键词：酵母实验毕赤酵母表达 pichia pastoris expression 毕赤酵母酵母菌株大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。
然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。
大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。
另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。
包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。
大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。
但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。
近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。
毕赤酵母表达载体pPICzalpha手册
Recommended Pichia Host Strain
We recommend using the X-33 Pichia strain as the host for expression of recombinant proteins from pPICZα . Other Pichia strains are suitable. The X-33 Pichia strain is available from Invitrogen (see page vii for ordering information) and has the following genotype and phenotype: Genotype: Wild-type Phenotype: Mut+ Continued on next page
Shipping/Storage Reference Sources
The vectors are shipped on wet ice and should be stored at –20°C. The pPICZα A, B, and C vectors may be used with the Original Pichia Expression Kit (Cat. no. K1710-01) and are included in the EasySelect™ Pichia Expression Kit (Cat. no. K1740-01) available from Invitrogen. Additional general information about recombinant protein expression in Pichia pastoris is provided in the manuals for the Original Pichia Expression Kit and the EasySelect™ Pichia Expression Kit. The manuals can be downloaded from our Website () or obtained by calling Technical Support (see page 33). For more information about the Original Pichia Expression Kit or the EasySelect™ Pichia Expression Kit, refer to our Website or contact Technical Support. More detailed information and protocols dealing with Pichia pastoris may also be found in the following general reference (see page vii for ordering information): Higgins, D. R., and Cregg, J. M. (1998) Pichia Protocols. In Methods in Molecular Biology, Vol. 103. (J. M. Walker, ed. Humana Press, Totowaer Manual
毕赤酵母表达手册
Pichia Expression KitVersion M01110225-0043Pichia Expression KitA Manual of Methods for Expression of Recombinant Proteins in Pichia pastorisCatalog no. K1710-01tech_service@iiINDIVIDUAL PICHIA EXPRESSION KIT LICENSE AGREEMENTThe Pichia Expression Kit is based on the yeast Pichia pastoris. Pichia pastoris was developed into an expression system by scientists at Salk Institute Biotechnology/Industry Associates (SIBIA) for high-level expression of recombinant proteins. All patents for Pichia pastoris and licenses for its use as an expression system are owned by Research Corporation Technologies, Inc. Tucson, Arizona. Invitrogen has an exclusive license to sell the Pichia Expression Kit to scientists for research purposes only, under the terms described below. Use of Pichia pastoris by commercial corporations requires the user to obtain a commercial license as detailed below. Before using the Pichia Expression Kit, please read the following license a greement. If you do not agree to be bound by its terms, contact Invitrogen within 10 days for authorization to return the unused Pichia Expression Kit and to receive a full credit. If you do agree to the terms of this Agreement, please complete the User Registration Card and return it to Invitrogen before using the kit.INDIVIDUAL PICHIA EXPRESSION KIT LICENSE AGREEMENTInvitrogen Corporation (INVITROGEN) grants you a non-exclusive license to use the enclosed Pichia Expression Kit (EXPRESSION KIT) for academic research or for evaluation purposes only. The EXPRESSION KIT is being transferred to you in furtherance of, and reliance on, such license. You may not use the EXPRESSION KIT, or the materials contained therein, for any commercial purpose without a license for such purpose from RESEARCH CORPORATION TECHNOLOGIES, INC., Tucson, Arizona. Commercial purposes include the use in or sale of expressed proteins as a commercial product, or use to facilitate or advance research or development of a commercial product. Commercial entities may conduct their evaluation for one year at which time this license automatically terminates. Commercial entities will be contacted by Research Corporation Technologies during the evaluation period regarding the purchase of a commercial license.Access to the EXPRESSION KIT must be limited solely to those officers, employees and students of your institution who need access thereto in order to perform the above-described research or evaluation. You must inform each of such officer, employee and student of the provisions of this Agreement and require them to agree, in writing, to be bound by the provisions of this Agreement. You may not distribute the EXPRESSION KIT to others, even those within your own institution. You may transfer modified, altered or original material from the EXPRESSION KIT to a third party following notification of INVITROGEN such that the recipient