第二章 菌种与种子扩大培养

3.同步培养

(1)温度 最适生长温度有利于细菌生长与分裂，不适 宜温度如低温不利于细菌生长与分裂。通过适 宜与不适宜温度的交替处理之后，通过培养可 获得同步细胞。
3.增殖培养


收集到的样品，如含所需菌种较多，可直接 进行分离。 如果样品含所需菌种很少，就要设法增加该 菌的数量，进行增殖(富集)培养。 所谓增殖培养就是给混合菌群提供一些有利 于所需菌株生长或不利于其他菌型生长的条 件以促使所需菌株大量繁殖，从而有利于分 离它们。
增殖培养（培养基）

例如：筛选纤维素酶产生菌时，以纤维素作为唯一碳

挑选出
2、菌种的纯化选优


微生物容易发生变异和染菌。 一般丝状菌的野生菌株多数为异核体。 生产菌在不断移代过程中，菌丝间接触、吻合后，易 产生异核体、部分结合子、杂合二倍体及自然产生突 变株等。 以上会造成细胞内遗传物质的异质化，使遗传性状不 稳定。 如果一个菌种遗传背景复杂，既不稳定，用诱变剂处 理后的变株中，负变率将增加。 特别对诱变史长的菌株，采用强烈诱变剂处理，效果 很差，发酵单位反而变得更低。
③生长圈法




通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌. 工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株。 将待检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少所需营养物 的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养 物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈。 如：嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合 倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生 长圈的菌落为嘌呤产生菌。 同样，只要是筛选微生物所需营养物的产生菌，都可 采用营养缺陷型作为工具菌通过生长圈法筛选。
基因工 程
生产用菌种
遗传育种 原 料
扩大培养 接种
发酵罐 发酵条件控制
分离 提纯
灭菌
培养基配置
微生物菌体
代谢产物
产 品
1.细菌（bacteria)
种属
醋杆菌属 （Acetbo bacter） 氧化醋杆菌 巴氏醋杆菌 许氏醋杆菌 弱氧化醋杆菌
用途
山梨糖、5-酮葡萄糖、酒石酸
乳杆菌属（Lactobacillus） 乳酸、乳酸钙、葡萄糖、麦芽糖 芽孢杆菌属（Bacillus） 淀粉酶、5‘-核苷酸酶、肌苷、鸟苷等 核苷
大肠杆菌（Escherichia coli）
ambroniagenes）
天冬酰胺酶、谷氧脱羧酶、天冬氨酸。 苏氨酸、缬氨酸
产氨短杆菌(Brevibacterium 氨基酸、核苷酸、辅酶
2.放线菌(actinomyces)
链霉菌（灰色链霉菌、金色链 链霉素、金霉素、土霉素、氯 霉菌、龟裂链霉菌、委内瑞拉 霉素 链霉菌） 诺卡氏菌形放线菌（诺卡菌、 利福霉素、万古霉素、瑞斯托 拟无分枝酸菌、糖多孢菌） 菌素、红霉素等 游动放线菌 葡萄糖异构酶、游壁菌素、四 聚假糖、紫素霉素
④抑菌圈法

常用于抗生素产生菌的分离筛选。 工具菌采用抗生素敏感菌。若被检菌能分泌某 些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该 菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈。如青 霉素产生菌的筛选。
5.筛选——初筛和复筛



由于纯种分离后得到的菌株数量很大，如果对 每一株都作全面或精确的性能测定，工作量大 且不必要。一般采用两步法，即初筛和复筛。 经过多次重复筛选，直到获得1-3株较好的菌 株，供发酵条件的摸索和生产实验。 （1）初筛 A 平板筛选 B 摇瓶发酵筛选（电泳、纸层析）

二、常规诱变育种
(一)诱变前的处理

确定出发菌株 ↓ 菌种的纯化选优 ↓←出发菌株的性能鉴定 同步培养 ↓ 制备单细胞（或单孢子）悬液 ↓←活菌浓度测定 诱变剂的选择与确定诱变剂量的预 试验 ↓ 诱变处理 ↓计形态变异的菌落数， 计算突变率 平板分离 ↓ 挑取疑似突变菌落纯培养 ↓ 突变体的初步筛选 ↓←用简单快捷的方法 重复筛选 ↓←摇瓶发酵试验 选出突变体（根据情况进行生产试 验或重复诱变处理）

