硝酸还原酶与谷氨酰胺合成酶的测定

硝酸还原酶与谷氨酰胺合成酶活性的测定
摘要本实验以小麦为实验材料，对小麦进行预处理，提取酶液进行硝酸还原酶与谷氨酰胺合成酶活性的测定，说明小麦对氮素的利用途径。

关键词小麦硝酸还原酶谷氨酰胺合成酶酶活性
引言
硝酸还原酶(NR)是植物代谢中十分重要的一种酶,它主要是在硝酸亚硝化过程中起催化作用。

同时, 它对其他代谢如光合作用、碳代谢和能量代谢都有重要影响[1]。

就植物的生长和发育而言 ,氮素的同化是个十分重要的生理过程。

其中 ,无机氮必须同化为谷氨酰胺和谷氨酸等有机氮才能被植物体所吸收和利用。

谷氨酰胺合成酶 (GS) 是高等植物氮代谢中十分重要的酶 ,它和谷氨酸合成酶联合作用 ,催化氨的同化 ,使其转变成 Gln 和 Glu ,在小麦植物体内含氮有机物的生物合成中作为 N 的供体[2]。

1、实验材料与方法
1.1实验材料与试剂
小麦、亚硝酸钠、磷酸氢二钠、对氨基苯磺酸、浓盐酸、萘基乙烯胺、硝酸钾、三氯乙酸、反应液、终止液、显色液、亚硝态氮标准溶液、三羟甲基氨基甲烷、硫酸镁、二硫苏糖醇、蔗糖、浓盐酸、谷氨酸钠盐、半胱氨酸、乙二醇双（氨乙基醚）四乙酸（EGTA）、盐酸羟胺、氯化铁、三氯乙酸、三磷酸腺苷（ATP）。

1.2实验原理
1.2.1硝酸还原酶活性的测定
硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-
萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。

此红色偶氮化合物在540nm下有最大吸收峰，可用分光光度计测定。

故硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示，而亚硝态氮的量可有标准曲线查的。

1.2.2谷氨酰胺合成酶活性的测定
谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP和Mg2+存在下，它能催化植物体内在硝酸还原过程中产生的氨与谷氨酸形成谷氨酰胺，实现氨的同化，在生物体内，谷氨酰胺既是氨的贮存形式（消除氨毒），又可用于谷氨酸的合成，在进一步合成其他氨基酸。

但在该实验设计反应体系中，谷氨酰胺与盐酸羟胺等物质发生反应，生成γ-谷氨酰基异羟肟酸。

此物质在酸性条件下可与Fe3+形成红色的络合物，该络合物在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。

因此，谷氨酰胺合成酶的活性可用产生的γ-谷氨酰基异羟肟酸与Fe3+形成的络合物的量来表示，一般间接用540nm处吸光值的大小来表示，单位为：A•mg-3(protein) •h-1。

1.3实验步骤
1.3.1硝酸还原酶活性的测定
1.3.1.1标准曲线制作
取7支试管，按下表顺序依次添加试剂。

摇匀后在30℃下水浴20min，然后在540nm下比色。

以亚硝态氮含量与对应吸光值建立回归方程。

符号 1 2 3 4 5 6 7
试剂
（ml ）亚硝酸钠
标准液
蒸馏水
1% 磷胺
0.02%α-
萘胺
酶管含亚
硝态氮
（ug）
0.0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0
4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
0.0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
1.3.1.2硝酸还原酶活性测定
植株预处理、取样、酶活性反应：先往对照瓶中加入1ml终止液，然后往3个瓶中均加入9ml反应液；混匀后立即放入真空干燥箱中，抽真空15min（期间停顿几次通入空气，再抽真空，使叶片完全沉入瓶底）；之后将各瓶在30℃、黑暗条件下静置反应30min；反应时间到，立即往两个测定瓶中加入1ml 终止液；将各瓶摇匀，再静置3min。

最后进行显色反应，根据标线求得亚硝态氮含量。

计算硝酸还原酶活性。

1.3.2谷氨酰胺合成酶活性的测定
1.3.
2.1酶液的提取
称取植物叶片1.0g，置于预冷研钵中，加3ml酶液提取液，置冰浴上研成匀浆，转移于寓心管中，在4℃下、15.000转离子20min，上清液即为酶液。

1.3.
2.2谷氨酰胺合成酶活性测定
取3支试管，分别加入0.7ml酶液和0.7mlATP溶液：然后往其中1支加入1.6ml反应混合液A（作为对照管），另外2支各加入1.6ml反应混合液B（作为反应管），混匀后，将3支试管均置于37℃水浴下反应30min；反应结束
后，3支试管均立即加入1ml显色液，摇匀，静置片刻后，取上清液在540nm 处测定吸光值（用酶液提取液调零），根据吸光值计算酶活性。

1.3.
2.3酶液中可溶性蛋白含量测定（采用紫外吸收法）
取酶液0.3ml，用蒸馏水定容至100ml，分别在260nm和280nm下测定吸光值（用蒸馏水调零），根据公式计算酶液中可溶性蛋白含量。

