第五章 亲和层析分离技术

第三组
Cibacron Blue F3-GA Procion Red HE3G Remazol Blue R Procion Yellow H-E6R
第四组
Procion Blue MXG Procion Organge MX-2R Procion Red MX-7B
第五组
Procion blue HERD Procion Green HE4BD Procion Red H-3B
基因专一性的大分子亲和配基
不同亲和层析分离方法的比较
参数
专一性
生物专一性 （AC）
很高
拟生物专一性配基亲和层析 IMAC DLAC HLAC
较高 中等
较高， 取决于吸附条件 对氧化物
容易 中等 高，可用浓或处理
配基交联技术
解吸难易 吸附容量 再生及稳定性
很多
中等 低，0.1-1.0%配 基利用 较差，易变性
空间源自文库阻， 疏水作用
5.4 常见的亲和层析
核苷酸及辅酶和层析 固定化金属离子亲和层析 染料亲和层析 免疫亲和层析 基团专一性大分子亲和层析 共价色谱

5.4.1 核苷酸及辅酶亲和层析
常见的核苷酸及辅酶亲和层析介质 配基分类 配基
腺苷3’，5’－环化单磷酸 （CAMP）
生产公司
介质的活化和偶联
多糖基质
溴化氰法，三嗪法 高碘酸盐法 环氧化物法 苯醌法 其他活化剂
多孔玻璃与硅胶 介质的活化和偶联 戊二醛法
肼法
聚丙烯酰胺基质
多糖基质
溴化氰法
多糖基质
三嗪法
多糖基质
高碘酸盐法
多糖基质
环氧化物法
多糖基质
苯醌法
多糖基质
其他方法——甲苯磺酰氯
聚丙烯酰胺基质
戊二醛法
聚丙烯酰胺基质
√ 非特异吸附小，基质化学性质应是惰性，表面 电荷尽可能低； √ 理化性质稳定，不因共价偶联反应的条件及吸 附条件的变化而发生变化； √ 基质必须能够活化或功能化
介质的选择
多糖类： 纤维素（cellulose）、葡聚糖（dextrin）
琼脂糖（agarose）
聚丙烯酰胺 无机基质 可控制孔径多孔玻璃（CPG）、 陶瓷和硅胶
第一组
Procion Blue MX-7RX Cibacron Blue 2-RA Procion Yellow MX-6G Remazol Organe 3R
第二组
Cibacron Brown 3GRA Procion Red MX-4R Procion Yellow MX4R Remazol Organe R
对正常的凝胶过滤色谱而言
VE V0 K d Vi
亲和色谱中，固定配基在蛋白和凝胶之间产 生的额外亲和作用
V V0 K V
' E
' d i
亲和层析的理论
K
' E
' d
E LM E1 E
V VE VE V0
LM
K lm
V E' LM V 1 K lm E
第五章 亲和层析技术
北京化工大学
谭天伟教授
亲和层析技术
5.1 5.2 5.3 5.4 简介 亲和层析理论 亲和层析介质活化 常见底亲和层析技术
5.1 简介
利用生物大分子之间的专一性识别性或特定的 相互作用的分离技术称为亲和层析分离技术
简介——亲和配基
单专一性的小分子配基 基团专一性小分子亲和配基 专一性的大分子亲和配基 免疫亲和配基
PL Biochemical SIGMA PL Biochemical SIGMA Pharmcia PL Biochemical PL Biochemical PL Biochemical PL Biochemical SIGMA PL Biochemical
典型应用
腺苷激酶及脱氨酸
腺苷
腺苷－3’，5’二磷酸（3’， 5’－ADP） 腺苷－5’－单磷酸（AMP） 腺苷－5’－三磷酸（AIP） 辅酶A（CoA）
O NH2 SO3H Cl N O NH NH N SO3H NH SO3H N
染料亲和层析
Procion Red H-E3B 结构图
HN N HO R HN N Cl OH3S SO3H Cl HO3S
SO3H
NH N
N
N N
NH
OH R
SO3H
其中R为:
N
N
染料亲和层析
染料配基和蛋白质作用大小排列
5.4.6 共价色谱
原理 （a）吸附过程；（b）洗脱过程；（c）再生过程
共价介质的合成 引入硫醇基
引入双硫键
共价色谱的吸附和解吸
1、上样预处理 2、吸附 吸附时间较长，柱子长度 检测 3、解吸 10－25 mM DTT（二硫苏糖醇）， 25－50mM 2－巯基乙醇，半胱氨酸
层析操作应用举例
① 从Jack Bean中分离尿素酶Urease ② 木瓜蛋白酶的分离纯化
亲和层析的理论
实际上，Ve’/Ve很难测定，但在洗脱液中， 加入可活性配基或竞争性抑制剂，使固定配基的 表边的亲和力降低，其数值可以测得
Kd Klm E E1 LM E1 LM
K1 EI EI
E1 I1 E1 I1
ki
亲和层析的理论
推导得到
VE' VE V0 LM K1 1 K k I V V E lm i E
在可溶性亲和竞争性配基的存在下，固定 配基对酶的阻滞作用降低，其程度取决于可溶 性配基和固定配基的相对浓度和解离常数。
5.3 亲和介质的制备
介质的选择 介质的活化和偶联 亲和配基固定偶联的密度的测定 间臂分子的选择
介质的选择
介质是亲和配基附着的基础，起着支撑和骨架作用
通常而言，亲和色谱的介质应具备下面四个条件： √ 具有多孔网络结构
依赖辅酶A的酶
磷酸化酶 激酶 CoA转移酶， 乙酸-CoA酶 5-核苷酸酶 核酸酶
辅酶
氧化型辅酶I（NAD＋） 氧化型辅酶Ⅱ（NADP＋）
核苷酸
鸟苷-5’-三磷酸
SIGMA
谷氨酸脱氢酶
核苷酸及辅酶亲和层析
N6（6-氨己基）氨甲酰-AMP-Sepharose间接偶联法示意图
核苷酸及辅酶亲和层析
核苷酸亲和层析的合成
亲和层析分离技术
亲和层析的理论 亲和介质的制备 常见的亲和层析
5.2 亲和层析的理论
当蛋白质在非凝胶相和凝胶相之间达到平衡
E E1 LM E LM
Kd Klm
Kd
E1 E
E1 LM K lm E LM
亲和层析的理论
5.4.4 免疫亲和层析
免疫亲和层析介质的制备
免疫亲和层析的吸附和解吸
免疫亲和层析
单抗和多抗的比较
比较项目 设备需求 手工时间 抗体数量 提供的持久性 抗体质量 单抗 多 多 大 长期 高 多抗 简单 少 中等 短 低
亲和专一性
可高可低
多数专一性高
5.4.5 基团专一性大分子亲和层析
Protein A 亲和层析 Ig G抗体 解吸：1M acetate buffer 0.1 M glyceicine HCl buffer Con A 亲和层析 糖蛋白：免疫球蛋白，IgM 低密度酯蛋白 肝素亲和层析
肼法
多孔玻璃与硅胶
亲和配基固定偶联的密度的测定
分光光度法 重量差法分析 水解作用分析 元素分析法