can be licensed. You may not assign, sub-license, rent lease or otherwise transfer this License or any of the rights or obligation hereunder, except as expressly permitted.This License is effective until terminated. You may terminate it at any time by destroying all Pichia expression products in your control. It will also terminate automatically if you fail to comply with the terms and conditions of the Agreement. You shall, upon termination of the License, destroy all Pichia Expression Kits in your control, and so notify INVITROGEN in writing.This License Shall be governed in its interpretation and enforcement by the laws of the State of California.Product User Registration CardPlease complete and return the enclosed Product User Registration Card for each Pichia Expression Kit that you purchase. This will serve as a record of your purchase and registration and will allow Invitrogen to provide you with technical support and manual updates. It will also allow Invitrogen to update you on future developments of and improvements to the Pichia Expression Kit. The agreement outlined above becomes effective upon our receipt of your User Registration Card or 10 days following the sale of the Pichia Expression Kit to you. Use of the kit at any time results in immediate obligation to the terms and conditions stated in this Agreement.Technical ServicesInvitrogen provides Technical Services to all of our registered Pichia Expression Kit users. Please contact us if you need assistance with the Pichia Expression Kit.United States Headquarters:Japanese Headquarters European Headquarters:Invitrogen Corporation1600 Faraday AvenueCarlsbad, CA 92008 USATel: 1 760 603 7200Tel (Toll Free): 1 800 955 6288 Fax: 1 760 602 6500E-mail:tech_service@ Invitrogen Japan K.K.Nihonbashi Hama-Cho Park Bldg. 4F2-35-4, Hama-Cho, NihonbashiTel: 81 3 3663 7972Fax: 81 3 3663 8242E-mail: jpinfo@Invitrogen Ltd3 Fountain DriveInchinnan Business ParkPaisley PA4 9RF, UKTel (Free Phone Orders): 0800 269 210Tel (General Enquiries): 0800 5345 5345Fax: +44 (0) 141 814 6287E-mail: eurotech@iiiivTable of ContentsMaterials (vii)Purchaser Notification (x)Product Qualification (xii)Introduction (1)Overview (1)Experimental Outline (3)Recombination and Integration in Pichia (7)Methods (11)Pichia Strains (11)E. coli Strains (13)Selecting a Pichia Expression Vector (14)pHIL-D2 (16)pPIC3.5 (17)pHIL-S1 (18)pPIC9 (19)Signal Sequence Processing (20)Cloning into the Pichia Expression Vectors (21)Transformation into E. coli (26)Preparation of Transforming DNA (27)Growth of Pichia for Spheroplasting (30)Preparation of Spheroplasts (32)Transformation of Pichia (34)Screening for Mut+ and Mut S Transformants (36)PCR Analysis of Pichia Integrants (40)Expression of Recombinant Pichia Strains (42)Analysis by SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (45)Optimization of Pichia Protein Expression (47)Scale-up of Expression (49)Protein Purification and Glycosylation (51)Recipes (53)E. coli Media Recipes (53)Pichia Media Recipes (54)Appendix (59)Electroporation of Pichia (59)PEG 1000 Transformation Method for Pichia (60)Lithium Chloride Transformation Method (61)Total DNA Isolation from Pichia (62)Detection of Multiple Integration Events (63)Procedure for Total RNA Isolation from Pichia (64)β-Galactosidase Assay (65)Technical Service (67)References (69)vviMaterialsKit Contents Box 1: Spheroplast Module. Store at room temperature.Reagent Amount ComponentsSOS media 20 ml 1 M Sorbitol0.3X YPD10 mM CaCl2Sterile Water 2 x 125 ml Autoclaved, deionized waterSE 2 x 125 ml 1 M Sorbitol25 mM EDTA, pH 8.0SCE 2 x 125 ml 1 M Sorbitol10 mM Sodium citrate buffer, pH 5.81 mM EDTA1 M Sorbitol2 x 125 ml --CaS 2 x 60 ml 1 M Sorbitol10 mM Tris-HCl, pH 7.5;10 mM CaCl240% PEG 25 ml 40% (w/v) PEG 3350 (Reagent grade) in waterCaT 25 ml 20 mM Tris-HCl, pH 7.520 mM CaCl2Stab Vials: Pichia and E. coli stabs. Store at +4°C.Phenotype(Pichia only)GenotypeStrain Amountstab his4Mut+GS115 1stab arg4 his4 aox1::ARG4 Mut S, Arg+KM71 1GS115 Albumin 1 stab HIS4Mut SGS115 β-Gal 1 stab HIS4Mut+stab F´ {pro AB, lac I q, lac Z∆M15, Tn10 (Tet R)} mcr A,TOP10F´ 1∆(mrr-hsd RMS-mcr BC), φ80lac Z∆M15, ∆lac X74,deo R, rec A1, ara D139, ∆(ara-leu)7697, gal U,gal K, rps L (Str R), end A1, nup G λ-.Box 2: Spheroplast Module. Store at -20°C.ComponentsReagent AmountZymolyase 10 x 20 µl 3 mg/ml Zymolyase in water(100,000 units/g lytic activity)1 M DTT 10 x 1 ml 1 M dithiothreitol in watercontinued on next pageviiKit Contents,continuedVector Box. Store at -20°C.Reagent DescriptionpHIL-D210 µg, lyophilized in TE, pH 8.0Vector for intracellular expression in PichiapPIC3.510 µg, lyophilized in TE, pH 8.0Vector for intracellular expression in PichiapHIL-S110 µg, lyophilized in TE, pH 8.0 Vector for secreted expression in Pichia. Uses the PHO1 signal sequencepPIC910 µg, lyophilized in TE, pH 8.0 