2、实验结果与分析
2.1硝酸还原酶活性的测定
2.1.1标准曲线的测定以及硝酸还原酶活性的测定
图1 标准曲线
2.1.2样品活性的测定
通过实验得出对照管，测试管1，测试管2的吸光值（表1）。

表1硝酸还原酶的吸光值
1 2 3 平均值
对照管0.005 0.015 0.009 0.0097 测试管1 0.039 0.016 0.029 0.028 测试管2 0.031 0.035 0.036 0.034
通过以上的数值代入标准曲线中可以得出硝酸还原酶含量，即硝酸还原酶的活性（表2）。

表2 不同管内亚硝态的量
编号亚硝态氮的量 P≤0.5
对照管0.318 a
测试管1 0.629 b
测试管2 0.764 c 通过以上的数据统计，可以得出亚硝态氮的量，即为硝酸还原酶的活性，从实验的结果来看，实验管和对照关差异显著，实验前测试管用硝酸钾处理，小麦中硝酸还原酶明显增多，硝酸还原酶的活性明显增强。

2.2谷氨酰胺合成酶活性测定
以γ-谷氨酰基异羟肟酸与Fe3+形成的络合物在540nm波长下的吸光值（表3）。

表3 540nm波长下的吸光值
1 2 3 平均值
对照管0.558 0.596 0.620 0.591 测试管1 0.806 1.002 1.018 0.942 测试管2 1.328 1.096 1.115 1.179 可溶性蛋白利用紫外吸收法测定，通过测定在不同波长下溶液的吸光值，然后利用公式进行计算，根据公式可以算出（表4）：可溶性蛋白的含量
=1.55A
280-0.76A
260
表4 可溶性蛋白的含量
编号可溶性蛋白的含量 P≤0.5
对照管0.053 a
测试管1 0.089 b
测试管2 0.101 c
由表3和表4得到的数据可以代入以下公式，计算得出谷氨酰胺合成酶的活力（表5）：通过测定谷氨酰胺合成酶在540nm吸光值和粗蛋白质的含量，通过公式就可以计算出谷氨酰胺合成酶活性，计算公式常用的是：GS=A/
（P*V*T）在上面的公式中：A为540nm波长下的吸光值；P为可溶性蛋白的含量；V为反应体系中加入的酶量；t为反应时间（h）。

表5 谷氨酰胺合成酶的活力
编号谷氨酰胺合成酶的活力 P≤0.5
对照管0.319 a
测试管1 0.322 b
测试管2 0.337 c
通过试验结果表明，三个实验试管中谷氨酰胺合成酶的活力之间差异性不显著，说明了植株体内的谷氨酸含量不是很高，很可能与实验前的处理时间长短有关系。

3、讨论
硝酸还原酶(NR)是陆生植物氮代谢的关键酶之一, 它将进入植物体内的
NO
3-还原为 NO-
2
, 进而在亚硝酸还原酶的作用下还原为氨进入氮的同化。

因此,
NR 活性直接影响植物对土壤中硝态氮的利用能力。

生产中, 硝酸还原酶活性可作为农作物氮肥形态选择的重要依据, 也被认为是作物氮高效的育种选种指标之一[3,4]。

GS 在氮同化过程中起着十分重要的作用 , GS 也是分子生物学研究基因专一性表达和时空表达调控的好模式 ,所以成为人们研究的热点之一 ; 同时它的表达既受环境因素 ,如 CO2 、光、 NaCl 浓度等的影响 ,又受到发育因子的影响 ,因此 ,也是植物逆境生理研究的重要内容之一[5]。

在硝酸还原酶活性测定中，抽真空后不能见光是因为酶对反应条件很敏感，可能在光照的条件下就失活，另外，硝酸会见光分解。

实验前充分光照是使小麦的酶活性达到
最大值。

空白对照的目的在于有一个在同样条件下结果的对比。

谷氨酰胺与盐酸羟胺等物质发生反应，生成γ-谷氨酰基异羟肟酸。

此物质在酸性条件下可与Fe3+形成红色的络合物，该络合物在540nm处有最大吸收峰。

在试验中测得可溶性蛋白的含量，利用公式即可算出谷氨酰胺合成酶的活力。

随着氮代谢相关基因研究的进一步深入，与植物氮素营养反应相关的基因更为明确，利用基因表达差异进行植物氮营养的早期检测，将为更加准确、及时地进行肥料运作提供科学依据。

参考文献
[1] 陈薇, 张德颐.植物组织中 NR 的提取、测定和纯化.植物生理学通讯, 1980(4):45-49.
[2]李常健,林清华,张楚富.高等植物谷氨酰胺合成酶研究进展.生物学杂志 ,2001,18(4):1-3.
[3]刘亚丽,赵喜婷. 教学实验中硝酸还原酶活性测定方法的改进.植物生理学通讯, 2006,42(3):502 .
[4]张涛,陈云,谢虹,等.硝酸还原酶活性的调节及可能机制的研究进展.广西植物,2004 ,24(4):367-372.
[5]印莉萍,刘祥林,柴小清,等.不同浓度的氮源对小麦离体叶谷氨酰胺合成酶及其相关酶的影响.首都师范大学学报（自然科学版）,1997,18(2):34-40.。