第四章 克隆载体
第四章 人工染色体载体
第4章 人工染色体载体黏粒载体 酵母人工染色体载体 细菌人工染色体载体 P1噬菌体载体和P1人工染色体载体表4-1 5种常见高容量克隆载体及其基本特性载体黏粒 P1 PAC BAC YAC容量（kb） 复制子30-45 70-100 130-150 120-300 250-400 ColE1 P1 P1 F ARS宿主拷贝数重组DNA导入 宿主的方式转导 转导 电转化 电转化 转化筛选标记— sacB sacB α-互补 ade2克隆DNA 获取方法 碱抽提大肠杆菌 高 大肠杆菌 1 大肠杆菌 1 大肠杆菌 1 酵母菌 1脉冲场电 泳14.1 黏粒载体4.1.1 黏粒的结构特征和用途o 黏粒（cosmid）是质粒的衍生物，是带有cos序 列的质粒。
cos序列是λ噬菌体DNA中将DNA包装 到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。
o 黏粒的组成包括质粒复制起点（ColE1）、抗性 标记（ampr）、cos位点，因而能像质粒一样转 化和增殖。
o 它的大小一般5-7kb左右，用来克隆大片段 DNA，克隆的最大DNA片段可达45kb。
4.1.2 黏粒载体的 工作原理图4-1 黏粒载体 克隆 DNA的 一般原 理和步 骤24.1.3 黏粒克隆载体1．黏粒pJB8o 大小为5.4kb，由 ampr，ColE1复制 起点（ori）， cos位点，多克隆 位点组成，可容 纳33-46.5kb外源 DNA片段，主要用 来在细菌中克隆 真核DNA。
2．含双cos位点的黏粒载体o c2RB和 Supercos-1是 含双cos位点的 黏粒载体， c2RB大小为 6.8kb，含两个 cos位点，在 cos位点之间有 Kanr（图4-3）。
o 装载容量3346.5kb图4-3 黏粒载体c2RB图谱3图4-4 Supercos-1克隆 的原理和步骤o Supercos-1 大小为 7.94kb，含 有在真核细 胞中起作用 的来自猿猴 病毒SV40的 复制起点 ori-SV40和 新霉素抗性 基因 （neor）。
基因工程载体
二、噬菌体载体 （一）、λ噬菌体载体
1、λ噬菌体载体的特征
λ噬菌体颗粒中DNA为线状双链DNA分子，全长48502bp， 两端各有一段长度为12个核苷酸的互补单链（粘端），称 为cos位点。λ 噬菌体有61个基因，其中有1/3的区域是其 裂解性生长的非必需区，这一区段的缺失，或在此区段中 插入外源DNA，并不影响噬菌体的增殖，这就是λ 噬菌体 可作为基因载体的依据 。
第一节
微生物基因工程载体
克隆载体（cloning vecto载体（expression vector）：能使目的基因在宿 主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子， 更要有强启动子； 穿梭载体（shuttle vector）：这类载体可以在原核细 胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。
四、酵母菌载体
多数酵母中含有一种能独立复制的环状双链DNA，称为 2μ 质粒，长约6.3kb，有单一的复制起始点和一个自主 复制功能区域（ARS片段）。 根据质粒的复制方式不同将它们分为：整合型、复制型、 附加型和稳定型等类型。
共同的特点：
①含有E.coli质粒的复制起始序列，这样在外源基因转到酵 母细胞前可先在大肠杆菌中扩增。
外源基因的插入：
PstI Amp r Tet r Amp s Tet r
重组体的筛选
. .. . . . . .
涂布有Tet的培养基
.. .. . .