Vector for secreted expression in Pichia. Uses the α-factor signal sequencePrimer Box. Store at -20°C.5´ AOX1 sequencing primer2 µg (312 pmoles), lyophilized5´-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3´3´ AOX1 sequencing primer2 µg (314 pmoles), lyophilized5´-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3´α-Factor sequencing primer2 µg (315 pmoles), lyophilized5´-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3´Media The following prepackaged media is included for your convenience. Instructions for use are provided on the package.Media Amount Yield YP Base Medium 2 pouches 2 liters of YP mediumYP Base Agar Medium 2 pouches 2 liters of YP mediumYeast Nitrogen Base 1 pouch 500 ml of 10X YNBFor transformation of Pichia by spheroplasting, the Pichia Spheroplast Module isavailable separately from Invitrogen (see below for ordering information).Product Reactions or Amount Catalog no.Pichia Spheroplast Module 10 spheroplast preparations(50 transformations)K1720-01continued on next pageviiiRequired Equip-ment and Supplies (not provided) • 30°C rotary shaking incubator• Water baths capable of 37°C, 45°C, and 100°C• Centrifuge suitable for 50 ml conical tubes (floor or table-top)• Baffled culture flasks with metal covers (50 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml, and 3 L)• 50 ml sterile, conical tubes• 6 ml and 15 ml sterile snap-top tubes (Falcon 2059 or similar)• UVSpectrophotometer• Mini agarose gel apparatus and buffers• Polyacrylamide Gel Electrophoresis apparatus and buffers• Media for transformation, growth, screening, and expression (see Recipes, pages 53-58) • 5% SDS solution (10 ml per transformation)• Sterile cheesecloth or gauze• Breaking Buffer (see Recipes, page 58)• Acid-washed glass beads (available from Sigma)• Replica-plating equipment (optional)• BeadBreaker™ (optional)ixPurchaser NotificationIntroduction The Pichia Expression Kit is based on the yeast Pichia pastoris. Pichia pastoris wasdeveloped into an expression system by scientists at Salk Institute Biotechnology/ IndustryAssociates (SIBIA) and Phillips Petroleum for high-level expression of recombinantproteins. All patents for Pichia pastoris and licenses for its use as an expression system areowned by Research Corporation Technologies (RCT), Inc., Tucson, Arizona. Forinformation on commercial licenses, please see page x.The Nature of the Invitrogen License Invitrogen has an exclusive license to sell the Pichia Expression Kit to scientists for research purposes only, under the terms described below. Use of Pichia pastoris by commercial entities for any commercial purpose requires the user to obtain a commercial license as detailed below. Before using the Pichia Expression Kit, please read the following license agreement. If you do not agree to be bound by its terms, contact Invitrogen within 10 days for authorization to return the unused Pichia Expression Kit and to receive a full credit. If you do agree to the terms of this license agreement, please complete the User Registration Card and return it to Invitrogen before using the kit.Pichia pastoris Patents Pichia pastoris is covered by one or more of the following U.S. patents and corresponding foreign patents owned and licensed by Research Corporation Technologies:4,683,293 4,808,537 4,812,405 4,818,700 4,837,148 4,855,231 4,857,467 4,879,231 4,882,279 4,885,242 4,895,800 4,929,555 5,002,876 5,004,688 5,032,516 5,122,465 5,135,868 5,166,329Individual Pichia Expression Kit License Agreement Invitrogen Corporation ("Invitrogen") grants you a non-exclusive license to use the enclosed Pichia Expression Kit ("Expression Kit") for academic research or for evaluation purposes only. The Expression Kit is being transferred to you in furtherance of, and reliance on, such license. You may not use the Expression Kit, or the materials contained therein, for any commercial purpose without a license for such purpose from Research Corporation Technologies, Inc., Tucson, Arizona.Definition of Commercial Purpose Commercial purposes include:(a) any use of Expression Products in a Commercial Product(b) any use of Expression Products in the manufacture of a Commercial Product(c) any sale of Expression Products(d) any use of Expression Products or the Expression Kit to facilitate or advanceresearch or development of a Commercial Product(e) any use of Expression Products or the Expression Kit to facilitate or advance anyresearch or development program the results of which will be applied to thedevelopment of Commercial Products"Expression Products" means products expressed with the Expression Kit, or with the use of any vectors or host strains in the Expression Kit. "Commercial Product" means any product intended for sale or commercial use.Commercial entities may conduct their evaluation for one year at which time this license automatically