TaNAC提高转基因烟草的抗旱功能

生物技术
TaNAC提高转基因烟草的抗旱功能
刘美英1,2,冶晓芳2,唐益苗2,高世庆2,张 朝1,2,赵昌平2,陈学平1
1中国科学技术大学研究生院,化学系,合肥市金寨路96号230026;
2北京市农林科学院,杂交小麦工程技术研究中心,北京市海淀区西郊板井曙光花园中路9号100097
摘 要:NAC(NAM ATAF CUC)转录因子在植物逆境胁迫应答反应中发挥重要作用。

通过同源克隆的方法从小麦中分离得到一个编码NAC转录因子的基因 T a NAC,该基因编码的蛋白序列结构特殊,N端为保守性差的NAC保守域,只包含A,B,D3个亚结构域,进化关系上与DREB家族更近,其C端共同享有多个基序。

实时荧光定量PCR实验证实TaNAC基因受干旱诱导24h后强烈表达。

将该基因构建到PBI121双元植物表达载体的35S启动子下游,通过农杆菌介导的叶盘转化法转入烟草,获得T1代转基因苗。

模拟干旱胁迫处理实验表明,过量表达Ta NAC的转基因烟草表现出明显优于野生型对照的抗旱功能,说明Ta NAC基因的过量表达能够提高烟草抗旱能力,T a NAC可以作为烟草抗旱育种的优良候选基因资源。

关键词:NAC;转录因子;系统进化树;干旱胁迫;转基因烟草
doi:10 3969/j.issn.1004 5708 2010 06 016
中图分类号:S572 032 文献标识码:A 文章编号:1004 5708(2010)06 0082 07
Effects of Ta NAC on drought resistance in transgenic tobaccos
LIU Mei ying1,2,YE Xiao fang2,TANG Yi miao2,GAO Shi qing2,Z HANG Zhao1,2,
Z HAO Chang ping2,C HEN Xue ping1
1Department of Chemistry,Graduate School of University of Science and Technology of China,Hefei230026,China;
2Beijing Engineering and Technique Research Center of Hybrid Wheat,Beijing Acade my of Agricultural
and Forestry Science,Beijing100097,C hina
Abstract:NAC(NAM ATAF C UC)transcription factors play important roles in various stress response.In this study,one NAC gene named TaNAC encoding a NAC protein in wheat(Triticum aestivum L.)was identified.The putative TaNAC pro tein structure was special.The N terminal DNA binding domain consisted of only three subdomains(A,B,D),while the C terminal was similar to the DREB protein,sharing several motifs.Real time PCR confirmed that TaNAC was strongly induced after24h under drought treatment.Ta NAC was constructed into PBI121by c onnection with35S promoter;transgenic seedlings were obtained by Agrobacterium mediated genetic transformation paring to wild types,overexpression of TaNAC gene showed significant drought resistance in transgenic tobaccos.It also indicated that TaNAC was excellent candi date for plant drought breeding.
Key words:NAC;transcription factor;phylogenetic tree;drought;transgenic tobacco
作者简介:刘美英,女,硕士,主要研究方向:作物遗传育种,E mail: liumy@mai
陈学平(通讯作者),男,博士,副教授,主要研究方向为作物
遗传育种,E mail:chenxp08@us
基金项目:国家转基因生物新品种培育重大专项(2008ZX08002 002, 2008ZX08002 003,2008ZX08002 004)
收稿日期:2010 06 02 NAC(NAM ATAF C UC)转录因子是近十几年来新发现的具有多种生物功能的植物特异转录调控因子。

Aida等首先报道了NAC结构域,发现矮牵牛NAM 基因和拟南芥ATAF1/2和C UC2基因编码蛋白的N端均包含一段保守的氨基酸序列,取其首字母命名为NAC[1]。

第1个NAC转录因子由Souer等从矮牵牛中克隆得到[2],随后在拟南芥、水稻、小麦、大豆等物种中
相继发现,目前在拟南芥和水稻中分别存在106和149个NAC成员[3 4]。