涂布有Amp的培养基
3、pUC系列质粒载体
（1）特点 具有更小的分子 量（2686bp）和 更高的拷贝数。 具有多克隆位点
可用组化方法鉴别：
含有一个来自于大肠杆菌的经过加工的LacZ基因 （LacZ′），它编码β -半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸 ， 可以和β -半乳糖苷酶缺陷型的大肠杆菌实现基因内互补， 即α —互补 ，恢复分解乳糖的能力。 X-gal也是β -半乳糖苷酶的一种底物，经降解后可生成溴 氯吲哚，使大肠杆菌菌落呈蓝色。当无β -半乳糖苷酶时， X-gal不被分解，菌落呈白色。 当外源基因插入到pUC质 粒的LacZ′基因内部，则LacZ′基因受到破坏，便不能 再和缺陷型受体菌中生成有活性的β -半乳糖苷酶，因此， 菌落呈白色。 反之，非重组体为蓝色菌落。 可通过插入失活法进行筛选
基因工程第四章载体
（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性 标记基因内部。
如pDF41、pDF42、pBR329。
外源DNA
抗菌素抗性
无抗菌素抗性
（5）正选择的质粒载体 Direct selection vectors
直接选择转化后的细胞。
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才 能在选择培养基上生长。
如pUR2、pTR262等。
目前通用的绝大部分质粒载体都是正 选择载体。
（6） 表达型质粒载体
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。
注意启动子的性质，终止子、起始 密码、终止密码的阅读正确。
如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的 真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻 译信号控制之下。
表达载体的结构
1）普通载体元件
b）细菌抗性原理 Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地 切割氨苄青霉素的-内酰胺环。
ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）
a）抑菌原理 通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞 蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死 生长的细菌。
b）细菌抗性原理
Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉 素乙酰化而失活。
（2）长度 6.3 kb。
（3）选择标记
大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫 的基因（immE1）
① colicin E1基因的结构
cea 结构基因
imm
kil
免疫基因 溶菌基因
② 杀死不含有ColE1细菌的原因 cea + kil基因产物
③ 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因 imm基因
① 双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
克隆载体构建实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习克隆载体的构建方法，掌握分子克隆的基本原理和操作步骤。
2. 掌握利用限制性内切酶和DNA连接酶进行DNA片段的插入和连接。
3. 熟悉重组质粒的鉴定和扩增方法。
二、实验原理克隆载体是分子生物学研究中常用的工具，它可以将目的基因插入其中，并在宿主细胞中进行扩增。
克隆载体的构建主要包括以下步骤：1. 设计引物：根据目的基因序列设计特异性引物，用于PCR扩增目的基因片段。
2. PCR扩增：利用引物扩增目的基因片段。
3. 载体线性化：利用限制性内切酶将载体线性化，使其具有末端粘性。
4. DNA片段连接：将目的基因片段与载体进行连接。
5. 转化宿主细胞：将连接后的重组质粒转化至宿主细胞。
6. 鉴定和扩增：通过PCR、酶切等方法对转化后的细胞进行鉴定和扩增。
三、实验材料1. 试剂：PCR引物、限制性内切酶、DNA连接酶、DNA分子量标准、Taq酶、pUC19载体、感受态细胞等。
2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、DNA纯化柱等。
四、实验步骤1. 设计引物：根据目的基因序列设计特异性引物，引物长度一般为20-30个碱基，其中包含酶切位点。