terminates. Research Corporation Technologies will contact commercial entities during the evaluation period regarding their desire for a commercial license.continued on next pagexPurchaser Notification, continuedIndividual Responsibilities Access to the Expression Kit must be limited solely to those officers, employees and students of your institution who need access to perform the above-described research or evaluation. You must inform each such officer, employee and student of the provisions of this license agreement and require them to agree, in writing, to be bound by the provisions of this license agreement. You may not distribute neither the Expression Kit nor the vectors or host strains contained in it to others, even to those within your own institution. You may only transfer modified, altered, or original material from the Expression Kit to a third party following written notification of, and written approval from, Invitrogen so that the recipient can be licensed. You may not assign, sub-license, rent, lease or otherwise transfer this license agreement or any of the rights or obligation thereunder, except as expressly permitted by Invitrogen and RCT.Termination of License This license agreement is effective until terminated. You may terminate it at any time by destroying all Pichia expression products in your control. It will also terminate auto-matically if you fail to comply with the terms and conditions of the license agreement. You shall, upon termination of the license agreement, destroy all Pichia Expression Kits in your control, and so notify Invitrogen in writing.This License shall be governed in its interpretation and enforcement by the laws of the State of California.Contact for Commercial Licensing Bennett Cohen, Ph.D.Research Corporation Technologies 101 North Wilmot Road, Suite 600 Tucson, Arizona 85711-3335 Phone: (520) 748-4400Fax: (520)748-0025User Registration Card Please complete and return the enclosed User Registration Card for each PichiaExpression Kit that you purchase. This will serve as a record of your purchase and regis-tration and will allow Invitrogen to provide you with technical support and manualupdates. It will also allow Invitrogen to update you on future developments and improve-ments to the Pichia Expression Kit. The agreement outlined above becomes effectiveupon our receipt of your User Registration Card or 10 days following the sale of thePichia Expression Kit to you. Use of the kit at any time results in immediate obligation tothe terms and conditions stated in this license agreement.xiProduct QualificationIntroduction This section describes the criteria used to qualify the components in the PichiaExpression Kit.Vectors All expression vectors are qualified by restriction enzyme digestion. Restriction digests must demonstrate the correct banding pattern when electrophoresed on an agarose gel.Spheroplast Reagents The spheroplast reagents are qualified by spheroplast preparation of GS115 following the protocol provided in the Pichia Expression Kit manual. At least 70% of the Pichia pastoris cells must form spheroplasts in 30 minutes or less.Pichia Strains The Pichia strains are by demonstrating viability of the culture. Single colonies should arise within 48 hours after streaking on YPD medium from the stabPrimers Sequencing primers are lot tested by automated DNA sequencing experiments.Buffers andSolutionsAll buffers and solutions are extensively tested for sterility.Media All Pichia growth and expression media are qualified by growing the GS115 Pichiastrain.xiiIntroductionOverviewReview Articles The information presented here is designed to give you a concise overview of the Pichia pastoris expression system. It is by no means exhaustive. For further information, pleaseread the articles cited in the text along with recent review articles (Buckholz and Gleeson,1991; Cregg et al., 1993; Sreekrishna et al., 1988; Wegner, 1990). A general review offoreign gene expression in yeast is also available (Romanos et al., 1992).General Characteristics of Pichia pastoris As a eukaryote, Pichia pastoris has many of the advantages of higher eukaryotic expression systems such as protein processing, protein folding, and posttranslational modification, while being as easy to manipulate as E. coli or Saccharomyces cerevisiae. It is faster, easier, and less expensive to use than other eukaryotic expression systems such as baculovirus or mammalian tissue culture, and generally gives higher expression levels. As a yeast, it shares the advantages of molecular and genetic manipulations with Saccharomyces, and has the added advantage of 10- to 100-fold higher heterologous protein expression levels. These features make Pichia very useful as a protein expression system.Similarity to Saccharomyces Many of the techniques developed for Saccharomyces may be