TaNAC提高转基因烟草的抗旱功能

生物技术

TaNAC提高转基因烟草的抗旱功能

刘美英1,2,冶晓芳2,唐益苗2,高世庆2,张 朝1,2,赵昌平2,陈学平1

1中国科学技术大学研究生院,化学系,合肥市金寨路96号230026;

2北京市农林科学院,杂交小麦工程技术研究中心,北京市海淀区西郊板井曙光花园中路9号100097

摘 要:NAC(NAM ATAF CUC)转录因子在植物逆境胁迫应答反应中发挥重要作用。通过同源克隆的方法从小麦中分离得到一个编码NAC转录因子的基因 T a NAC,该基因编码的蛋白序列结构特殊,N端为保守性差的NAC保守域,只包含A,B,D3个亚结构域,进化关系上与DREB家族更近,其C端共同享有多个基序。实时荧光定量PCR实验证实TaNAC基因受干旱诱导24h后强烈表达。将该基因构建到PBI121双元植物表达载体的35S启动子下游,通过农杆菌介导的叶盘转化法转入烟草,获得T1代转基因苗。模拟干旱胁迫处理实验表明,过量表达Ta NAC的转基因烟草表现出明显优于野生型对照的抗旱功能,说明Ta NAC基因的过量表达能够提高烟草抗旱能力,T a NAC可以作为烟草抗旱育种的优良候选基因资源。

关键词:NAC;转录因子;系统进化树;干旱胁迫;转基因烟草

doi:10 3969/j.issn.1004 5708 2010 06 016

中图分类号:S572 032 文献标识码:A 文章编号:1004 5708(2010)06 0082 07

Effects of Ta NAC on drought resistance in transgenic tobaccos

LIU Mei ying1,2,YE Xiao fang2,TANG Yi miao2,GAO Shi qing2,Z HANG Zhao1,2,

Z HAO Chang ping2,C HEN Xue ping1

1Department of Chemistry,Graduate School of University of Science and Technology of China,Hefei230026,China;

2Beijing Engineering and Technique Research Center of Hybrid Wheat,Beijing Acade my of Agricultural

and Forestry Science,Beijing100097,C hina

Abstract:NAC(NAM ATAF C UC)transcription factors play important roles in various stress response.In this study,one NAC gene named TaNAC encoding a NAC protein in wheat(Triticum aestivum L.)was identified.The putative TaNAC pro tein structure was special.The N terminal DNA binding domain consisted of only three subdomains(A,B,D),while the C terminal was similar to the DREB protein,sharing several motifs.Real time PCR confirmed that TaNAC was strongly induced after24h under drought treatment.Ta NAC was constructed into PBI121by c onnection with35S promoter;transgenic seedlings were obtained by Agrobacterium mediated genetic transformation paring to wild types,overexpression of TaNAC gene showed significant drought resistance in transgenic tobaccos.It also indicated that TaNAC was excellent candi date for plant drought breeding.

Key words:NAC;transcription factor;phylogenetic tree;drought;transgenic tobacco

作者简介:刘美英,女,硕士,主要研究方向:作物遗传育种,E mail: liumy@mai

陈学平(通讯作者),男,博士,副教授,主要研究方向为作物

遗传育种,E mail:chenxp08@us

基金项目:国家转基因生物新品种培育重大专项(2008ZX08002 002, 2008ZX08002 003,2008ZX08002 004)

收稿日期:2010 06 02 NAC(NAM ATAF C UC)转录因子是近十几年来新发现的具有多种生物功能的植物特异转录调控因子。Aida等首先报道了NAC结构域,发现矮牵牛NAM 基因和拟南芥ATAF1/2和C UC2基因编码蛋白的N端均包含一段保守的氨基酸序列,取其首字母命名为NAC[1]。第1个NAC转录因子由Souer等从矮牵牛中克隆得到[2],随后在拟南芥、水稻、小麦、大豆等物种中

相继发现,目前在拟南芥和水稻中分别存在106和149个NAC成员[3 4]。研究表明,NAC转录因子在顶端分生组织和花器官发育[1 2,5 6]、植物侧根发育[7 9]、叶片凋亡[10]、作物品质[11 12]、次生壁形成[13 14]和木质部形成等生长调节过程[15],以及抵御多种生物和非生物胁迫过程中均发挥重要作用。