2. PCR扩增：利用引物扩增目的基因片段，PCR反应体系如下：- 10×PCR缓冲液5μl- dNTPs（每种2.5μmol/L）4μl- 引物（上下游引物各1μmol/L）2μl- DNA模板1μl- Taq酶0.5μl- ddH2O补充至50μl3. 载体线性化：利用限制性内切酶将载体线性化，反应体系如下：- 载体DNA 5μl- 10×酶切缓冲液5μl- 限制性内切酶1μl- ddH2O补充至20μl4. DNA片段连接：将PCR产物与载体进行连接，反应体系如下：- 线性化载体DNA 5μl- PCR产物5μl- 10×连接缓冲液5μl- DNA连接酶1μl- ddH2O补充至20μl5. 转化宿主细胞：将连接后的重组质粒转化至感受态细胞，具体操作方法如下：- 将感受态细胞铺板于含有适当抗生素的培养基上，37℃培养过夜。
第四章 基因工程的质粒载体
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
4第四章 基因克隆的载体-1质粒
4、载体分子中有一段不影响它们扩增的非必须区域， 插入其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行 复制和扩增； 5、具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因非控 制性扩增。
载体的种类和特征
（二）根据质粒自身传递的性质分为两大类： 1、结合型质粒：能自我复制，含转移基 因组，可自我控制质粒从一个寄主细胞传到 另一个寄主细胞。 如：F质粒，部分R质粒、Col质粒。 2、非结合型质粒：能自我复制，不含转 移基因组，不能自主在细胞间传递。 如：R质粒、Col质粒
（三）根据质粒的复制特性分为两大类： 1、严紧型质粒：是一类低拷贝数的质粒， 每个细胞中仅含有一个或几个质粒； 拷贝（数）是指一种质粒在一个寄主细 胞中存在的数目。 2、松弛型质粒：是高拷贝数的质粒， >20拷贝/细胞。该类基因工程中常用。
Example: a. 在pBR322质粒的BamHⅠ或SalⅠ位点 插入外源DNA片断，切断了tetr基因编码 序列的连续性，使之失去活性，产生出 AmprTets表型的重组pBR322质粒，转化 入AmpsTets的大肠杆菌细胞。先涂布在 含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出 具Ampr菌落，再将它们涂布于含四环素 的选择性培养基上。插入外源片断的重 组质粒不能在这种培养基上生长。
它的分子量为4363bp。克隆载体的大小不要超 过10kb。 2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的
选择记号。
共有24种核酸内切酶识别位点（单一的）。其中7种 内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识 别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶 切位点插入外源片断可以导致Tetr 基因的失活； 另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因Ampr有单一 的识别位点，
三四章分子克隆载体---答案_完_
三四章分⼦克隆载体---答案_完_第三章分⼦克隆载体（Molecular cloning vectors）⼀、名词解析1.质粒：质粒是染⾊体外的遗传因⼦，能进⾏⾃我复制（但依赖于宿主编码的酶和蛋⽩质）；⼤多数为超螺旋的双链共价闭合环状DNA分⼦（covalently closed circle , cccDNA），少数为线性；⼤⼩⼀般为1～200Kb，有的更⼤。
2.质粒拷贝数：质粒拷贝数(plasmid copy numbers)是指细胞中单⼀质粒的份数同染⾊体数之⽐值,常⽤质粒数/每染⾊体来表⽰。
不同的质粒在宿主细胞中的拷贝数不同。
3.质粒的不相容性：两个质粒在同⼀宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第⼆个质粒导⼊后，在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。
不相容的质粒⼀般都利⽤同⼀复制系统，从⽽导致不能共存于同⼀宿主中。
4.质粒的转移性：质粒具转移性。
它是指在⾃然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作⽤转移到新宿主内。
它需要移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因⼦ bom 及其内部的转移缺⼝位点 nic。
5.穿梭质粒：既能在真核细胞中繁殖⼜能在原核细胞中繁殖的载体。
这类载体必须既有细菌的复制原点或质粒的复制原点，⼜含有真核⽣物的复制原点，还具备酶切位点和合适的筛选指标。
它⽤来转化细菌，⼜可以⽤于转化真核细胞。
6.α-互补：α-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β -galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。
α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补⽽建⽴的7.温和噬菌体：既能进⼊溶菌⽣命周期⼜能进⼊溶源⽣命周期的噬菌体。