applied to Pichia including: • transformation by complementation• genedisruption• genereplacementIn addition, the genetic nomenclature used for Saccharomyces has been applied to Pichia. For example, the HIS4 gene in both Saccharomyces and Pichia encodes histidinol dehydrogenase. There is also cross-complementation between gene products in both Saccharomyces and Pichia. Several wild-type genes from Saccharomyces complement comparable mutant genes in Pichia. Genes such as HIS4, LEU2, ARG4, TRP1, and URA3 all complement their respective mutant genes in Pichia.Pichia pastoris as a Methylotrophic Yeast Pichia pastoris is a methylotrophic yeast, capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The first step in the metabolism of methanol is the oxidation of methanol to formaldehyde using molecular oxygen by the enzyme alcohol oxidase. This reaction generates both formaldehyde and hydrogen peroxide. To avoid hydrogen peroxide toxicity, methanol metabolism takes place within a specialized cell organelle called the peroxisome, which sequesters toxic by-products from the rest of the cell. Alcohol oxidase has a poor affinity for O2, and Pichia pastoris compensates by generating large amounts of the enzyme. The promoter regulating the production of alcohol oxidase drives heterologous protein expression in Pichia.Two Alcohol Oxidase Proteins The AOX1 and AOX2 genes code for alcohol oxidase in Pichia pastoris. The AOX1 gene product accounts for the majority of alcohol oxidase activity in the cell. Expression of the AOX1 gene is tightly regulated and induced by methanol to high levels, typically > 30% ofthe total soluble protein in cells grown with methanol as the carbon source. The AOX1 gene has been isolated and the AOX1 promoter is used to drive expression of the gene of interest (Ellis et al., 1985; Koutz et al., 1989; Tschopp et al., 1987a). While AOX2 is about 97% homologous to AOX1, growth on methanol is much slower than with AOX1. This slowgrowth allows isolation of Mut S strains (aox1) (Cregg et al., 1989; Koutz et al., 1989).continued on next page1Overview, continuedExpression Expression of the AOX1 gene is controlled at the level of transcription. In methanol-grown cells approximately 5% of the polyA+ RNA is from the AOX1 gene. The regulation of theAOX1 gene is a two step process: a repression/derepression mechanism plus an inductionmechanism (e.g. GAL1 gene in Saccharomyces (Johnston, 1987)). Briefly, growth onglucose represses transcription, even in the presence of the inducer methanol. For thisreason, growth on glycerol is recommended for optimal induction with methanol. Pleasenote that growth on glycerol (derepression) is not sufficient to generate even minute levelsof expression from the AOX1 gene. The inducer, methanol, is necessary for detectablelevels of AOX1 expression (Ellis et al., 1985; Koutz et al., 1989; Tschopp et al., 1987a).Phenotype of aox1 mutants Loss of the AOX1 gene, and thus a loss of most of the cell's alcohol oxidase activity, results in a strain that is phenotypically Mut S (Methanol utilization slow). This has in the past been referred to as Mut. The Mut S designation has been chosen to accurately describe the phenotype of these mutants. This results in a reduction in the cells' ability to metabolize methanol. The cells, therefore, exhibit poor growth on methanol medium. Mut+ (Methanol utilization plus) refers to the wild type ability of strains to metabolize methanol as the sole carbon source. These two phenotypes are used when evaluating Pichia transformants for integration of your gene (Experimental Outline, page 3).Intracellular and Secretory Protein Expression Heterologous expression in Pichia can be either intracellular or secreted. Secretion requires the presence of a signal sequence on the expressed protein to target it to the secretory pathway. While several different secretion signal sequences have been used successfully, including the native secretion signal present on some heterologous proteins, success has been variable. The secretion signal sequence from the Saccharomyces cerevisiaeα factor prepro peptide has been used most successfully (Cregg et al., 1993; Scorer et al., 1993).The major advantage of expressing heterologous proteins as secreted proteins is that Pichia pastoris secretes very low levels of native proteins. That, combined with the very low amount of protein in the minimal Pichia growth medium, means that the secreted heterologous protein comprises the vast majority of the total protein in the medium and serves as the first step in purification of the protein (Barr et al., 1992). Note: If there are recognized glycosylation sites (Asn-X-Ser/Thr) in your protein's primary sequence, glycosylation may occur at these sites.Posttranslational Modifications In comparison to Saccharomyces cerevisiae, Pichia may have an advantage