研究表明,NAC转录因子在顶端分生组织和花器官发育[1 2,5 6]、植物侧根发育[7 9]、叶片凋亡[10]、作物品质[11 12]、次生壁形成[13 14]和木质部形成等生长调节过程[15],以及抵御多种生物和非生物胁迫过程中均发挥重要作用。

NAC受多种生物胁迫和非生物胁迫的诱导表达。

目前,已经从多种植物中分离鉴定得到与抗逆相关的NAC转录因子。

Tran等采用酵母单杂技术从拟南芥中分离到3个NAC基因ANACO19,ANAC055,ANAC072,它们的表达受干旱、高盐和AB A的诱导,过量表达3个基因中的任何一个都可以增强植株的耐旱能力[16]。

水稻抗旱耐盐基因SNAC1,其主要在气孔的保卫细胞中被诱导表达,当植株受到干旱胁迫时,基因的表达促进气孔关闭,但是不影响光合速率,因而抗旱性大为提高。

在生殖生长期遭遇严重干旱的情况下,过量表达SNAC1的转基因植株结实率较对照提高22%~ 34%[17];ATAF1是最早发现的NAC转录因子之一,其功能一直未知,Lu等证实了ATAF1为干旱诱导型基因,它的表达受干旱胁迫和AB A处理的诱导,而在水处理下受到抑制。

敲除该基因的突变体ataf1,在干旱胁迫后的恢复反应测试中,恢复率是正常对照的7倍,同时,已知的干旱诱导型基因(RD17、ERD10、KIN1、RD22、COR78和LT178)表达水平提高,这些结果说明ATAF1基因作为负调控转录因子,通过下调抗逆相关基因的表达在胁迫反应中起作用[18]。

水稻Os NAC6的表达不但受到干旱、低温、高盐等非生物胁迫的诱导,还受机械损伤和稻瘟病的诱导,过量表达该基因的水稻提高了对干旱,高盐及稻瘟病的耐受力,但是表现出生长阻滞和低产[19]。

Oh等从辣椒中分离到NAC类转录因子基因CaNAC1,该基因受病原菌快速特异诱导,同时受外源水杨酸和乙烯的强烈诱导表达[20]。

Delessert等发现拟南芥转录因子ATAF2在叶片损伤部位高表达,并对损伤植物中的激素甲基茉莉酮酸和水杨酸诱导作出响应,超量表达ATAF2的转基因植株对土生镰刀霉菌敏感性增强,说明ATAF2作为病原相关蛋白的负调控子在防御反应中起作用[21]。

Selth等证实在复制增强子的作用下,番茄缩叶病毒诱导SINAC1在染毒细胞中特异表达,过量表达SINAC1导致TLC V 病毒DNA大量积累,说明SINAC1在复制增强子增强的TLCV复制中起重要作用[22]。

在白粉病毒注射过程中,Jensen等对大麦HvNAC6进行基因沉默的研究证明,大麦表皮细胞形成对白粉病毒性细胞的渗透抵抗,另外研究证实该基因的同源基因ATAF1也可以被白粉病毒诱导[23]。

DREB转录因子属于AP2/EREBP转录因子家族,它能与核心序列为5 CCGAC 3 的脱水响应元件(DRE,dehydration responsive element)或者类似DRE的序列CR T结合,参与干旱、高盐等胁迫应答反应,在逆境胁迫调控中起重要作用[24 25]。

本研究从小麦中克隆得到1个NAC转录因子基因 TaNAC,通过在烟草中过量表达TaNAC基因研究了该转录因子抵御干旱胁迫的能力,为烟草育种提供了参考。

1 材料与方法
1 1 材料
小麦京冬17(Triticum aestivum L.)为北京杂交小麦工程技术研究中心培育的冬小麦抗旱品种,根癌农杆菌C58C1,烟草(Nicotiana tabacum L.)W38本实验室保存。