8.溶源性细菌：具有⼀套完整的噬菌体基因组的细菌叫溶源性细菌。
9.整合：如果噬菌体的DNA是被包容在寄主细菌染⾊体DNA中，便叫做已整合的噬菌体DNA。
第四章基因克隆的载体、噬菌体载体
溶源周期的主要特征
λ噬菌体的特征： 1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是
转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，
变成原噬菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色
体的一部分进行复制。
烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：
1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
替换式载体
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的， 外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 λEMBL 3/4、 Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列， 包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择 标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体
2.2λ噬菌体载体
溶菌阶段
(复制和释放)
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genomecos ends(cohesive-end site )
5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’
外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解 E.coli，形成空斑。
spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌 中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当置换型载 体的可置换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置换 片段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就 不能正常生长。
基因工程第四章 目的基因的克隆
重组表达质粒
• 比起其它公司的原核表达系列来说Invitrogen有个非常突出的地方就是它 的重组克隆技术。像之前Novagen大部分载体都是用传统的酶切、链接 方式做重组质粒，但是Invitrogen的表达系统大量运用了它的TOPO技术和 Gateway技术。
• 定向TOPO克隆完全不需要酶切和传统连接反应，五分钟就可以做出一个 克隆。以前，用T载最苦恼的问题就是无法定向将PCR片断插入到载体中， 现在Invitrogen已经克服了这个问题。在载体上多加四个碱基GTGG，就 是这四个碱基使它可以与PCR产物定向连接。
平头末端直接与载体连接 平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组
分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段 加装人工接头引入酶切口
cDNA法分离目的基因的基本程序
完备分离程序
提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后借助于合适的筛选手段找 到目的重组子。
筛选时，若使用的是多拷贝载体，则采用菌落原位杂交法筛选；若使用的是表 达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选
目的基因
5‘ 5‘
变性
加热
5‘
退火
5‘
5‘ 聚合
5‘ 5‘
变性
5‘
引物
5‘
5‘
底物
5‘
5‘
‘
5‘
退火 引物
5‘
5‘ 5‘
聚合
5‘
5‘ 退火
5‘
5‘
变性
5‘
5‘
聚合
5‘
5‘
5‘ 5‘
底物
5‘
5‘
引物
5‘
5‘
加热
5‘ 5‘
底物
5‘
克隆载体课件
装到噬菌体颗粒中，以实行对大肠杆菌非常有效的侵染。 噬菌斑的形成：将λ侵染的细胞分布在未被侵染的大肠杆菌菌苔中会形成噬菌斑，是由 于侵染和细胞裂解循环而抑制了细胞生长的区域。 λ溶原体：利用λ噬菌的溶原生长期将克隆基因整合进大肠杆菌基因组，以使其长期表达。 溶原体 样操作双链环状M13NDA，但产生的噬菌体颗粒内仅含有环状ssDNA。 克隆到M13：用标准质粒克隆方法将重组DNA整合到M13载体，重组的M13DNA侵染敏 克隆到 感性大肠杆菌细胞，并形成生长缓慢的噬菌斑，然后从纯培养基中的噬菌体颗粒中分离出 ssDNA。 质粒－ 质粒－M13杂合载体：在辅助噬菌体帮助下，对宿主细胞的侵染，可诱导含有M13复 杂合载体 制起点的质粒形成单链噬菌体颗粒。
