木瓜蛋白酶研究进展

食品酶学课程论文

题目木瓜蛋白酶研究进展

姓名孟超学号2010309110045 专业食品科学评分

中国·武汉

二○一○年一月

木瓜蛋白酶研究进展

摘要：木瓜蛋白酶是一类巯基蛋白酶，大量存在于木瓜乳汁中。对其组成成分、结构、制备、固定化、在非水介质中的特性及在医药上的用途等方面的研究进展进行了综述。

关键词：木瓜蛋白酶；固定化；医药用途

Abstract: Papain is a sulfhydry lprotease from the latex of the papaya fruit. The paper summarized the research development abou t it’s composition,structure, processing, immobilization, properties in non-aqueous medium and uasage in medicine.

Keywords: Papain; Immobilization; Uasage in medicine

前言

木瓜蛋白酶（Papain）简称木瓜酶，又称为木瓜酵素。是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。它是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。最适合PH值5.7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点18.75；最适合温度55～60℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。

1.木瓜蛋白酶的组分

工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。现已知经木瓜乳汁干燥而得的木瓜蛋白酶至少含有四种主要酶类：木瓜蛋白酶[EC 3.4.22.2](papain)、木瓜凝乳蛋白酶[EC 3.4.22.6](chymopapain)、木瓜蛋白酶Ω[EC 3.4.22.30](papaya proteinaseΩ，也称papaya peptidase A、papaya proteinase Ⅲ、earieain)、木瓜凝乳蛋白酶M [EC3．4．22．25](chymopapain M也称glycylendopeptidase、papaya

proteinase Ⅳ、Proteinase Gly-C)[1]。其中chymopapain的含量最多，占可溶蛋白的45%。其组分又最复杂，含十几种蛋白。但人们还是习惯根据其从离子交换柱出来的先后顺序分为木瓜凝乳蛋白酶A和木瓜凝乳蛋白酶B。

2.木瓜蛋白酶的结构

木瓜乳汁中四种已知半胱氨酸蛋白酶的一级结构具有高度同源性，其氨基酸数目和同源性比较如表1所示。除chymopapain含有8个半胱氨酸外，其余三种酶都只含有7个半胱氨酸。25位的巯基是活性位点，不参与二硫键的形成(chymopapain的117位巯基也不参与二硫键的形成)，其余巯基以相同的方式形成三个二硫键，具有同样的保守性。

人们在不同清晰度下得到了四种酶的X-射线结构。四种酶的肽链折叠方式相似，形成两个大小相同、构型不同的区域。一个是由a-螺旋构成的L-区，另一个是由大量反向平行的片层构成的R-区。活性位点氨基酸残基Cys25，Asnl79和His159就位于这些区域的表面，其中Cys25位于L-区起始a-螺旋上。木瓜蛋白酶家族的Cys25，Gly23，Gly65形成的S1亚部位是一个大口袋，对底物专一性影响较小；S2亚部位由于酶不同其氨基酸组成不同，几何形状亦不同，对酶的性质影响较大[2]。

3.木瓜蛋白酶的制备

木瓜蛋白酶是一种胞外酶，能分泌到乳汁中，所以直接将木瓜乳汁在55～60℃的条件下进行低温真空干燥或喷雾干燥，再经粉碎就可得到木瓜蛋白酶的粗品。为了避免木瓜蛋白酶失活，干燥前可在木瓜乳汁中加入适量的保护剂，保护木瓜蛋白酶中的活性巯基，常用的保护剂有EDTA、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠等。将粗品盐析后重结晶可得到稍加精制的木瓜蛋白酶。木瓜蛋白酶的粗品或稍加精制的产品就可直接用于工业生产。但对于在医药上用的木瓜蛋白酶则需要进一步的分离纯化。乙引等[3]对木瓜乳汁进行真空干燥，(NH)2S0沉淀和Sp-Sephadex50柱层析，分别得到了木瓜蛋白酶的粗品、精品和纯化酶，可以满足不同的需要。刘叶青等[4]采用无毒的絮凝剂fc-1与无机助凝剂fc-2对木瓜乳胶预处理，然后用中空纤维超滤膜进行超滤浓缩，使木瓜蛋白酶得到了有效的纯化。齐杰等[5]用一步SephadexG100凝胶层析即得到了一定比活的木瓜蛋白酶，总活力回收为106.2%。

4.木瓜蛋白酶的固定化

对木瓜蛋白酶固定化可以避免其在酸碱和有机介质中失活，实现酶的反复利用；在医药上用固定化的木瓜蛋白酶可以减小其副作用。常用的固定化方法有吸附、载体交联和包埋法。赵慕馨等[6]用壳聚糖为载体，戊二醛作为交联剂，采用载体交联法制备固定木瓜蛋白酶，其固定化酶的活力回收率平均达61.6%。郭刚军等[7]以褐藻酸钙凝胶为载体，用包埋法固定木瓜蛋白酶，用正交实验探讨了最佳的固定化条件，测定了固定化酶的催化特性和动力学性质，为工业运用打下了基础。现在人们不断的开发新型固定化载体和新方法，并取得了较好的效果。欧伶等[8]把木瓜蛋白酶偶联在对氨基苯磺酰乙基(ABSE)-交联琼脂上得到的固定化酶对尿素的稳定性较高。也有人以硅胶为载体，γ-环氧丙基三甲氧基硅烷为偶联剂来固定木瓜蛋白酶[9]。高居易等[10]等用对甲基苯磺酰氯活化微晶纤维后，与乙二胺反应向载体引入有机胺基团，再用戊二醛处理所得的二次活化载体可以再温和条件下固定木瓜蛋白酶。所得固定化酶活力为103U/g载体，与溶液酶比较，热稳定性有明显的提高。

5.木瓜蛋白酶在非水介质的特性

近年来非水相酶学得到了巨大发展，在有机介质中底物容易溶解，产物容易分离。木瓜蛋白酶是为数不多的在非水介质中表现出催化活性的蛋白酶，且具有较强的对应体选择性。Ke等[11]研究了在水一有机介质中影响木瓜蛋白酶稳定性的因素，发现除温度外，表面张力、搅拌速率、相体积比对酶的稳定性有显著的影响。Xue等[12]研究了用不同的方法和载体来固定木瓜蛋白酶，然后在有机溶剂中合成二肽，发现把木瓜蛋白酶固定在鸡蛋蛋白上其催化效率最高。Akihiro等[13]用木瓜蛋白酶来催化合成20(S)-喜树碱，其对底物的对应体选择性可达99%。6.木瓜蛋白酶的用途

6.1.食品工业应用

可利用酶促反应，使食品大分子的蛋白质水解成小分子肽或氨基酸。用于水解动植物蛋白、制成嫩肉粉、水解羊胎素、水解大豆、饼干松化剂、面条稳定剂、啤酒饮料澄清剂、高级口服液、保健食品、酱油酿造及酒类发酵剂等。有效转化蛋白质的利用，大大提高食品的营养价值，降低成本。有利于人体的消化和吸收。