P53的研究进展12345

P53的研究进展
摘要:转录调节因子p53作为一种抑癌基因,可诱导细胞生长阻滞,细胞凋亡,细胞分化以及DNA修复。

但p53突变体可能会使野生型p53基因的抑癌功能失活,甚至发挥癌基因的功能。

随着分子生物学技术的发展,人们对p53基因调控网络有很多新的认识。

笔者就p53的调节通路以及在肿瘤治疗方面的新进展进行综述。

关键词: p53基因；肿瘤；细胞凋亡
Abstract:The tumor suppressor gene p53 is a transcription factor that mediates several cellular processesincluding growth arrest, apoptosis, differentiation, and DNA damage repair However, Mutant p53 maycauses wild-type p53 loss above functions With the development of molecular biology, there are some newresearche of p53 pathway The advance of research of p53 pathway and related gene therapy are reviewed
Key words:p53 gene；cancer；apoptosis
前言：细胞凋亡是受一系列基因控制的程序化细胞死亡方式,它是通过外源性或内源性的凋亡信号,激活细胞内编码的自杀程序而促发的。

早在1964年,就有学者提出程序性细胞死亡的概念,至1972年,这种细胞生理性自杀过程就被正式称为细胞凋亡。

目前对细胞凋亡相关基因的研究已成为生命科学的前言和热点。

p53 基因对防止细胞增生和保持DNA 受损基因组的完整性有重要作用。

且能调控大量的细胞活动,其中p53 基因对细胞凋亡的调控是研究得较多的[1]。

p53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因之一,是当前肿瘤分子生物学研究的热点。

转录调节因子p53作为一种抑癌基因,可诱导细胞生长阻滞,细胞凋亡,细胞分化以及DNA修复。

自1979年Lane等发现p53基因以来,人们对它的认识经历肿瘤抗原、癌基因、抑癌基因三个阶段。

近年的研究已证明,野生型p53基因是一种抑癌基因,对细胞的生长、分化、增殖起调控作用。

以下就p53的调控以及
作用作一叙述【2】。

1p53的结构特性
肿瘤抑制因子p53是分子量为53KD的磷酸化蛋白,1979年有文章报道在猿猴病毒40(SV40)感染细胞中与病毒大Ｔ抗原免疫共沉淀出一种分子量为53KD的蛋白，因此将其命名为p53。

早期研究认为p53是一个致癌基因,并且发现发生突变的p53致癌作用增强；后来发现早期研究所中的p53的关键位点发生了突变，而真正野生型的p53是一个肿瘤抑制基因而并非致癌基因【3】。

在人类中,p53基因定位于17p13,全长约20 kb,由11个外显子和10个内含子组成,转录成2·5 kb mRNA,编码393个氨基酸的蛋白质,相对分子质量为53×103。

该蛋白是一种核结合蛋白,含有3个主要功能区:1)N-末端转录激活区,可激活转录,介导蛋白间相互作用,这一区域还可和p53负调控因子结合;2)中央DNA核心结合区,这一区域具有特异性结合DNA功能,并且是肿瘤细胞突变热点区域;3)C-末端非专一DNA结合区,包括核定位信号区和核输出信号区[4]。

分析人、鸡和鼠的p53蛋白氨基酸序列发现有5个进化保守区,分别位于第13-19、第117-142、第171-181、第236-258和第270-288号氨基酸残基.这些保守区的存在与p53蛋白的功能密切相关,可能是p53蛋白生物学活性的关键部位。

现已证明p53蛋白与SV40大T抗原的结合点是保守区III、IV、V,而不同类型的肿瘤发生的p53基因突变多位于保守区内,尤以175、248、249、273、282位点的突变率最高。

人类p53基因定位于17号染色体短臂1区3.1带(17p13·1),全长16-20 kb,基因组有11个外显子、10个内含子。

p53基因的启动子不含CAA盒、TAA盒及GC盒等常见启动子序列,转录产生的mRNA约2·5 kb。

p53基因具有进化保守性,可在DNA复制水平上调节细胞的正常生长,是细胞生长的重要的负调节因子。

实验证明p53基因异常改变的高频区非随机分布于该基因第5到第8号外显子上。

现已制备出识别不同p53蛋白抗原决定簇结构的单克隆抗体,如pAb1801,能识别位于第32-79位氨基酸之间的抗原决定簇，与野生型和突变性P53蛋白均起反应[5]。