间臂分子的选择
由于生物大分子的空间结构及层析介质本身 孔结构的因素，往往在配基和基质骨架之间引入 一个间臂分子，可显著地提高配基的空间利用度， 即提高吸附容量。 间臂分子的引入时要考虑两个因素：
碳二亚胺直接法偶联
间接偶联法
核苷酸亲和层析的吸附和解吸
5.4.2 固定化金属离子亲和层析


螯和基团和金属离子的选择 亲和层析介质的合成 固定化金属离子亲和层析的 吸附和解吸条件
5.4.3 染料亲和层析
染料亲和层析介质的制备
蛋白质的吸附和解吸
染料亲和层析
Cibacron Blue F3G-A 结构图
③ POI和GIT（protein disulphide isomerose）和
（glutathiose insulm tramchydrogerac）的分离
环氧化物
容易 高 高
直接吸附或
化学 交联容易 高 高
成本
高
较低
最低
较低
简介——亲和洗脱
亲和洗脱是和亲和吸附（ Affinity Adsorption ）对应的， 即利用在洗脱液中加入和吸附目标蛋白有专一性的物质， 而只将目标分子解吸下来。亲和洗脱可用于亲和层吸，也 可以用于普通的层析如离子交换等的解吸。亲和洗脱一般 采用和目标分子具有识别性的小分子或类似物。
介质的选择
专一性（Specifcity）、容量（capacity）及稳定 性（stability）是衡量所选介质好坏的三个标准 用于分析时，专一性比容量及稳定性重要，而 应用制备时，吸附剂的稳定性是最主要的指标，同 时还要考虑成本因素。对于不同的介质而言，这些 要求不可能同时满足。所以在介质的选取时，应该 根据具体的分离要求选择合适的介质。