连接产物
将目的片段与质粒载体连接时，最常见的非目标产物就是 线性载体片段自身环化所形成的空质粒载体。自环化载体 可通过从转化克隆中小量提取质粒，然后酶解及随后的琼 脂糖凝胶电泳分析的方法来与重组体相区分，但用此法进 行大规模筛选是极不方便的，目前已开发出更有效的、便 于筛选的一系列载体。
双抗生素抗性
λ溶原体
λ 感染的溶原期也被克隆技术所利用。通过 含有目的序列的λ载体的整合作用可将基因或 外原序列整合进大肠杆菌基因组，这种基本 上是永久性的。该方法应用例子之一就是用 T7系统来过量表达蛋白质的菌株。含有Lac 启动子控制下的T7RNA聚合酶基因的菌株 BL21及其衍生物，作为λ溶原菌被命名为 DE3.该基因可被IPTG诱导，然后聚合酶将转 录出表达载体上的目的基因。
已克隆位点
因为在pUC载体上与克隆片段的插入位点相邻处有 一个启动子，很容易想象这样的启动子可用来转录 DNA，无论是在体外产生用作杂交探针的RNA转录 物，还是表达插入片段内基因的蛋白质产物，都不 成问题。 目前已构建了多种 转录型载体，以便开在体外进行 克隆片段的转录。例如，pGEM系列载体中就含有 来自噬菌体T7和SP6的启动子，两启动子间是MCS。 来自噬菌体的启动子只能被各自相应的噬菌体RNA 聚合酶所识别，上述两启动子中的任一种均可用于 体外转录克隆片段 的目的链。
四、基因克隆载体(一)
2、pBR322
p—plasmid，BR分别为该质粒的两位主要构 建者F. Bolivar和R.L. Rodriguez姓氏的头一个字 母，“322”为实验编号。
含有双抗基因（Apr，Tcr）和Col E1复制起始 子。
融合型蛋白表达载体：pET28a
非融合型蛋白表达载体：pKK223-3（强启动子Ptac）
（三）、质粒载体的构建
构建质粒克隆载体的基本策略如下：
① 构建的质粒克隆载体应该是能在转化的受体细胞中进行 有效的复制并且作为质粒克隆载体，希望在受体细胞中 有较多的拷贝数。 * 选择松弛型质粒复制起始子(Ori)
克隆载体(cloning vector)： 指能够把外源DNA片段带入受体细胞，并进
行稳定遗传的DNA或RNA分子
穿梭载体(shuttle vector)： 带有两种不同的复制起始位点，可以在两种
不同的生物体中复制的质粒载体
表达载体(expression vector) 一种克隆载体，可以使插入的外源DNA片段
严紧型质粒(stringent plasmid)：拷贝数少，1－数个， 松弛型质粒(relaxed plasmid) ：拷贝数多，10个以上
（提取质粒时，可添加氯霉素）
4. 质粒的不亲和性(Incompatible):
两种类似的不同质粒不能存在于同一细胞中。 亲和质粒、不亲和质粒
5. 质粒的可转移性：
D） Tra基因：指令宿主细胞合成菌毛（Pilus）和细胞表面物， 促使宿主细胞与受体细胞表面结合，遗传物质的转移
E）抗性基因：抗菌素抗性基因，Apr，Tcr， F） 产毒素基因：大肠杆菌素基因（Col-质粒） G） 降解基因：降解重金属、有机物和农药等 H) 致瘤基因：诱导某些组织形成肿瘤，如Ti质粒，Ri质粒
克隆载体表达载体(课件)PPT课件
组成型表达载体是将基因整合到宿主细胞的染色体上，使基因在任何生长条件下都能稳定表达。这种 表达载体适用于需要持续稳定表达的基因。
组织特异性表达载体
总结词
在特定的组织或器官中，表达载体才能 启动基因的表达。
VS
详细描述
组织特异性表达载体是将基因与特定的组 织或器官相关的调控序列结合，使基因只 在特定的组织或器官中表达。这种表达载 体适用于需要组织特异性表达的基因。
05
克隆载体和表达载体的未来发展
克隆载体和表达载体的新技术和新方法
基因编辑技术
利用CRISPR-Cas9等基因编辑技术，实现对克隆载体和表达载体的精确修饰，提高基 因治疗的效率和安全性。
人工染色体技术
开发人工染色体技术，实现对大型基因组的克隆和表达，为遗传病研究和治疗提供新的 工具。
克隆载体和表达载体的新应用和新领域
04
克隆载体和表达载体的应用
克隆载体在基因工程中的应用
基因克隆
克隆载体可以将目的基因插入到质粒 或病毒载体中，实现基因的复制和扩 增，为基因工程提供大量目的基因。
基因保存
基因突变
通过将目的基因插入到克隆载体中， 进行定点突变或随机突变，研究基因 功能和蛋白质活性。
克隆载体可以保存和传递目的基因， 为基因工程提供长期稳定的基因来源。
01
02
03
基因治疗
利用克隆载体和表达载体， 开发新型基因治疗策略， 针对遗传性疾病、肿瘤等 进行有效治疗。
生物制药
通过克隆载体和表达载体， 实现高效、大规模的蛋白 质药物生产，推动生物制 药产业的发展。
农业育种
利用克隆载体和表达载体， 培育抗逆、抗病、高产的 农作物新品种，提高农业 生产效益。
常用的克隆载体
