诱导多能干细胞

Wnt信号通路
提高无c-Myc参与的OSK介导的IPS的 效率。
IPS技术的应用及其意义
1.基于IPS细胞的细胞移植治疗
2.人类疾病模型，病人特异的疾病及药物筛 选
3.重编程机理解析
4.新物种的多能肝细胞
基于IPS细胞的细胞移植治疗
人类IPS细胞走向临床应用面临着免疫排斥 的困难，而IPS技术有望解决这一难题。
可诱导病毒 表达系统：这个系统无 法避免病毒对宿主细胞 基因组的随机组合
多顺反子 及剪切体系：减少 病毒的插入位点，保 障所有转录因子在同 一受染细胞内的同时 表达，且表达量可以 实现一定的平衡。
Cre-LoxP重组 剪切系统：实现对外 源基因表达的调控及 切除外源的原癌基因
腺病毒：避免病毒载 体插入宿主细胞基因 组可能引起的基因突 变等后果。但是编程 效率低。
诱导多能干细胞(IPS) Induced pluripotent stem cell
IPS细胞的定义
通过一定的途径将与细胞多能性有关的基 因导入到已分化的体细胞中，或者同时添加一 些辅助作用的小分子化合物使体细胞去分化重 编程回到胚胎干细胞状态，所获得的细胞即为 IPS细胞。 IPS细胞与胚胎干细胞（ES）形态相似、 核型、端粒酶活性、体外分化潜能均相同，同 时也能够表达相同的表面标志分子。
IPS细胞的鉴定

基因表达模式和发育潜能鉴定

ES和IPS细胞基因表达谱基本相同。IPS细 胞具有发育为三个胚层的能力，并能参与 生殖系的发育，这与ES细胞相同。
信号通路
信号通路
TGF-P信号通路
是维持人类ES细胞多能性的 主要信号通路。
MEK和GSK3信号通路
MEK信号通路：促进肝细胞分 化。GSK3信号通路：抑制细胞 增值。
新物种的多能肝细胞
目前许多物种ES细胞系的缺乏阻碍了转基因 动物模型的建立，IPS技术的诞生开拓了制 造多能干细胞系的新途径。
2012年诺贝尔生理学或医学奖

发现成熟细胞可以被重新编程为多功能的 干细胞（即诱导多功能干细胞）
John B. Gurdon 约翰・格登
Shinya Yamanaka 山中伸弥
小鼠和人诱导多功能干细胞技术的诞生
1.小鼠IPS细胞的诞生:2006年Yamananka研 究组用Oct4,Sox2,c-Myc及Klf4四个转录因 子诱导MEFS重编程至多功能干细胞状态。 2.人的IPS细胞诞生:Yamanaka实验组将转录 因子Oct4,Sox2,Klf4及c-Myc以逆转录病毒 为载体诱导人类表皮细胞及结缔组织细胞 重编程为IPS细胞。
iPS细胞诱导机制
已 分 化 的 细 胞
导入病 毒基因 Oct3/4、 Sox2、 c-Myc和 Klf4
病毒逆转录
Ips细胞
胚胎干细胞培 养条件和筛选
构建IPS细胞示意图
转录因子
Oct4:Oct4能够促使ICM的形成，维持ES细胞 未分化状态并促使其增值，是细胞全能性 的标志基因之一。
转录因子
IPS技术的关键因素
1.获得初始的体细胞为重编程靶细胞
2.构建诱导重编程因子的载体
3.携重编程因子的载体作用于体细胞 4.IPS细胞的获得，鉴定及培养体系的建立
诱导IPS细胞的实验流程
靶细胞的选择
1.靶细胞类型影响重编程效率
2.靶细胞类型影响嵌合鼠的成瘤率
载体的选择 病毒
慢病毒，逆转录病毒： 共同缺陷1.病毒的随机 插入及病毒表达不可调 控2。病毒如果不能沉 默就会导致外源基因的 持续表达3.病毒的重新 激活会导致肿瘤相关 基因c-Mycj及Klf4的重 新表达。
IPS
蛋白质：安全 性高，穿越细 胞膜的能力有 限。 小分子化合物： 有可能带来细胞 毒性和无法检 测得微小变 化
IPS细胞的筛选方法