NAC受多种生物胁迫和非生物胁迫的诱导表达。目前,已经从多种植物中分离鉴定得到与抗逆相关的NAC转录因子。Tran等采用酵母单杂技术从拟南芥中分离到3个NAC基因ANACO19,ANAC055,ANAC072,它们的表达受干旱、高盐和AB A的诱导,过量表达3个基因中的任何一个都可以增强植株的耐旱能力[16]。水稻抗旱耐盐基因SNAC1,其主要在气孔的保卫细胞中被诱导表达,当植株受到干旱胁迫时,基因的表达促进气孔关闭,但是不影响光合速率,因而抗旱性大为提高。在生殖生长期遭遇严重干旱的情况下,过量表达SNAC1的转基因植株结实率较对照提高22%~ 34%[17];ATAF1是最早发现的NAC转录因子之一,其功能一直未知,Lu等证实了ATAF1为干旱诱导型基因,它的表达受干旱胁迫和AB A处理的诱导,而在水处理下受到抑制。敲除该基因的突变体ataf1,在干旱胁迫后的恢复反应测试中,恢复率是正常对照的7倍,同时,已知的干旱诱导型基因(RD17、ERD10、KIN1、RD22、COR78和LT178)表达水平提高,这些结果说明ATAF1基因作为负调控转录因子,通过下调抗逆相关基因的表达在胁迫反应中起作用[18]。水稻Os NAC6的表达不但受到干旱、低温、高盐等非生物胁迫的诱导,还受机械损伤和稻瘟病的诱导,过量表达该基因的水稻提高了对干旱,高盐及稻瘟病的耐受力,但是表现出生长阻滞和低产[19]。Oh等从辣椒中分离到NAC类转录因子基因CaNAC1,该基因受病原菌快速特异诱导,同时受外源水杨酸和乙烯的强烈诱导表达[20]。Delessert等发现拟南芥转录因子ATAF2在叶片损伤部位高表达,并对损伤植物中的激素甲基茉莉酮酸和水杨酸诱导作出响应,超量表达ATAF2的转基因植株对土生镰刀霉菌敏感性增强,说明ATAF2作为病原相关蛋白的负调控子在防御反应中起作用[21]。Selth等证实在复制增强子的作用下,番茄缩叶病毒诱导SINAC1在染毒细胞中特异表达,过量表达SINAC1导致TLC V 病毒DNA大量积累,说明SINAC1在复制增强子增强的TLCV复制中起重要作用[22]。在白粉病毒注射过程中,Jensen等对大麦HvNAC6进行基因沉默的研究证明,大麦表皮细胞形成对白粉病毒性细胞的渗透抵抗,另外研究证实该基因的同源基因ATAF1也可以被白粉病毒诱导[23]。

DREB转录因子属于AP2/EREBP转录因子家族,它能与核心序列为5 CCGAC 3 的脱水响应元件(DRE,dehydration responsive element)或者类似DRE的序列CR T结合,参与干旱、高盐等胁迫应答反应,在逆境胁迫调控中起重要作用[24 25]。

本研究从小麦中克隆得到1个NAC转录因子基因 TaNAC,通过在烟草中过量表达TaNAC基因研究了该转录因子抵御干旱胁迫的能力,为烟草育种提供了参考。

1 材料与方法

1 1 材料

小麦京冬17(Triticum aestivum L.)为北京杂交小麦工程技术研究中心培育的冬小麦抗旱品种,根癌农杆菌C58C1,烟草(Nicotiana tabacum L.)W38本实验室保存。

1 2 样品处理

将25 光照培养2周左右的小麦 京冬17 植株进行干旱、高盐、低温胁迫处理,具体步骤如下:干旱处理:将小麦幼苗整个植株从盆中移出,用蒸馏水将根部泥土冲洗干净,滤纸吸净根部水分后,植株置于滤纸上进行快速干旱胁迫处理;高盐处理:将小麦幼苗置于200mmol/L NaCl溶液中,室温;低温处理:将小麦幼苗置于4 培养箱中,以上胁迫反应分别在处理0h、l h、2h、5h、10h、24h后取样,迅迅速置于液氮速冻, 80 保存备用。

1 3 TaNAC基因的克隆

根据北京天根生化科技有限公司提供的方法完成植物叶片组织的总RNA提取,之后以提取的总RNA 为模板,以AP(5 GGC CAC GCG TC G ACT AGT AC TTTTTTTTTTTTTTTTTT 3 )序列为引物、用Revere Tran scriptase(M MLV)进行反转录,得到用于后续实验的cDNA模板。同时,以水稻NAC家族基因为参照序列,利用同源克隆的方法设计引物TaNAC F:5 TCC CCC GGG ACC ATG GAA GGG CTC GAC GTC 3 ;TaNAC R: 5 TCC GAG C TC TTA ATG GAC ACT TGC AGA CGA 3 。以混合cDNA为模板(得到每1种处理材料的cD