1 2 样品处理
将25 光照培养2周左右的小麦 京冬17 植株进行干旱、高盐、低温胁迫处理,具体步骤如下:干旱处理:将小麦幼苗整个植株从盆中移出,用蒸馏水将根部泥土冲洗干净,滤纸吸净根部水分后,植株置于滤纸上进行快速干旱胁迫处理;高盐处理:将小麦幼苗置于200mmol/L NaCl溶液中,室温;低温处理:将小麦幼苗置于4 培养箱中,以上胁迫反应分别在处理0h、l h、2h、5h、10h、24h后取样,迅迅速置于液氮速冻, 80 保存备用。

1 3 TaNAC基因的克隆
根据北京天根生化科技有限公司提供的方法完成植物叶片组织的总RNA提取,之后以提取的总RNA 为模板,以AP(5 GGC CAC GCG TC G ACT AGT AC TTTTTTTTTTTTTTTTTT 3 )序列为引物、用Revere Tran scriptase(M MLV)进行反转录,得到用于后续实验的cDNA模板。

同时,以水稻NAC家族基因为参照序列,利用同源克隆的方法设计引物TaNAC F:5 TCC CCC GGG ACC ATG GAA GGG CTC GAC GTC 3 ;TaNAC R: 5 TCC GAG C TC TTA ATG GAC ACT TGC AGA CGA 3 。

以混合cDNA为模板(得到每1种处理材料的cD
NA,将每个cDNA样品取出一部分,组成各种处理材料的混合c DNA模板),以Ta NAC F/R为引物,进行RT PC R反应,扩增程序:94 预变性5min,94 变性30s, 62 退火45s,72 延伸1min,共32个循环,之后72 10min。

1 4 构建系统进化树与基序分析
使用DNAMAN软件将测序成功的核苷酸序列翻译为蛋白序列,进化树分析之前,NCBI BLAST搜集TaNAC的近缘序列,包括DREB家族及NAC家族的几个基因,整理得到这些序列开放阅读框(ORF)的FAS TA文件,在ME GA4 0中生成进化树,主要参数设置为:邻近法建树,拔靴法(重复计算次数1000;随机种子64238),成对缺失,泊松修正[26]。

将TaNAC同几个NAC家族的序列提交到The ME ME suite tool(http:// /meme4_4_0/cgi bin/meme.cgi),主要分析其N端序列,将Ta NAC同DREB家族的几个序列同样提交到该网站,主要分析其C端序列。

本实验中用于进化树分析和基序分析的蛋白序列GeneBank登录号如下:Wheat Ta NAC2(AY625683),TaNAC4 (HM027572),TaNAC6(HM027573),TaDREB4B (AAX13283),TaDREB4A(AAX13282);rice SNAC1 (DQ394702),OsNAC4(AB028183),ONAC300 (AB182278);Leymus chinensis unna med(AC H73204); Aegilops columnaris DRF1(ACX94335)。

1 5 TaNAC干旱、高盐逆境胁迫下的基因表达
利用步骤1 2中反转录得到的干旱、高盐胁迫处理的cDNA模板,实验研究了TaNAC基因在这两种非生物胁迫条件下的表达情况。

选用wheat actin (GeneBank登录号AB181991)作为本实验的内参基因,内参基因扩增引物actin F:5 CGG C TA CCA C AT CC A AGG AA 3 ;actin R:5 GC T GGA ATT ACC GCG GCT 3 。

从目的基因的非保守序列部分设计引物,控制扩增片段长度尽量接近内参基因长度,目的基因扩增引物序列Ta NAC F1:5 AGG ACC AC T TG T TCA AAC CG 3 ,TaNAC R1:5 CCA GC A TGA AGA TTG TCC C T 3 。

本实验环节PC R扩增程序:95 预变性15min,95 20s,60 20s,72 20s,共40个循环,72 10min。

实时定量RT PCR完成后,采用2 C T算法[27]分析实验结果(公式如下),其中C T.Targ e t和C T.Ac t i n分别是目标基因和内参基因的C T值;Timex指处理的不同时间点(胁迫处理1h、2h、5h、10h、24h),Time0表示经actin 校正后1倍量的目标基因未处理时的表达量。