a.形态学筛选 不对供体细胞做任何额外遗传修 饰的情况下，仅依靠形态学筛选的标准对细胞进 行筛选也能够分离出IPS细胞。 b.药物筛选 利用基因重组技术建立了具有 药物抗性基因的体细胞，并用特定药物进行筛选。 c.选用对多能性更为关键的基因（如Fbx25） 作为报告基因 原理是Fbx25对于多能性的维持 和胚胎的发育来说是不可缺少的基因
IPS细胞的鉴定

表观遗传状态鉴定: IPS细胞与ES细胞具有相似的DNA甲 基化模式和组蛋白修饰情况。IPS细胞中的 多能基因，如oct-4，Nanong等的启动子区 域CpG岛从高甲基化转变为类似ES细胞的低 甲基化状态。 IPS细胞的多能基因启动子区域具有与 ES细胞相同的高H3K4Me3及低H3K27Me3 水平。
载体的选择
质粒
普通质粒载体：需要 反复多次的质粒转染 来实现质粒携带基因 的持续表达，效率比 逆转录病毒载体低。 转座子：能够携带较 的整合片段，可以通 过转座子酶切除转座 子携带的外源基因。 附着体：提高重编程 效率，可croRNA:替代 了原癌基因，提 高了编程效率
人类疾病模型，病人特异的疾病及 药物筛选
IPS最大的特点是“患者特异性”及“疾病特 异性 ”，基于这两点。IPS细胞可以重现患者的疾 病发生，发展过程，可作为人类疾病发生 发展的机理，并筛选出患者特异的有效药 物，最终找到疾病治疗的切入点。
IPS细胞在疾病研究中的作用
重编程机理解析

以IPS技术为基础，筛选在体细胞重编程过 程中起关键作用的基因，蛋白和小分子化 合物，并利用这些物质相关的信号通路及 上下游相关因子揭示重编程的机理，为建 立体细胞重编程的新技术新方法，研究体 细胞去分化的机制开辟新思路。
Sox2:Sox2通常与Oct4结合形成Oct4/Sox2蛋 白复合体调控FGF4，UTF1等因子来维持ES 细胞的全能性。
转录因子
C-Myc:c-Myc是一种最容易过渡表现于人类的 致癌基因，它对某些成体干细胞的自我更 新起一定的作用，并可以抑制ES细胞的分 化。
转录因子
Klf4: Klf4上皮锌指转录因子Klf4 (旧称GKLF) 调节体外细胞的增生与分化 .
IPS细胞的鉴定

基因表达模式和发育潜能鉴定

ES和IPS细胞基因表达谱基本相同。IPS 细胞具有发育为三个胚层的能力，并能参 与生殖系的发育，这与ES细胞相同。
IPS细胞的鉴定

表面标志分子鉴定:
IPS细胞能够表达多能干细胞特异的表面标 志分子，如：ssea-1（阶段特异性胚胎抗原 1），ssea-3等。这些物质在已分化体细胞 表面不表达，从而鉴定。
转录因子
Nanog:对促分化基因的抑制方面发挥作用。
其他的转录因子
Lin28,SV40LargeT antigen,UTFI等等
IPS过程中转录因子的协同作用
在维持ES细胞特性相关的转录因子及染色质 调控相关的基因都受到Oct4,Sox2,Nanog和 其他多能相关因子的调控，并且这些调控 因子即能相互调控又能调控自身的表达， 这样就组成了一个复杂的调控网络。
诱导多功能干细胞技术的理论及基础
体细胞重编程现象：从Briggs和King通过核 移植的方法获得来自囊胚的克隆蝌蚪到克 隆羊“多莉”的诞生为已经分化了的细胞 能够去分化和重新编程提供大量证据。
诱导多功能干细胞技术的理论及基础
多能干细胞的特异调控网：Oct4,Sox2和 Nanog等构成调控网，通过对下游基因的激 活及抑制在维持ES细胞的多能性和自我更 新中发挥作用。