脂平板上，适温培养后，测量形成的水解圈直径和
菌落直径的比值来表示酶活力的强弱。挑选酶活力 强的菌株进一步用摇瓶培养筛选。
A 平板筛选——琼脂打孔


又如在筛选谷氨酸菌种时，用不含有机氮（如 蛋白胨）的培养基，使分离得到的菌株在这种 培养基上形成单菌落，用6~8mm的打孔器打 孔，取出放在滤纸上，喷上茚三酮，出现呈色 圈（蓝色、偏紫色）。取色深的。 进一步摇瓶进行电泳或纸层析鉴别。
小单孢菌（绛红小单孢菌、棘 庆大霉素、利福霉素 孢小单孢菌）
3.霉菌(mould)
曲霉属（黑曲霉、米曲霉） 发酵工业、医药工业、食品工业、 粮食贮存
青霉属（产黄青霉、枯青霉、 多种酶类、有机酸、青霉素、葡 娄地青霉 、展开青霉） 萄糖氧化酶、凝乳酶等
根霉属（黑根霉、米根霉、 华根霉、毛根根霉） 红曲霉属 果胶酶、微生物转化甾类化合物、 酒药酒曲、脂肪酶、淀粉液化等 淀粉酶、麦芽糖酶、蛋白酶、食 用红色色素等
源进行增殖培养，使得不能分解纤维素的菌不能生长。

筛选脂肪酶产生菌时，以植物油作为唯一碳源进行增 殖培养，能更快更准确地将脂肪酶产生菌分离出来。 在分离放线菌时，可现在土壤样品悬液中滴加10%酚 数滴，以抑制霉菌和细菌的生长。


适当控制培养基的温度、pH值
4.纯种分离



富集培养后，目的微生物得到增殖，占了优势， 其他种类的微生物在数量上相对减少，但仍有 多种微生物混杂。 所以有必要进行分离纯化，才能获得单菌落。 方法: 稀释涂布法 划线分离法 利用平皿的生化反应进行分离
第二章：菌种的来源及扩大培养

第一节 发酵工业常用微生物菌种及要求 第二节 工业微生物菌种选育 第三节 生产菌种的改良 第四节 种子的扩大培养
第一节
发酵工业常用微生物菌种及要求
一、发酵常用的工业微生物菌种
细 菌 放 线 菌 霉 菌 酵 母 菌 担 子 菌 藻 类

从自然界分离的菌种 诱变育种
4.酵母(yeast)
酵母属 (Saccharomyces) 酒精、啤酒、白酒、葡萄 酒、各种果酒
假丝酵母属 (Candida)
生产饲料、发酵煤油、石油发 酵脱蜡、酒精等
球拟酵母属——产生甘油、甘露醇、烃类等。 红酵母属——具有产脂肪的能力
酵母

由于酵母细胞内含有丰富的蛋白质、维生素和 各种酸，所以，酵母细胞本身又是医药、化工 和食品工业的重要原料。 如单细胞蛋白(一种饲料蛋白)、酵母片、核糖 核酸、核苷酸、辅酶A及酶制剂等。

如：第一株青霉素生产菌是从美国伊利诺斯州 长霉的葡萄柚中分离出来的； 第一株头孢霉素生产菌则来自于意大利撒 丁岛的污水中。（黄青霉支顶孢菌生产头孢菌
素C ——顶头孢霉菌 ）
目前工业上应用的优良菌种，几乎都是经过诱 变处理后获得的突变株。
在40年内青霉素生产菌通过诱变育种使青霉素产量 增加了近万倍,达到10万u/ml 左右。 谷氨酸产生菌经紫外诱变处理,产酸率提高了 31%;


二、工业化菌种的要求
原料廉价，生长迅速，目的产物产量高。
易于控制培养条件，酶活性高，发酵周期短。 抗杂菌和噬菌体的能力强。 菌种遗传性能稳定，不易变异和退化。 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病
菌无关）
第二节 工业微生物菌种选育




一、自然选育——根据菌种的自发突变而进行菌种筛选过程。 突变频率低。 二、诱变选育——通过诱变剂处理，突变频率提高，随机性大，如果 筛选方法得当，也有可能定向地获得好的变异株。 目的： 提高产量 提高质量 增加品种 改善工艺条件 例：青霉素 色素 土霉素 泡沫 红霉素 噬菌体

筛选半纤维素酶 划线产透明圈的细菌 点种细菌双层水解圈
②变色圈法


对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平 板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴 别出来。 如：筛选果胶酶生产菌时，用含有0.2%果胶为唯一碳 源的培养基平板，待菌落长成后，加入0.2%刚果红染 色液4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红 色水解圈。
微生物资源