第一章 概 论 第二章 基因疫苗工作原理 第三章 基因疫苗抗原基因的筛选和克隆 第四章 基因疫苗的构建 第五章 基因疫苗制备第六章 基因疫苗免疫方法 第七章 基因疫苗免疫效果检测 第八章 影响基因疫苗免疫效果的因素第九章 基因疫苗安全性第十章 细菌病基因疫苗第十一章 病毒病基因疫苗第十二章 寄生虫病基因疫苗第十三章 肿瘤基因疫苗第十四章 控制动物生长性能的基因疫苗 四、常用的克隆载体克隆载体就是将目的基因导入宿主细胞进行复制，从而获得大量克隆化片段的运载工具，常用的克隆载体种类很多，主要包括质粒、粘粒和噬菌体等。
其中，质粒是目前应用最为广泛的克隆载体。
下面简要介绍作为克隆质粒的特性和结构。
（一）质粒特性质粒是指在染色体外能够独立复制和稳定遗传的一类环状双链 DNA 分子。
有的质粒处于染色体外的游离状态，可以随着染色体的复制而复制，并且通过细胞分裂传递到子代。
有的质粒在一定条件下能够可逆地整合到寄主染色体上。
质粒的表示常根据 1976 年提出质粒命名原则，用小写字母 p 代表质粒，在 p 字母后面用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或者实验室名称。
例如质粒 pUCl8 ，字母 p 代表质粒， UC 是构建该质粒的研究人员的姓名代号， 18 代表构建的一系列质粒的编号。
质粒广泛地分布于原核生物细胞中，也存在于一些真核细胞中。
质粒相对分子质量范围为10 6 -2 @ 10 8 。
根据质粒在受体细胞内的数量将质粒分为严紧型质粒和松弛型质粒两种类型。
严紧型质粒在每个细胞只有 1 个至几个拷贝；松弛型质粒在每个细胞中有 10-200 个拷贝。
质粒可以分为三种构型，一种是呈现超螺旋的 SC 构型（ scDNA ），一种是开环 DNA（ ocDNA ），另一种是呈线形分子的 L 构型。
质粒 DNA 与一般 DNA 分子的理化性质相似，例如溶于水、不溶于乙醇等有机溶剂、能吸收紫外线、可嵌入溴乙锭染料等。
实验室常利用这些理化特性鉴定和纯化质粒。
4-克隆载体
低分子量的质粒载体， ③低分子量的质粒载体，对同一限制酶具有多重 识别位点的几率相应降低。 识别位点的几率相应降低。
（在一条随机排列的长DNA序列中，假设所含有的4种核 在一条随机排列的长DNA序列中，假设所含有的4 DNA序列中 苷酸都具有相同的频率，那么任何一种组合的4 苷酸都具有相同的频率，那么任何一种组合的4核苷酸的 靶序列，在平均4 256个核苷酸对中 个核苷酸对中， 靶序列，在平均44＝256个核苷酸对中，都有出现一次的 机会，同样的， 核苷酸的靶序列出现的机会是每4 机会，同样的，6核苷酸的靶序列出现的机会是每46＝ 4096一次 所以DNA分子的长短， 一次。 DNA分子的长短 4096一次。所以DNA分子的长短，直接关系到同一个限制 酶的识别序列在其中可能出现的次数）。 酶的识别序列在其中可能出现的次数）。
2、质粒载体的选择记号
在基因克隆中采用的质粒载体的选择记号有很 多种，采用较多的是抗性特征 抗性特征。 多种，采用较多的是抗性特征。 一方面由于许多质粒本身就是带有此类抗性基 另一方面因为抗菌素的抗性特征便于操作， 因，另一方面因为抗菌素的抗性特征便于操作， 易于选择。 易于选择。
3、天然质粒用作克隆载体的局限性
具有若干限制酶单一 若干限制酶单一识别位点 （3）具有若干限制酶单一识别位点
这样的分子结构特性， 这样的分子结构特性，可以满足基因克隆的 需要，并且在其中插入适当大小的外源DNA DNA片段之 需要，并且在其中插入适当大小的外源DNA片段之 应该不影响质粒DNA的复制功能。 DNA的复制功能 后，应该不影响质粒DNA的复制功能。
典型的大肠杆菌表达型质粒载体
必须包括大肠杆菌的启动子及操纵位点序列、 必须包括大肠杆菌的启动子及操纵位点序列、多 启动子 序列 克隆位点（MCS） 转录及翻译信号、 克隆位点（MCS）、转录及翻译信号、质粒载体的 复制起点以及抗菌素的抗性基因。 以及抗菌素的抗性基因 复制起点以及抗菌素的抗性基因。
第四章 基因克隆的质粒载体(共118张PPT)
8.质粒ＤＮＡ的分离与纯化
(1)氯化铯密度梯度离心法 (2)碱变性法
(3)微量碱变性法
氯化铯密度梯度离心法
1、质粒DNA占总DNA的1%～2%；
2、在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子量 的细菌染色体易断裂成线性片段，而质粒 DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的状态 ；
3、染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链的碱 基中，导致链的解旋；而且形成的EB- DNA复
的一个重要特征。
正超螺旋(positive supercoil)
盘绕方向与DNA双螺旋方同相同
负超螺旋(negative supercoil) 盘绕方向与DNA双螺旋方向相反
4. 作为克隆载体质粒的条件
适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必须包括
三种共同的组分： 复制子
选择性标记基因 克隆位点 基因克隆载体还需要满足具有较小的分子量和较高的拷贝数
菌中生存.