in the glyco-sylation of secreted proteins because it may not hyperglycosylate. Both Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris have a majority of N-linked glycosylation of the high-mannose type; however, the length of the oligosaccharide chains added posttranslationally to proteins in Pichia (average 8-14 mannose residues per side chain) is much shorter than those in S. cerevisiae (50-150 mannose residues) (Grinna and Tschopp, 1989; Tschopp et al., 1987b). Very little O-linked glycosylation has been observed in Pichia.In addition, Saccharomyces cerevisiae core oligosaccharides have terminal α1,3 glycan linkages whereas Pichia pastoris does not. It is believed that the α1,3 glycan linkages in glycosylated proteins produced from Saccharomyces cerevisiae are primarily responsible for the hyper-antigenic nature of these proteins making them particularly unsuitable for therapeutic use. Although not proven, this is predicted to be less of a problem for glycoproteins generated in Pichia pastoris, because it may resemble the glycoprotein structure of higher eukaryotes (Cregg et al., 1993).2Experimental OutlineSelection of Vector and Cloning To utilize the strong, highly inducible P AOX1 promoter for expression of your protein, four expression vectors are included in this kit. pHIL-D2 and pPIC3.5 are used for intracellular expression while pHIL-S1 and pPIC9 are used for secreted expression (see pages 14-19 for more information). Before cloning your insert, you must...• decide whether you want intracellular or secreted expression.• analyze your insert for the following restriction sites: Sac I, Stu I, Sal I, Not I, and Bgl II. These sites are recommended for linearizing your construct prior to Pichiatransformation. If your insert has all of these sites, see pages 28-29 for alternate sites.Transformation and IntegrationTwo different phenotypic classes of His+ recombinant strains can be generated: Mut+ and Mut S. Mut S refers to the "Methanol utilization slow" phenotype caused by the loss of alcohol oxidase activity encoded by the AOX1 gene. A strain with a Mut S phenotype has a mutant aox1 locus, but is wild type for AOX2. This results in a slow growth phenotype on methanol medium. Transformation of strain GS115 can yield both classes of transformants, His+ Mut+ and His+Mut S, while KM71 yields only His+ Mut S since the strain itself is Mut S. Both Mut+ and Mut S recombinants are useful to have as one phenotype may favor better expression of your protein than the other. Due to clonal variation, you should test 6-10 recombinants per phenotype. There is no way to predict beforehand which construct or isolate will better express your protein. We strongly recommend that you analyze Pichia recombinants by PCR to confirm integration of your construct (see page 40).Once you have successfully cloned your gene, you will then linearize your plasmid to stimulate recombination when the plasmid is transformed into Pichia. The table below describes the types of recombinants you will get by selective digestion of your plasmid. RestrictionEnzymeIntegration Event GS115 Phenotype KM71 PhenotypeSal I or Stu I Insertion at his4His+ Mut+ His+ Mut SSac I Insertion at 5´AOX1 regionHis+ Mut+ His+ Mut SNot I or Bgl II Replacement atAOX1 locusHis+ Mut SHis+ Mut+His+ Mut S (notrecommended, see page 11)Expression and Scale-up After confirming your Pichia recombinants by PCR, you will test expression of both His+Mut+ and His+ Mut S recombinants. This will involve growing a small culture of each recombinant, inducing with methanol, and taking time points. If looking for intracellular expression, analyze the cell pellet from each time point by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). If looking for secreted expression, analyze both the cellpellet and supernatant from each time point. We recommend that you analyze your SDS-PAGE gels by both Coomassie staining and Western blot, if you have an antibody to your protein. We also suggest checking for protein activity by assay, if one is available. Not all proteins express to the level of grams per liter, so it is advisable to check by Western blotor activity assay, and not just by Coomassie staining of SDS-PAGE gels for production of your protein.Choose the Pichia recombinant strain that best expresses your protein and optimizeinduction based on the suggestions on pages 47-48. Once expression is optimized, scale-up your expression protocol to produce more protein.continued on next page3。
裂解酶 毕赤酵母表达
裂解酶毕赤酵母表达裂解酶是一种重要的酶类，能够将高分子物质裂解为较小的分子，被广泛应用于制药、食品、化工等领域。
毕赤酵母是一种常见的酵母菌，因其生长速度快，易培养，被广泛应用于分子生物学研究领域。
本文将围绕着“裂解酶毕赤酵母表达”这一主题，进行详细阐述。
第一步，克隆裂解酶基因首先需要克隆裂解酶基因。
裂解酶基因可以从天然菌株或基因库中获得。
一般情况下，可采用PCR技术或构建文库的方法进行克隆。
PCR克隆是一种常见的将特定基因扩增的方法，需要设计引物。
而文库构建则需要将大量的DNA片段克隆到载体上，获取含有目标基因的克隆体。
第二步，构建表达载体获取裂解酶基因后，需要将其插入到表达载体中，以实现外源基因的表达。
表达载体一般包括启动子、编码区、终止序列等部分。