P53 基因分为野生型和突变型,野生型的p53基因存在于正常细胞中,是一种抑癌基因,编码 p53 蛋白。

突变型 p53 基因失去了对细胞的监视功能且本身还有促进恶化的活性，抑制细胞的凋亡，使细胞无限制的生长，对肿瘤的发生发展
和预后有重要的影响【9】。

2 p53的功能
p53基因功能包括DNA结合功能、细胞循环过程的控制、DNA修复、细胞凋亡控制、参与细胞分化和基因的可塑性调控。

细胞生长分裂有G1(DNA合成前期)、S(DNA合成期)、G2(DNA合成后期)和M(细胞分裂期)四个期,前三期为细胞分裂间期。

p53主要作用于细胞周期的G1期、G2/M期和G0(休眠期细胞)-G1-Rb等检查点[7]。

P53蛋白主要有3个功能区域:N-末端转录区域(transactivation domain,TAD)、C-末端寡聚区域(oli-gomerization domain,OD)和核心区域(DNA-bindingdomain,DBD)。

其中最重要的是核心区域,可以结合序列特异性的DNA。

p53基因突变最多的是DBD区域,可以导致DNA的结合的受阻。

在DBD区域102~296位密码子都可以发生突变(除了第123位密码子)。

但是,有些密码子比其他的更容易发生突变,有6个密码子的突变占了总突变的30%,分别是第175、245、248、249、273、282位密码子。

p53蛋白在所有的细胞系都有表达,但是由于蛋白酶的快速降解而不发生累积。

在正常的环境下,p53蛋白在G1/S期短暂活化,参与控制进入S期的时间。

p53是一个重要的抑癌基因,可以整合多重压力信号和调整细胞反应,通过一系列的靶基因使DNA得到损害,最终导致细胞周期的停滞。

当细胞严重损害时,p53可以使细胞发生凋亡。

p53另外一个主要的靶基因是Mdm2,编码泛素连接酶,Mdm2可以结合p53蛋白的N-末端引起p53失活、出核转运、降解。

p53也是一种细胞老化主要的调节器,实际上端粒的缩短引起细胞的复制可以触发p53的活跃。

因此,封闭细胞周期有利于细胞进入老化。

p53的失活可能有助于增加细胞复制的数目,最终在培养细胞引起更多遗传异常的积累和获得永生的表型。

最后p53基因可以使用不同的内部的启动子和(或)内部的转录产生许多N-末端缩短的亚型,包括p53、p53β、p53γ、Δ133p53、Δ133p53β、Δ133p53γ、Δ40p53、Δ40p53β及Δ40p53γ。

这些新发现的异构体不但参与了对p53抑癌活性的调节,而且其表达失调还可能加速了癌症的发生[6]。

3 p53与细胞凋亡
P53是一种短寿命蛋白,其细胞内浓度受其负调控因子MDM2 严格的调控。

MDM2 既可以多泛素化p53,也可以单泛素化p53。

在正常细胞中,主要存在多泛素
化的p53。

多泛素化的p53被蛋白酶体快速的降解,然后又不断的更新。

单泛素化的p53能够转位出核,并定位到线粒体上,在线粒体上的HAUSP(去泛素酶)作用下, 形成无泛素化的p53。

而在凋亡刺激下,p53的多泛素化会受到抑制,主要以单泛素化形式存在。

此时,一方面 p53的多泛素化降解受到抑制,从而使得p53在细胞内不断累积;另一方面,胞质中单泛素化的p53能够定位到线粒体上。

而最近一项研究表明,在 DNA 损伤刺激作用下,细胞核内的p53由于受到PARP1的多聚ADP核糖基化修饰,与CRM1的相互作用被抑制,使得p53不能向核外转运而在核内累积,而未被多聚ADP核糖基化的p53四聚体仍然可以转运出核。

可见在凋亡刺激条件下,多聚ADP核糖聚合酶1 (poly ADP-ribose poly-merase 1, PARP1)对p53的多聚ADP核糖基化修饰在调节p53转运出核的过程中起到关键作用。

另外,实验表明凋亡刺激并不影响细胞质中的 p53 向细胞核内转运过程。

p53 针对多种凋亡刺激的具体应答机制存在刺激和细胞特异性。

一般认为, DNA损伤性刺激会短暂激活ATM(ataxia telangiectasia mutated),进而导致p53第15位Ser的磷酸化。

p53第15位Ser的磷酸化会进一步促进其他位点如Thr18、Ser9和Ser20的磷酸化。

Ser20的磷酸化对p53的降解有重要调节作用,Ser18的磷酸化阻止了p53和MDM2的相互作用。

而作为p53重要的负调控因子,MDM2对p53的调控是多方面的,如转录活性抑制、促进p53降解和促进p53核外转运。

p53 的Ser15、Ser20、Thr18 的磷酸化在稳定p53的同时,也促进 p53招募 CBP、p300(辅激活子,HAT,组蛋白乙酰转移酶)和P/CAF (HAT)等辅激活子。