2.质粒的生物学特征
只能在在寄主细胞内独立增殖，随寄主分裂而遗传。
自然界中，无论是真核生物还是原核生物细胞，甚至真菌的
线粒体中都发现有质粒的存在。
质粒绝大多数是环形双链的DNA
但也存在有线形质粒 、RNA质粒（酵母的杀伤质粒）
质粒DNA分子可以稳定存在于染色体外，呈游离状态,有一些 质粒在一定条件下能可逆地整合到寄主染色体上，随染色体 的复制而复制,称为附加体。
乎都带有一个来源于pMB1的复制子，可使每个细菌细胞中维持
１５－２０个拷贝。
质粒就其复制方式而言分为两类：
严紧型（stringent plasmid) 每个寄主细胞中仅有１－３份的拷贝。
松弛型（relaxed plasmid) 每个寄主细胞中仅有１０－６０ 份的拷贝。
矿产
矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。
矿产
矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。
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4、发展概况
第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利
用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313 和pBR322 (1977, Bolivar et al)
第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多
克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。
2) ARS型载体：拷贝数较高（约20 copies） 3) 病毒型复制起点：高拷贝
2、属于松弛型复制子(relaxed plasmid) 3、具有复制非必需区 4、有一个或多个单一酶切位点，即多克隆位点
多克隆位点（Multiple cloning site,MCS）： 一段人工合成的DNA序列，其上含有密集排列 的多种单一限制性内切酶位点，以利于不同来 源的外源DNA插入载体。
1、改建质粒的目的 调整质粒结构、提高转化率 2、常用手段： • 减小分子量 • 引入MCS • 引入具有多种用途的辅助序列
3、克隆质粒的发展趋势
向天然质粒中引入选择标记, pSC101 多个质粒重组，增强选择标记,过大,pBR313 减小复制非必需区,缩小分子量,增大容量,pBR322
调整质粒结构，完善载体功能
（一） 一般特性(features)
Plasmid：染色体外能够进行自主复制的遗传单位。 包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖 核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线 菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被 用做基因的载体 • 多为环状双链DNA
• 可自我独立复制
1983年构建：pBR322+M13
基本元件：ori
Ampr
MCS
辅助序列：lacZ’基因 lacI基因
乳糖操纵子(lac Z operon)
•lacZ基因编码-半乳糖苷酶
•lacI基因编码阻遏蛋白,使lacZ不能表达
• 诱导物与阻遏蛋白结合,lacZ表达
乳糖操纵子的表达调控
Regulation of Lac Z expression
第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆
中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6 启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。
9.09kb
单标记、复制效 率低（平均每个 寄主细胞仅有 1~2个拷贝）
双标记，50%以上 的复制非必需区
物理图谱（physical map): 在DNA分子上标 明限制性内切酶位点、 数目、排列顺序及特 征性功能标记的图形。 又称为限制图谱 （restriction map) 载体物理图谱识图要求 1、载体大小 2、载体类型
• 载体DNA两条链的5’端有 一个游离的T：PCR产物 的直接克隆 • SP6、T7启动子：体外转 录、为克隆产物的测序 提供特异性引物 • 插入位点两侧的酶切位 点：为回收克隆片段进 行亚克隆提供便利的酶 切位点
5、pCDNA3----穿梭载体
• 穿梭载体（shuttle vector) 即可以携带外源基因在原核细胞 中复制，又可以使其在真核细胞中表 达的载体。
基因工程的克隆载体
Genetic Cloning Vector
基因工程的基本程序及研究策略
目的基因的制备( donor DNA ) 载体DNA及其改造 (Vector DNA)
③ ① ② ④
体外DNA重组(DNA recombination ) 重组DNA的转化 ( Transformation) 重组体的筛选鉴定与 克隆扩增 ( identification &
• 天然存在：F质粒、R质粒等 • 编码重要遗传信息
• 不相容性
质粒的不相容性：是指在 没有选择压力的情况下， 两种亲源关系密切的不同 质粒，不能够在同一个寄 主细胞系中稳定地共存的 现象。 质粒的不相容性分子 基础，主要是由于它 们在复制功能之间的 相互干扰造成的。
（二）分类(classification)
• 拷贝数高(10-200 copies/cell)
• 复制仅需DNA聚合酶I，不需蛋白质合成