目前已确定的微生物种数在十万种左右,但仍正以每年发现几百至 上千个新种的趋势。 (05年发现494种，韩国68种，日本为59种，美国44种，中国42种， 德国41种） 已经初步研究的不超过自然界微生物总量的10%。 微生物的代谢产物据统计已超过1300多种，而大规模生产的不超 过100多种； 微生物酶有近千种，而工业利用的不超过四五十种。可见潜力很大。

（2）复筛




经初筛后可简便快速淘汰85~90%不符合要求 的微生物，剩下较好菌株进行摇瓶复筛。 通常一株要重复3~5个瓶，培养后的发酵液采 用精确分析方法测定： 蛋白酶用分光光度计； 脂肪酶用NaOH滴定等。 最后选出2~3株。
6.生产性能的测定

进行生产性能测定，确定是否适合生产要求，是否可 用于生产。 这些特征包括： 形态、 培养特征、 营养要求、 生理生化特征、 发酵周期、 产品品种和产量、 耐受最高温度、 生长和发酵最适温度、 最适pH值、 提取工艺等。
A 平板筛选——显色或生化反应

纯化分离阶段本身就是筛选过程。对于那些在纯化 分离阶段没有采用平皿定性法挑选出来的菌落，即
随机挑选的菌落，需经过平板筛选。

平皿快速检测法，将复杂而费时的化学测定改为平 皿上肉眼可见的显色或生化反应（进而电泳、层析）。 如：筛选产生碱性蛋白酶的地衣芽胞杆菌时，可将 分离得到的菌株，点种在含有0.3~0.4%酪蛋白的琼
一、自然选育
自然选育的一般过程
1.制定方案


首先查阅资料，了解所需菌种的生长和培养特性，制 定方案，才能有针对性地采集样品和分离菌种。 例如 与水、空气相比，土壤具备了微生物所需的养分，是 微生物最集中的地方。但不同的微生物由于生理特性 不同，采集的场所有所选择。 采样地点要根据筛选目的、微生物的分布及菌种的主 要特征与外界环境关系等，进行综合、具体地分析。 如果预先不了解某种生产菌的具体来源，一般可从土 壤中分离。
2.标本采集



取离地面5~15cm处的土壤几十克，盛入预先 消毒好的牛皮纸袋中，扎好，记录采样时间、 地点、环境情况等 如：森林土有相当多的枯枝落叶和腐烂的木 头等，富含纤维素，适合利用纤维素作碳源 的纤维素酶生产菌的生长。 又如：在肉类加工厂附近和饭店排水沟的污 水、污泥中，由于有大量腐肉、豆类、脂肪 类存在，因而，在此处采样能分离到蛋白酶 和脂肪酶的生产菌。
刚果红的变色范围为pH3～5。 在pH＞5时，它以磺酸钠形式存在，显红色； 在pH＜3时，它以邻醌式内盐的结构存在，显蓝色。 果胶酶水解果胶形成游离的半乳糖醛酸

②变色圈法

又如：在分离谷氨酸产生菌时，在培养基中加
入溴百里酚蓝指示剂若平板上出现产酸菌，其
菌落周围会变成黄色。

pH6.2以下为黄色， pH6.2以上为蓝色.
1、出发菌株的选择
用来进行诱变或基因重组育种理的起始菌株称为 出发菌株。出发菌株会直接影响到最后的诱变效果，因此必须 对出发菌株的产量、形态、生理等方面有相当的了 解。 变异幅度广 产量高的出发菌株 对诱变剂敏感性大
（1）自然界直接分离 到的野生型菌株 （2）经历过生产条件 考验的菌株 （3）已经历多次育种 处理的菌株
利用平皿的生化反应进行分离

①透明圈法 ②变色圈法 ③生长圈法 ④抑菌圈法
①透明圈法



在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培 养基混浊。能分解底物的微生物会在菌落周围 产生透明圈。 该法在分离水解酶产生菌时采用较多，产有机 酸菌也可用。 如：脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌 都会在含有底物的选择性培养基平板上形成透 明圈。 圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。

原理：茚三酮能使氨基酸氧化脱羧又脱 氨，反应结果产生还原的茚三酮和 氨，这二种产物又互相作用产生蓝 色或偏紫色产物，产物的多少与颜 色深浅成正比，可以作为氨基酸的 定量分析。
B 摇瓶发酵筛选
平皿法为固体培养基，与液体培养条件差距较 大，因此经过平皿法后与摇瓶法作对比试验。 一般一株接一个瓶，得到的发酵液加入琼脂培 养基孔中，培养基中加入鉴定菌（测定抗生素 产生菌）或底物（测定酶制剂产生菌 ）， 用对应的溶菌圈或水解圈等鉴别。