辅激活子的招募不仅增强了p53的转录活性,并且能乙酰化p53 C端的一些Lys残基,从而阻止这些Lys残基的泛素化,最终稳定p53。

ATM也会对MDM2第395位Ser进行磷酸化,同时通过c-Abl对MDM2的第394位Tyr进行磷酸化,这两个位点的磷酸化能相互独立的抑制MDM2介导的p53 降解。

此外,有报道称在 DNA 损伤刺激下,p53 第 46 位 Ser的磷酸化能够促使其转录促凋亡基因产物。

综上所述, p53可以针对多种凋亡刺激产生有效的应答,最终导致p53的稳定累积、亚细胞定位的改变以及转录活性的增强。

3.1 p53的转录依赖性促凋亡作用
最初人们认为,p53的促凋亡作用主要依赖于其转录活性。

p53 的靶基因编码多种促凋亡蛋,如p53AIP1、PERP(p53 apoptosis effector related
toPMP-22)、PIGs、Fas、Apaf-1、Bax、PUMA、Nox。

这些蛋白质都在细胞凋亡过程中发挥重要作用。

p53AIP1可以诱导线粒体膜电位ψ的降低和细胞色素C的释放。

Apaf-1 (apoptosis protease activating fac-tor-1)可以与caspase-9和细胞色素c 形成凋亡复合体(apoptosome),从而介导凋亡的线粒体途径。

Bax是Bcl-2蛋白家族中一种重要的促凋亡蛋白,在凋亡刺激下它能够被激活并在线粒体外膜寡聚形成孔道,诱导细胞色素c等凋亡促进因子从线粒体中释放,最终引起凋亡级联反应。

PUMA和Noxa 是Bcl-2蛋白家族中另一类促凋亡蛋白(BH3-only)中的主要成员。

PUMA 存在 4 种亚型(α、β、δ、γ)。

PUMAδ、PUMAγ亚型缺少 BH3 结构域,不能诱导凋亡,而PUMAα、PUMAβ亚型 BH3 结构域发生突变将导致PUMA 促凋亡活性丧失,表明 BH3 结构域对于其促凋亡功能是至关重要的。

小鼠Noxa 存在两个BH3结构域(人Noxa只有一个BH3结构域),其与Mcl-1(Bcl-2蛋白家族中的一类抑凋亡蛋白)的结合能促使Mcl-1 的泛素化降解。

PUMA 和 Noxa 的功能在一定程度上存在冗余,但是PUMA的作用比Noxa更为广泛,并且不局限于DNA 损伤导致的凋亡。

p53对 PUMA 的转录非常重要。

PUMA 的启动子上存在两个p53结合位点。

此外, p53还可以抑制Bcl-xL(Bcl-2蛋白家族中的一种抑凋亡蛋白)的转录。

这表明p53也可以通过转录抑制抗凋亡蛋白来执行其促凋亡功能。

总之,p53作为转录因子调控下游凋亡相关蛋白的表达,在促使细胞凋亡的过程中发挥[7]。

3.2 p53的转录非依赖性促凋亡作用
p53 也存在转录非依赖性的促凋亡作用。

1994年, Caelles 等首先发现p53在转录和翻译抑制剂存在的情况下同样能诱导凋亡。

一些不具有转录活性的 p53 突变体也并不严重影响其促凋亡功能。

进一步的研究表明, 在凋亡刺激作用下, caspase-3、caspase-6、caspase-7可以切割p53,这些p53片段能够转位到线粒体并且诱导细胞凋亡。

另外,有实验表明,在受到凋亡刺激的NCI-H1299细胞中,p53与WOX1 (WW domain-containing oxidoreductase)能够共定位于线粒体。

