烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生

烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生

时光（200113813） 刘超（200113821）

（01生物技术(2)班）

摘要: 植物组织培养是指在无菌的条件下，分离并在培养基中培养离体植物组织、器官或细胞的技术[1]。包括：器官培养，花药和花粉培养，组织培养，胚胎培养细胞培养，原生质体培养。其培养基是由无机营养物、碳源、维生素、生长调节剂和有机附加物等五类物质。激素是植物组织培养的关键因素, 离体培养物的根芽分化取决于生长素/细胞分裂素的比值。另外，光照还影响到愈伤组织细胞之间的结合的紧密度和愈伤组织的色泽，以及再生植株的颜色,对芽的分化有显著性的影响。（摘要应概括论文试验主要结果）

关键词: 烟草，愈伤组织，诱导，植株再生

1．前言

细胞是生物体的结构单位和功能单位。细胞工程就是利用细胞的全能性，采用组织与细胞培养技术对动、植物进行修饰，为人类提供优良品种、产品和保存珍贵物种[2]。细胞工程主要包括体细胞融合，核移植，细胞器摄取和染色体片段的重组等。

植物组织培养是植物细胞工程中研究得比较早、也比较成熟的技术。试管苗的快速繁殖、无病毒植物的培育等研究成果已经处在应用、推广阶段[3]。

离体的植物器官、组织或细胞，在培养了一段时间以后，会通过细胞分裂，形成愈伤组织。愈伤组织的细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化，或者叫做去分化。脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做再分化[4]。再分化形成的试管苗，移栽到地里，可以发育成完整的植物体。植物组织培养的过程可以简要归纳为：

影响植物细胞脱分化产生愈伤组织的一个重要因素是植物激素。当细胞分裂素与生长素共同使用时，能强烈地刺激愈伤组织的形成。植物激素还会影响到再分化过程中芽和根的发生。早在20世纪50年代初，我国植物生理学家崔徵等人就发现细胞分裂素与生长素之间的浓度比，可以调控植物组织培养过程中芽和根的形成[5]。当细胞分裂素与生长素的浓度比高时，有利于芽的发生；当浓度比低时，则有利于根的发生。

植物细胞只有脱离了植物体，在一定的外部因素作用下，经过细胞分裂形成愈伤组织，才表现出全能性，由愈伤组织细胞发育、分化出新的植物体[6]。

植物组织培养技术的应用范围是很广的，除了必修课中介绍过的快速繁殖、培育无病毒植物外，还可以通过大规模的植物细胞培养来生产药物、食品添加剂、香料、色素和杀虫剂等。例如，从大量培养的紫草愈伤组织中提取的紫草素，是制

造治疗烫伤和割伤的药物以及染料和化妆品的原料。用植物组织培养的方法，诱导离体的植物组织形成具有生根发芽能力的胚状结构，包裹上人造种皮，制成人工种子，可以解决有些作物品种繁殖能力差、结子困难或发芽率低等问题。此外，转基因植物的培育，也要用到植物组织培养的方法[7]。

本次实验得目的就在于掌握无菌超作技术;基本掌握职务愈伤组织诱导培养技术和调控条件;同时观察和分析不同光照条件形成的愈伤组织对器官分化的影响,观察和分析愈伤诱导和器官分化的激素使用差异。了解器官分化和植株再生的过程。

2．材料与方法

2．1材料与仪器

实验材料：烟草无菌苗、烟草叶片愈伤组织

主要实验仪器：培养皿 、超净工作台 、不锈钢镊子、 剪刀 、解剖刀 、酒精灯、75％酒精 、MS培养基等。

2．2实验方法

2．2．1培养基的配制

首先配制MS培养基母液（MS培养基配方见《植物生理学》第二版，潘瑞炽、董愚得，高等教育出版社，1995，第250页），然后在其基础上加入BA,NAA,Sucrose，Agar，再在容量瓶中加入除蔗糖和琼脂以外的其他成分，然后加入所需体积的约2/3~3/4的蒸馏水，搅拌均匀后，加入蔗糖后搅拌使其溶化，用0.5N的NaOH和0.5N的HCL调整pH至5.8～6.0。然后加入琼脂并加热搅拌使其溶化，最后用蒸馏水定容并分装，灭菌冷却后备用。即可得实验所需的愈伤组织诱导培养基。

2．2．2愈伤组织诱导

把消毒好的烟草无菌苗叶片在无菌的情况下切成小块并放入培养基。接种时一定要严格做到无菌操作,首先再自来水下将手洗净，然后用75％酒精消毒，超作在超净工作台中进行。每个三角瓶内接3—5片无菌叶片（叶片大小约2mm²左右），分别于光照下，和黑暗的条件下24ºC诱导愈伤组织，直到愈伤组织完全形成。（注意：所用的镊子，解剖刀灯要用酒精消毒并在酒精灯下烤干；外植体切割时，动作要快，否则会造成外植体失水而影响生长。为防止超作时失水液可在培养皿中滴几滴无菌水，然后将无菌苗置于其中进行切割。接种完毕记录培养基的凝固状态，操作过程，叶片生长状况，外植体大小，每瓶接种数，接种总瓶数。）

植物已经分化的细胞在切割损伤或在适宜的培养基上可以诱导形成失去分化状态的结构均一的愈伤组织或细胞团。外植体一旦接触到诱导培养基，几天后细胞就出现DNA的复制，迅速进入细胞分裂期。3—7天开始形成愈伤组织。[8] 2．2．3植株分化

将诱导的愈伤组织，按类型分别转入分化培养基上（分化培养基的配制：MS培养基附加2.0mgl BA、0.5mgl NAA。），置于连续光照，20—22ºC条件下培养。要及时观察分化情况。需要注意的是，愈伤组织的诱导常常受很多因素的影响，如果转入分化培养基后3－4周仍然没有芽的形成，或愈伤组织状态没有变化，应及时调整培养基浓度，更换新鲜培养基。记载上次实验愈伤组织诱导结果：愈伤组织诱导率，愈伤组织大小，状态，不同光照形成的愈伤组织状态描述，污染率统计。以及本次实验超作过程，接种瓶数，每瓶接种量。

3.结果分析（还需针对表中的数据进行分析）

3．1愈伤组织诱导

通过观察记录分析，在不同培养条件下即不同光照下愈伤组织的形成情况及生长状态（包括：颜色,大小，紧密度）等记录于表1。愈伤组织诱导率%=实际形成愈伤组织数/接种外植体数×100。

3.2器官分化与植株再生

表2统计了不同来源的愈伤组织芽的分化情况及分化状态（分化率%=能够分化芽的愈伤组织/接种愈伤组织×100）。