还需要添加适合裂解酶表达的表达基因启动子和信使RNA聚合酶结合位点。
可采用限制性内切酶、LiGA等方法，将裂解酶基因插入到表达载体中。
第三步，转化毕赤酵母将构建好的表达载体转化到毕赤酵母细胞中。
目前主要有两种转化方法，一种是化学转化，一种是电转化。
化学转化依赖于离子间的相互作用力，可将DNA引入到细胞中。
而电转化则是利用高电压作用于细胞，使其渗透性提高，DNA片段能够进入细胞。
第四步，筛选表达菌株进行转化后，将细胞涂布于含有蔗糖的SD-UF板上进行筛选。
含有蔗糖的培养基只能被表达裂解酶的菌株使用，其他菌株无法生长，通过这种方法可以筛选出表达裂解酶的毕赤酵母菌株。
第五步，表达和纯化裂解酶最后，使用相应的表达条件和纯化方法，纯化表达的裂解酶。
一般情况下，裂解酶是一种外分泌酶，可采用诱导性表达，通过添加诱导因子（如甘露醇）来促进裂解酶的分泌。
常见的纯化方法包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
总之，裂解酶毕赤酵母表达是一个复杂的过程，需要准确的基因克隆、合适的表达载体、科学的转化方法、合适的筛选条件和纯化方法等。
只有在这些步骤都正确执行的情况下，才能够得到表达裂解酶的毕赤酵母菌株，并最终纯化出高质量的裂解酶。
毕赤酵母发酵手册
毕赤酵母发酵手册毕赤酵母发酵手册总览简介：毕赤酵母和酿酒酵母非常相似，都非常适合发酵生长。
毕赤酵母在可能提高总体蛋白质产量的发酵中能够达到非常高的细胞浓度。
我们建议只有那些有过发酵经验或能得到有经验的人的指导的人参与发酵。
因为发酵的类型很多，所以我们很难为您的个人案例提供详细的过程。
下面所给出的指导是基于Mut+和Muts两种基因型的毕赤酵母菌株在15L的台式玻璃发酵罐中发酵而成。
请在您的发酵开始前先阅读操作员手册。
下面所给出的表是整个指导的概况。
步骤标题页码1 发酵参数 12 设备推荐和培养基的制备 23 培养中溶氧的测量和使用 34 种子液的培养 45 在分批和分批补料培养中生物量对应于4-5甘油的生成6 Mut+和Muts基因型重组子在甲醇分批补料状态下表达的介绍 6-77 细胞的成熟与衰退 88 参考文献 9-109 配方 11发酵参数：在整个发酵过程中监测和调控下列参数非常重要。
下面的表格描述了这些参数和监测这些参数的原因。
参数原因温度（30℃）在32℃以上的温度下生长不利于蛋白质的表达溶氧（＞20％）毕赤酵母利用甘油和甲醇需要氧气pH（5.0-6.0和3.0）对于外源蛋白分泌到培养基中和最适生长非常重要转度（500-1500rpm）通气（玻璃发酵罐中为0.1-1.0vvm※）使培养基中的氧浓度达到最大值消泡剂（消除泡沫的最小量）碳源（变化率）每分钟1体积发酵液（L）中氧气的体积（L）使培养基中的氧浓度达到最大值取决于设备推荐：下面是所推荐设备的清单：发酵罐的夹套需要在发酵过程中给酵母菌降温，尤其是在甲醇流加过程中。
你需要一个固定的来源来提供冷却水（5-10℃）。
这可能意味着你需要一个冷冻装置来保持水的冷却。
一个泡沫探针就像消泡剂一样不可或缺。
一个氧气的来源——空气（不锈钢的发酵罐需要1-2vvm）或者纯氧（玻璃发酵罐需要0.1-0.3vvm）。
添加甘油和甲醇的补料泵。
pH的自动控制。
毕赤酵母菌种培养手册
毕赤酵母菌种培养手册1. 引言本手册旨在提供毕赤酵母菌种培养的详细步骤和注意事项。
毕赤酵母（Saccharomyces cerevisiae）被广泛应用于食品工业、酿酒业和生物学研究等领域。
通过正确的菌种培养技术，可以确保毕赤酵母的活力和纯度，从而保证实验和应用的可靠性和准确性。
2. 材料和方法2.1 培养基选择适合的培养基是培养毕赤酵母的关键。
常用的培养基包括YPD培养基、SD培养基和SC培养基等。
根据具体实验需求选择合适的培养基配方，并按照相应操作说明制备。
2.2 菌种的制备和传代1. 从冰冻保存的毕赤酵母菌种中取出适量菌种转移到无菌培养基中。
2. 在适当的温度（通常为30°C）下培养菌种至对数生长期。
3. 取适量无菌培养基转移菌种，传代培养。
2.3 菌种培养1. 取适量菌种转移到含有适量无菌培养基的培养瓶中。
2. 控制培养瓶中的菌液浓度，通常为OD600=0.5。
3. 在适当的温度（通常为30°C）下培养菌种至对数生长期或其他实验所需生长期。
2.4 菌种保存菌种的保存有助于长期维持活力和纯度。
常用的保存方法包括冷冻保存和制备冻干菌种等。
3. 结果和讨论通过本手册提供的方法，可以成功培养并维持毕赤酵母菌种的活力和纯度。
在培养过程中，应注意操作的无菌性和培养条件的合适性。
此外，根据具体实验需求，可适当调整菌液的浓度和培养温度等参数。
4. 总结本手册详细介绍了毕赤酵母菌种培养的步骤和注意事项。
正确的菌种培养技术对于保证实验和应用的可靠性和准确性至关重要。
通过遵循本手册的指南和方法，可以有效地培养毕赤酵母菌种，并取得可靠的实验结果。
请注意，本手册仅提供参考，并且在使用过程中应遵守相关的实验室安全操作和法律法规要求。
毕赤酵母表达步骤
毕赤酵母表达系统的构建1.确定转入的目的基因，并设计相应引物，进行PCR反应，获取目的基因片段。
（所需药品-高保真酶，引物，dntp，胶回收试剂盒。
）2.对目的基因及载体Ppic9k进行酶切产生粘性接头并纯化回收。
（所需药品- SalI、StuI、SacI 【用于于GS115产生His+Mut+】；BglII【用于于GS115产生His+Muts】）酶切体系酶切体系50 μL目的DNA 10 μL酶切缓冲液 5 μL限制性内切酶 1 μL超纯水34μL37 ℃酶切 1～4小时。
酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。
3.将酶切正确的目的片度与质粒相连（所需药品-连接试剂盒SolutionⅠ[宝生物]）载体DNA0.5µL目的片段DNA 4.5µL连接试剂盒SolutionⅠ 5 µL充分混匀，置于16 ℃连接4 h或4 ℃连接过夜。
4.转入DH5α扩繁质粒（所需药品- A mp；DH5α；CaCl2）将DNA目的片段和载体的连接产物与200µL感受态细胞混匀，冰浴30min。
45℃热击45-60s，冰浴3min后加入800μL LB 液体培养基37℃震荡培养1h。
（1 ）转化后，将转化混合物涂在含50-100ug/ul A mp 的LB平板上，选择A mp 抗性克隆（2）挑取10 个A mp 抗性转化子，接种含150ug/ul A mp 的培养基，37 度振荡培养过夜（3 ）提取质粒进行PCR及酶切检测并送交测序。
（pPIC9k 测序时，用α-factor 引物及3’AOX1 测序引物。
将引物重悬于20ul灭菌水中，制成0.1ug/ul 溶液）4 在0.85ml 过夜培养菌液中加入0.15ml 灭菌甘油，以便保存所需克隆，涡旋混匀转入标记好的储存管中。
在液氮或干冰/酒精浴中冷冻后移入-70 度保存。
5 测序证实结构正确后，可准备转化DNA5.毕赤酵母电转化：细胞准备：毕赤酵母感受态制备：（1）取1 mL GS115过夜培养物(OD6006．0～10．0)转接于100 mL YPD液体培养基中28℃-3O℃、250—300 r／min培养至酵母菌的对数生长期(OD600 1．0～1．3)（2）取此菌1 mL分装到1．5 mL EP管中，4℃、10 000 g离心1 min，弃上清液，沉淀用无菌水(4℃预冷)洗涤，同样条件下离心，弃上清液。
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统综述
毕赤酵母启动子以及诱导物
启动子 诱导表达 AOX1，AOX2(甲醇氧化酶) 以甲醇诱导表达 GAP （3 一磷酸甘油醛脱氢酶） 葡萄糖组成型 表达（甘油或甲醇诱导产量只有2/3，1/3） FLD1（甲醛脱氢酶） 以甲基化胺为氮源 (葡萄 糖为碳源)，甲醇为碳源 (硫酸铵为氮源)表达 PEX8（过氧化物酶体基质蛋白） 以葡萄糖、 甲醇诱导表达 YPT1（GTP酶） 以葡萄糖甲醇、甘露糖醇组 成型表达
外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中的 表达种类
具有代表性的如下列一些外源蛋白质P.pastoris中已经获得高效产 生： (1)蛋白酶类，如人溶菌酶、人胃促胰酶、葡萄糖苷酶等； （2）激素类，如胰岛素前体、人绒毛膜促性腺激素、鲤鱼生长激 素等； （3）受体、抗体及单链抗体等生物活性蛋白； (4)抗原类，如乙型肝炎表面抗原、破伤风毒素片段C、登革热病 毒E蛋白等； (5)细胞因子类，如肿瘤坏死因子、表皮生长因子、血管生成抑制 因子等； （6）酶制剂类，如植酸酶等； (7)病毒蛋白类，如乙型脑炎病毒E蛋白、伪狂犬病病毒Ea株gE蛋 白等
毕赤酵母的优点
利用受甲醇诱导的醇氧化酶(AOX1)启动子，可严格 控制外源基因的表达
营养要求简单，生长快速，适合高密度大规模培养， 很少产生有毒物质，毒性比细菌小，用甲醇不易染菌， 可以减少污染。 外源蛋白基因遗传高稳定性，外源蛋白质具有一定程 度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋 白质更加稳定，特别适合于表达真核生物基因和制备 有功能的蛋白质。
毕赤酵母发酵工艺对产量的影响
甲醇营养型毕赤酵母表达外源蛋白发酵一般有二个阶 段，即酵母细胞营养生长阶段和外源蛋白表达阶段。 酵母细胞生长阶段主要目的为达到一定的菌体量，另 一方面通过流加限制甘油来抑制甲醇代谢途径，并使 细胞从甘油相顺利向甲醇相过渡。 蛋白表达阶段由于毕赤酵母具有以甲酵作为唯一碳源 和能源的特性，且外源基因就插入在能够利用甲醇的 AOX基因中，当甘油用完时立刻补入甲醇诱导AOX基 因产生醇氧化酶来利用甲醇，同时启动表达外源基因 的AOX的启动子(PAOX)表达外源基因蛋白
毕赤酵母诱导表达实验步骤（1）
毕赤酵母诱导表达实验步骤（1）
BMGY的配制（每200 mL）
Yeast extract 2 g
Peptone 4 g
K3PO4(pH 6.0) 20 mL
丙三醇 2 mL
定容至180 mL，121，灭20 min。
使用前再加入
10*YNB 20 mL（10%）（过滤除菌）
生物素0.4 mL（0.02%）（过滤除菌）
加入后，用紫外照射10 min左右再接菌。
BMMY的配制（每200 mL）
Yeast extract 2 g
Peptone 4 g
K3PO4(pH 6.0) 20 mL
定容至180 mL，121，灭20 min。
使用前再加入
10*YNB 20 mL（10%）（过滤除菌）
生物素0.4 mL（0.02%）（过滤除菌）
甲醇0.5%
加入后，用紫外照射10 min左右再接菌。
10*YNB的配制
酵母基础氮源培养基 3.4 g
硫酸铵10 g
双蒸水80 mL
定容至100 mL，过滤除菌（用0.22 μm滤膜过滤）。
毕赤酵母诱导表达
1.配BMGY和BMMY灭菌
2.使用前向BMGY按比例加入生物素、10*YNB，紫外照10 min。
3.接菌于BMGY，250 rpm，28℃摇24 h
4.向BMMY中按比例加入生物素、10*YNB、甲醇，紫外照10
min。
5.将含有菌液的BMGY转移至50 mL离心管，4℃5000 rpm 离心5 min，弃上
清。
6.用BMMY将沉淀菌体重悬，倒回瓶中，250 rpm，28℃，摇3 d。