剔除WOX1将抑制p53诱导的凋亡。

这些都表明胞质中的p53在促凋亡过程中的起到关键作用。

体外脂质体系统实验表明,p53能够直接激活Bax,诱导Bax寡聚,进而导致脂
质体中Dextran的释放。

p53转录活性丧失突变体p53QS(p53L25Q,W26S)能够促使Bax寡聚,引起细胞色素c释放与细胞凋亡。

但是p53Dpp(富含脯氨酸结构域缺失)则不能。

这表明此结构域对于激活Bax并诱发凋亡非常重要。

此外,与Bax、tBid相比,p53与Bcl-xL的亲和力更高。

p53能够将Bax从Bax-Bcl-xL复合物中置换出来,而Bax和tBid的浓度必须50倍于p53时才能够将p53从p53-Bcl-xL 复合物中置换出来。

结构分析表明,p53 通过其 DNA 结合结构域与 Bcl-xL、Bcl-2 的结合。

p53 也能够直接结合并激活Bak,诱导Bak寡聚,从而导致细胞色素 c释放和细胞凋亡。

在正常细胞中,Bak大部分被Bcl-xL和/或Mcl-1 结合,从而其促凋亡作用被抑制。

而p53能够激活Bak并将其从Bak-Mcl-1复合物中释放出来,从而引发凋亡。

一般认为,Bak可能通过 BH1、BH2、BH3 结构域协同形成的疏水口袋与 p53 结合。

其中任何一个结构域的缺失都将导致p53与Bak结合能力的丧失。

此外,p53具有两种亚型(R72和P72)。

在体外实验中,它们具有相同的激活Bak的能力。

但在细胞内,R72 具有更强的促凋亡效力。

这进一步暗示了胞质中的p53起着非常重要的促凋亡作用,因为 R72 具有很强的核外转运能力而 P72 不能向核外转运。

虽然 p53转录非依赖性的促凋亡机制还有待于进一步阐明,但越来越多的实验证明了p53在胞质作用在细胞凋亡过程中的重要性。

一般认为,p53具有与Bcl-2家族蛋白中的BH3-only相似的功能。

其既可以作为激活子(与tBid,Bim,PUMA相似)],直接激活Bax和Bak从而诱导凋亡,也可以作为enabler(与Bad,Bmf,Noxa等相似),解除Bcl-2和Bcl-xL的抗凋亡效应。

这两种机制相互协同,共同介导了p53的转录非依赖性的促凋亡作用。

4 p53在肿瘤诊断治疗方面的作用
P53基因结构及表达异常是至今为止人类肿瘤中最常见的基因改变之一。

在多种肿瘤和癌家族中,发现突变型p53是肿瘤形成的主要原因。

至今已发现有51种不同类型肿瘤有基因突变，如结肠癌基因突变率为70%，肺癌50%，乳腺癌40%等,血液淋巴系统恶变中其突变率也相当高。

同时有突变的患者恶性程度较高、预后较差,该基因可作为一种独立可靠的生物学指标来判断预后【8】。

随着基因组学、蛋白组学和生物信息学飞速发展,p53的突变分析日趋完善。

早期p53研究主要采用免疫组织化学技术,但p53的半衰期极短,此方法检测结果往往不准确。

现代分子生物学方法并不着眼于p53是野生型还是突变体,而是直
接从空间构型上识别碱基错配。

片段分析可以完整精确的检测出p53的突变类型,最新的自动片段分析技术还有利于研究者采集片段信息。

某些生物技术及其产品也在p53介导的肿瘤治疗方面发挥日益重要的作用。

研究人员将野生型的p53基因cDNA片段克隆进腺病毒载体并转染肿瘤细胞,但遗憾的是转染后基因无法适时、适地、适量地调节基因的表达。

另外,研究人员通过ONYX-015系统对含有高表达p53变异基因的细胞进行靶向定位,直接杀死含有变异p53基因靶细胞,而对表达野生型p53基因的细胞无杀伤作用。

也有研究人员试图将突变型p53蛋白转化为野生型p53蛋白,治疗肿瘤。

研究人员已开发出一种类似p53的多肽,用于干扰p53-MDM2复合物的形成,促进p53释放并诱导细胞周期停滞或促进细胞凋亡。

这些小的肽段可以结合到抗原决定簇,防碍p53和MDM2之间的相互作用,治疗肿瘤。

研究人员把人和小鼠体内糖-胆固醇复合物当作一种抗癌剂用于癌症治疗,该复合物可通过影响p53的信号通路来促使细胞凋亡。

研究人员发现糖-胆固醇的去泛素化作用可以增加p53稳定性,引发细胞增殖抑制和细胞凋亡。

另外,该复合物还可激活p53通路(p53 at ser 46),包括p53两个家族成员,p63和p73。

最后,该复合物还可激活Pin1,全面的活化p53,诱导细胞凋亡。

尽管目前糖-胆固醇的抑癌机理还在探索中,但确定的是p53通过不可逆的抑制细胞生长,引起细胞凋亡[5]。

最近Svane IM等还研制结合p53肽段的树突状细胞疫苗,临床Ⅱ期试验中发现,在接种疫苗后,约1/3的患者病情稳定或者出现病情的轻度消退,同时伴随p53的高表达。

这些新的治疗方法让人们看到人类攻克癌症的新希望。