C T=(C T.Targ e t-C T.Actin)T i mex-(C T.Target-
C T.Actin)Time0
1 6 转基因烟草抗旱功能验证
将TaNAC基因连接到PBI121双元植物表达载体的35S启动子下游,构建过量表达载体,并通过根癌农杆菌C58C1介导的烟草叶盘转化法转化到烟草W38株系中。

待PC R检测为阳性的转基因烟草植株生长到一定高度后移栽至花盆,24 ,16h光照培养,5个月左右收获种子,之后进行模拟干旱胁迫处理,经消毒处理的种子播种到含2%PEG的MS培养基中,观察转基因苗和野生型对照的生长情况。

2 结果与分析
2 1 TaNAC基因的克隆
本实验以小麦胁迫处理材料的混合cDNA为模板,利用同源克隆的方法分离得到1个NAC转录因子家族的基因,其核苷酸序列及编码的氨基酸序列如图1,Ta NAC ORF长度1445bp,编码485个氨基酸,Scan Prosite(/tools/scanprosite/)输出的NAC保守域在图中用灰色背景标示。

2 2 进化树生成与基序分析
TaNAC与NAC及DREB转录因子的系统进化关系如图2,图中显示,TaNAC与DREB进化关系更近,这个结果与NCBI B LAST查询一致,均说明我们所分离的基因的特殊性,该基因与所有的已知序列相似性都很低,它具有NAC转录因子的保守结构域,而从进化关系上看来,又具有DREB家族的特征,进一步的序列基序分析发现,TaNAC与NAC家族的其他转录因子相比,保守域序列的保守性较差,其亚结构域并非典型的A,B,C,D,E5个亚结构域[28],而只包含A,B,D3个亚结构域(图中的motif1,2,3,4,5分别对应亚结构域B,D,A,E,C),且保守性也较差(如图3A)。

对TaNAC与部分DREB家族的蛋白序列基序分析表明, TaNAC与DREB家族的某些基因相似性更近,这些序列的C端至少共享4种以上基序(motif1,5,6,10),如图3B所示。

图1 T aNAC
基因核苷酸序列及编码的蛋白序列
图2 Ta NAC 与已知序列的系统进化树分析
注:底部图标表示the relati ve di vergence of the sequences,节点上的数字代表boots trap 值,实验分离的TaNAC 基因用实心三角标示。

2 3 TaNAC 受干旱诱导强烈表达
TaNAC 在干旱、高盐胁迫处理下基因表达趋势分
别见图4A,图4B 。

干旱诱导下,处理24h 后TaNAC 基因强烈表达;NaCl 诱导下,处理1h 后转录水平表达积累至峰值,而后慢慢恢复至原始水平。

2 4 转基因烟草抗旱功能鉴定
图5是T0代阳性植株收获的种子在含2%PEG 的MS 培养基上的生长状况,左图,种子萌发后2周的生长情况,平板左半边是转基因株系,右半边为野生型对照,转基因烟草在培养基上生长良好,而野生型对照发芽率及植株高度均受到PEG 抑制。

右图,种子萌发后1个月生长状况,平板的左半边是野生型对照,右半
边是转基因苗,受PEG 影响,两者叶片均出现一定程度的卷曲,转基因苗较对照苗植株高度更高,且根的长度更长。

以上实验结果均说明过量表达TaNAC 的转基因烟草提高了植株的抗旱功能。

图3 TaNAC蛋白序列基序分析
注:图中第1列为基因名称,第2列为基序结合p value值,第3列代表不同基序在整个氨基酸序列中所处的位置,图下面不同颜色小方块代表不
同的基序,上下两个图中相同的颜色指代不同的基序。