每24 h补
一次甲醇。
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毕赤酵母表达（pichia pastoris expression ）实验手册2010-07-15 10:54:56| 分类：毕赤酵母| 标签：|字号大中小订阅一．毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制二．毕赤酵母表达的培养基配制三．主要试验环节的操作 3.1 酵母菌株的分离纯化 3.2 pPICZαA原核宿主菌TOP10F’的活化培养 3.3毕赤酵母表达的试验方法 3.4 毕赤酵母电转化方法 3.5 Pichia酵母表达直接PCR鉴定重组子的方法 3.6 毕赤酵母基因组提取方法 3.7 Mut+表型重组酵母的诱导表达实验关键词：酵母实验毕赤酵母表达 pichia pastoris expression 毕赤酵母酵母菌株大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。
然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。
大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。
另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。
包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。
大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。
但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。
近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。
因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。
［1］。
同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。
酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。
1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。
干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。
原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失［7、8］，质粒变得不稳定，拷贝数下降。
拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。
同时，实验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降［9］。
为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统［10］。
甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。
毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点［1、9、11］；⑴具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一。
⑵表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合。
⑶菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。
⑷毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用。
Pichia.pastoris基因表达系统经过近十年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中，能使产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。
利用强效可调控启动子AOX1，已高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素C片段、基因工程抗体等多种外源基因［11、12、13］，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩大为工业规模［14］。
目前美国FDA已能评价来自该系统的基因工程产品，最近来自该系统的Cephelon制剂已获得FDA批准，所以该系统被认为是安全的．Pichia.pastoris表达系统在生物工程领域将发挥越来越重要的作用，促进更多外源基因在该系统的高效表达，提供更为广泛的基因工程产品［9、11］。
近年来，Invitrogon公司开发了毕赤酵母表达系统的系列产品，短短几年已经有300多种外源蛋自在该系统得到有效表达，被认为是目前最有效的酵母表达系统。
毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。
其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。
Pichia.pastoris酵母菌体内无天然质粒，所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达［15］，包括启动子、外源基因克隆位点、终止序列、筛选标记等。
表达载体都是穿梭质粒，先在大肠杆菌复制扩增，然后被导入宿主酵母细胞。
为使产物分泌胞外，表达载体还需带有信号肽序列。
毕赤酵母表达系统有多种分泌型表达质粒，有许多蛋白在毕赤酵母得到了高效分泌表达。
胞外表达需要在外源蛋白的N 末端加上一段信号肽序列，引导重组蛋白进入分泌途径，可使蛋白蛋白质在分泌到胞外之后获得准确的构型。
毕赤酵母对外源蛋白自身的信号序列识别能力差，在本试验中所使用pPICZαA质粒，其信号肽来自酿酒酵母的α-交配因子（α-factor），能很好的达到以上的要求。
并且作为新一代的毕赤酵母分泌表达质粒，它还拥有一个特点是其具有Zeocin 抗性标记基因，给我们筛选转化子的工作带来很大的便利［1、9］。
pPICZαA质粒是作为新一代的毕赤酵母分泌表达质粒，它的主要特点简介如下：⑴具有强效可调控启动子AOX1（alcohol oxidase，醇氧化酶）；⑵具有Zeocin抗性筛选标记基因，重组转化子可直接用Zeocin进行筛选，即在YPDZ平板上生长的转化子中，100％都有外源基因的整合，大大简化了重组转化酵母的筛选过程［15］。
在操作过程中，Zeocin也可用来筛选含表达载体pPICZαA的大肠杆菌转化子，不必另外使用Amp，经济而又简便；。
⑶在表达载体A0X1 5’端启动子序列下游，有供外源基因插入的多克隆位点，多克隆位点下游有A0X1 3’端终止序列；⑷分泌效率强的信号肽α-factor.Invitrogen公司开发的毕赤酵母表达系统的系列产品作为目前被应用为最为广泛的酵母表达系统，其主要的优点有：醇氧化酶可调控的强启动子，能高密度发酵，重组蛋白表达量高。
外源基因整合在酵母基因组上，可以稳定存在。
同时，高效分泌表达质粒能将外源蛋白表达后，进行翻译后加工处理，将外源蛋白分泌到细胞外，不但提高表达蛋白的活性，而且．有利于产物的纯化一．毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制1．1 各种母液的配制10*YNB （含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基）4℃保存。
34g酵母基础氮源培养基（无硫酸铵）+100g 硫酸铵，溶于1000ml水中，过滤除菌。
500*B （0.02%生物素Biotin）4℃保存保存期为1年。
20mg的生物素溶于100ml水中，过滤除菌。
100*H （0.4%Histidine 组氨酸）4℃保存保存期为1年。
400mg的L-组氨酸溶于100ml水中，（加热至50℃以促进溶解），过滤除菌。
10*D （20%Dextrose 葡萄糖）保存期为1年。
200g葡萄糖溶于1000ml水中，灭菌15min或过滤除菌。
10*M （5%Methanol 甲醇）保存期为2个月。
将5ml的甲醇与95ml水混匀，过滤除菌。
10*GY （10%Glycerol 甘油）保存期为1年以上。
将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。
100*AA （0.5% of each Amino Acid，各种氨基酸）4℃保存保存期为1年。
分别将500mg的L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸溶于100ml水中，过滤除菌。
1M 磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer，pH6.0），将1mol/L的K2HPO4溶液132ml与1mol/L的KH2PO4溶液868ml混匀，其pH为6.0，如需调节pH，则使用磷酸和氢氧化钾调节pH。
1.2 常用溶液及缓冲夜1.2.1 碱裂解法抽提质粒DNA所用溶液：溶液Ⅰ：50mmol / L glucose，100mmol / L EDTA，25mmol / L Tris－HCI (pH 8.0)溶液Ⅱ：0.2mol／L NaOH，1％SDS（临用时配制）溶液Ⅲ：29.44g KAc，11.5ml Acetic acid，加ddH2O 至100 ml。
4℃保存。
1.2.2 10% 甘油（Glycerol）：将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。
保存期为1年以上。
1.2.3 Rnase-H2O：1ul Rnase 加入1ml 灭菌dd H2O。
4℃保存。
1.2.4 TE缓冲液：10mmol / Tris-CI（pH 8．0），lmmol / L EDTA（pH 8.0）1.2.5 STE缓冲液：0.1mol / L, 10mmol / L Tris-HCl (pH 8.0), 1mmol / L EDTA (pH 8.0)1.2.6 SCE缓冲液：1mol / L Sorbitol (山梨醇), 10mmol / L 柠檬酸钠，10mmol / L EDTA1.2.7 1M potassium phosphate buffer （pH 6.0）：132 ml 1M K2HPO4868 ml 1M KH2PO41.2.8 50X TAE 琼脂糖凝胶电泳缓冲液，pH 8.0（1L）：242 g Tris57.1 ml Acetic Acid37.2 g EDTA二．毕赤酵母表达的培养基配制［5］2.1 LB（Luria－Bertani）培养基：Trypton l％Yeast Extract 0.5％NaCl l％PH 7.0制作平板时加入2％琼脂粉。