• 宿主细胞蛋白质合成及染色体复制停止时，可 大量扩增至上千份（氯霉素）
构型：
• 超螺旋型（supercoiled circle,SC) or 共价闭 环双股DNA( covalently closed circle,CCC) • 开环型（opened circle,OC） • 线形（linear circle,LC)
-半乳糖苷酶
X-gal变兰色
pUC载体蓝白斑筛选的原理----插入失活2
pUC载体(含lacZ’、lacI基因）
外源基因插入 lacZ’失活 不产生-半乳糖苷酶N端 片段（-肽）
X-gal不变色，呈白色
• 3、 pGEM系列
pGEM-1—MCS两侧有SP6、T7RNA聚合酶启 动子
pGEM-1—MCS两侧有SP6、T7RNA 聚合酶启动子 1、可进行体外转录 • 转录具有特异性 • 可分别转录插入片段的两条链 • 转录产物可制备体外翻译的模板、探 针及反义RNA 2、为插入片段的测序提供特异引物位点
pUC载体蓝白斑筛选的原理----插入失活1
how to select positive clone using a vector with LacZ
pUC载体(含lacZ’、lacI基因）
诱导物(IPTG)
lacZ’表达 -半乳糖苷酶N 端片段（-肽） 宿主细胞lacZM15 缺陷型-半乳糖苷酶
同种生物复制起点混合—质粒形式存在；质粒或病毒形式存在
不同生物复制起点混合—穿梭载体（shuttle vector）两种生 物中均以质粒形式存在；在一种生物中以质粒形式存在，在另
一种生物中以质粒或病毒形式存在
复制起点种类与拷贝数间的关系 1) 质粒复制起点类型：
• 低拷贝（严紧型，1-2 copies，受宿主染色 体基因控制） • 高拷贝（松弛型，>20 copies，受宿主染色 体控制较弱）
• • • • • 质粒（plasmid) 噬菌体（bacteriophage ) 粘粒（cosmid） M13噬菌体（bateriophage M13） 人工染色体(artificial chromosome)
第二节 常用克隆载体介绍 Several cloning vectors
一、质粒（plasmid)
3、载体组成
物理图谱（physical map)
4、载体主要元件（特点） 及其应用
（五）常见人工构建质粒的分类:
according to their functions,plasmids can be classified into: 人工构建的质粒根据其功能及用途分为: 1.多拷贝质粒 复制子经过人工突变，除去控制拷贝数 负调节基因，使质粒拷贝数达到每个细胞数千，用于 扩增外源基因。 2.测序质粒sequencing plasmid
小
结(conclusions)
质粒的发展趋势： 调整质粒结构、提高载体效率：减小分子 量、引入MCS 引入多种用途的辅助序列: • lacZ’、lacI基因：蓝白斑筛选 • SP6、T7RNA聚合酶启动子：体外转录 • F1复制起始点：产生单链DNA • 真核启动子：穿梭载体
二、 噬菌体载体 Bacteriolphage
第一节 概述introduction
一、概念 克隆载体（cloning vector)：用于携带 目的基因（外源基因）进入受体细胞 进行复制、扩增的工具。
二、特点
(vectors which are used in genetic engineering should:)
1、能独立复制，具有复制子（replican)
（一）λ噬菌体的分子生物学
biological features of bacterophage 1、λ噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和 λ-DNA组成 2、λ-DNA： • 线状双链DNA分子，全长48.5kb • 两端各有一个12核苷酸的互补单链（粘性末端， GGGCGGCGACCT, CCCGCCGCTGGA，称为 Cos位点 （cohesive end）或cos区。 • 功能相近的基因在基因组中聚集在 一起。
• 载体(vector)：携带外源DNA进入宿主细胞的 工具 • 载体的功能 1.运送外源基因高效转入受体细胞 2.为外源基因提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供条件
载体的两种扩增方式---自主复制型载体 和附加载体
克隆载体（cloning vector)
• 定义(definition) • 特点(features) • 常用载体介绍(several vectors)
大小：小型质粒(15kb )
大型质粒(60kb) 功能：F质粒、R质粒 宿主：窄宿主范围质粒：ori特异，仅能在一 种宿主中复制
宽宿主范围质粒：ori不特异，可在多 种宿主中复制
复制类型：
严紧型质粒：
• 复制受宿主细胞的严格控制 • 低拷贝数（1-2copies/cell)
松弛型质粒：
pGEM-3/4Z----MCS位于lacZ’基因内部
•插入失活—蓝白斑筛选
•具有SP6、T7启动子
pGEM-3Zf(+)/(-)----引入丝状噬菌体f1(+)/(-) 复制起始点
• 可以产生单链DNA，并 分泌至上清中，便于对 插入片段进行测序 • F1的方向(+/-)决定复制 哪一条链
4、 T-vector—用于PCR产物的直接克隆
⑤
⑥
clone amplification)
目的DNA在受体细胞中的 表达(gene expression)
基因工程的目的
• 基因克隆-----获得目的基因 • 基因表达-----使受体的新性状表现，获得 大量目的蛋白 In vivo expression In vitro expression