注:图中横坐标代表胁迫处理时间,纵坐标代表基因相对表达量
图5 T1代小苗2%PEG胁迫处理生长情况
3 讨论
本研究利用同源克隆的方法从小麦中克隆到1个基因TaNAC,该基因编码的蛋白序列结构非常特殊,其N端为保守性差的NAC结构域,仅包含A,B,D3个亚结构域,C端序列与DREB家族转录因子相似性很高,且在进化关系上两者更近。

干旱和高盐胁迫处理表达实验确认TaNAC基因受干旱诱导强烈表达,对高盐处理敏感。

构建该基因的过量表达载体并通过农杆菌介导的叶盘转化法将TaNAC转入烟草,PEG胁迫处理实验表明转Ta NAC基因烟草具有抗旱性,证明了TaNAC基因在烟草中成功表达,且提高了烟草的抗旱能力,可以作为烟草抗旱育种的优质候选基因。

TaNAC与已知的NAC转录因子同源性很低,同胁迫相关NAC转录因子的同源性也很低,从结构和进化关系看来,TaNAC所具有的抵御干旱胁迫的功能可能不是由NAC家族的共有结构特征决定的,其C端序列与DREB家族转录因子具有高度相似性,而DREB家族基因主要功能就是参与逆境胁迫应答,本实验所分离的TaNAC转录因子的功能是由N端的保守域决定,或是C端结构决定还需要更进一步的研究,这一工作将为研究植物转录因子提供新的思路。

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2010年度 中国烟草学报 引证数据
中国科技信息研究所 万方数据 发布的 2010年版中国期刊引证报告 显示: 中国烟草学报 各项评价指标保持较高水平(见表1),其中,主要学术影响力指标 总被引频次、影响因子、他引率、基金论文比等,较2009年度有所提高,影响因子达到1 195(中国境内6063种科技期刊影响因子 1的期刊共380种),比2009年提高0 223,比同期国内6063种科技期刊影响因子平均值0 422(见表2)高0 773, 学报 在 轻工纺织食品类 (56种期刊)学科中影响因子位列第一;总被引频次910次,比2009年提高了177次,比同期科技期刊平均值756次高154次,基金论文比0 650,比2009年提高了0 09,比同期科技期刊平均值0 300高0 350。

中国期刊引证报告 在与国际评价体系保持一致基础上,结合中国期刊实际情况,选择总被引频次、影响因子等18项计量指标,主要显示该期刊被读者使用和重视程度,以及在学术交流中的地位和作用,是评价期刊质量优劣的客观标准。

表1 2010年版 中国烟草学报 引证数据
文献被引指标
年度
总被
引频次
影响
因子
即年
指标
他引率
引用
期刊数
学科
扩散指标
学科
影响指标
被引
半衰期
H指数
20097330 9720 0830 ******* 0812 3395 8658 20109101 1950 0900 9101890 1603 3806 3108增加值1770 2230 0070 038440 0791 0410 4450文献来源指标
年度
来源
文献量
文献
选出率
平均
引文数
平均
作者数
地区
分布数
机构
分布数
海外
论文比
基金
论文比
引用
半衰期
2009840 93314 814 91716440 0240 5607 590 20101000 95016 064 73017510 0000 6507 480增加值160 0201 26-0 18717-0 0240 09-0 110
表2 中国期刊主要计量指标平均值统计(6063种期刊)
指标平均值统计数字
总被引频次756次/刊 1000次以上的期刊为1281种
影响因子0 422 1的期刊共380种
即年指标0 061441种期刊为0 000
基金论文比0 300524种期刊无基金论文
海外论文比0 013 0 2的期刊共70种(英文版55
种)3346种期刊无海外论文
中国学术期刊 中国知网 数据库发布的科技期刊
统计报告显示: 中国烟草学报 各项引证数据较2009
年版有较大提高,总被引频次1947次,影响因子为
1 847,学科排名第一,Web(是管理并与其他网页进行
联系的网络服务平台)下载量2 57万次。

2010年度 中国知网 引证数据高于 万方数据
发布的相关数据,原因是 中国知网 的统计源中新增
了博士和硕士论文对本刊的引用。