第五章 发酵工业的种子制备
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第五章 发酵工业的种子制备
本章主要内容
种子制备原理与技术 影响种子质量的因素 种子质量的控制措施 举例：细菌、酵母、放线菌和丝状真 菌的种子扩大培养
为什么要进行 种子扩大培养？ 种子扩大培养？
目的
满足发酵罐接种的要求——提供足够数量 的种子 缩短发酵时间，提高发酵罐利用率——种 子活力旺盛、数量足够 菌种驯化的需要——菌种经培养后能很快 适应发酵液的环境
链霉素生产中，斜面孢子在6℃冷藏两 个月后的发酵单位比冷藏一个月的降低18％， 比冷藏3个月的降低35％。
通气与搅拌
足够的通气量，以保证菌种代谢正常，提 高种子的质量 搅拌可提高通气效果，促进生长繁殖，过 度搅拌导致培养液大量涌泡，液膜表面的 酶易氧化变性，泡沫过多增加染菌机会， 增加能耗。 丝状微生物不宜剧烈搅拌。
种子液生化分析项目主要有：营养基质的消 耗速度、pH变化、溶氧变化、色泽和气味等
种子制备的放大原理与技术
细菌发酵时的种子扩大培养； 细菌发酵过程中种子扩大培养的主要目的 是为了获得大量的活力强的种子 ； 种龄对于生芽孢的种子尤其重要。若接种 物含大量芽孢，将给后续发酵带来较长迟 滞期
举 例：
梭状芽孢杆菌发酵丁醇－丙酮时种子扩大培养的程序
种子制备过程
实验室种子制备阶段：琼脂斜面 斜面至固体 斜面 培养基扩大培养（如茄子瓶斜面培养等) 摇瓶培养 或液体摇瓶 摇瓶 生产车间种子制备阶段：种子罐 种子罐扩大培 种子罐 养
实验室种子制备
保藏菌种经无菌接种接入适合于孢子发芽 或菌丝生长的斜面培养基中，经培养成熟后挑 选菌落正常的孢子可再一次接入试管斜面。
pH 值
选择最适种子培养pH的原则是获得最大 比生长速率和适当的菌量 培养最后一级种子的培养基的pH应接近 于发酵培养基的pH，以便种子能尽快适 应新的环境
3.种子质量的控制措施
菌种稳定性的检查 测定其生产能力，从中挑选高产菌株， 并及时对退化菌种进行复壮 提供适宜的生长环境 种子无杂菌检查，保证纯种发酵
例：青霉素生产菌种
孢子悬 浮液 一级种子罐
（27℃，40h） ）
二级种子罐
（27℃， 10-24h） ）
发酵罐
二级种子扩大培养， 二级种子扩大培养，也称三级发酵 通常50m3发酵罐都采用三级发酵
种子罐级数的确定
种子扩大的级数：制备种子需逐级扩大培 养的次数 级数愈少，愈利于简化工艺及控制，并可 减少种子罐污染杂菌的机会，减少消毒及 值班工作量，减少因种子罐生长异常而造 成的发酵波动。
例：青霉素生产菌种
孢子悬浮液
（4-14h） 14h）
一级种子罐
（27℃，40h） ）
二级种子罐
（27℃， 10-24h） ）
发酵罐
实验室种子 制备
孢子进罐法
★ 不产孢子的细菌：获得一定数量和质量的菌体 菌体
保藏斜面
活化斜面
摇瓶培养
种子罐
如生产谷氨酸的棒状杆菌属、短杆菌属
例：谷氨酸棒杆菌
斜面菌种于32℃，培养18~24h 斜面菌种 茄子瓶斜面培养基/1000mL 250mL茄子瓶斜面培养基 茄子瓶斜面培养基 摇瓶液体培养基，32℃培养12h 摇瓶液体培养基 种子罐
大接种量的优点：
缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周 期，提高了设备利用率 生产菌迅速占领整个培养环境，有利于减少 染菌机会
缺点：菌丝生长块，易造成溶氧不足而影 响生产
2.影响种子质量的因素 影响种子质量的因素
种子质量的优劣，主要取决于菌种本身的 遗传特性和培养条件
原材料质量
原材料质量波动引起种子质量不稳定 例：麸皮原料、大米、小米原料等 原材料质量波动的主要原因：无机离子含 量不同（微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺 激孢子的形成，磷含量太多或太少也会影 响孢子的质量） 氮源类型的影响
利用孢子作为接种物
在固化的培养基上产生孢子 “滚瓶”技术应用于产黄青霉的孢子生产 在固体培养基上产生孢子 在谷类的颗粒表面形成大量的孢子 在液体深层培养基中产生孢子 灰黄霉素产生菌展青霉一试验表明在良好的 通气条件下，培养基中含氮是在0.05～0.1％ （w/v）之间时，可以产生大量的孢子
丝状真菌的菌丝体作为接种物
其他参数，如接种前酶活、种子罐的溶氧 和尾气等
种龄与接种量
接种龄
种子罐中培养的菌体移入下一级种子罐或发酵罐时的 培养时间 接Байду номын сангаас龄以处于对数生长期的菌丝最为合适。菌种过嫩 或过老，不但延长发酵周期，而且会降低产量。 细菌最适接种龄7-24h，霉菌16-50h，放线菌2164h，同一菌种不同批次培养，得到的种子质量也不完 全一致。
孢子培养时间
对孢子的质量有较大影响 过于年轻的孢子经不起冷藏， 过于年轻的孢子经不起冷藏，过于衰老的孢子导致生产能 力下降
土霉素菌种斜面培养4天，孢子尚未完全成 熟，冷藏7-8天菌丝开始自溶；若 培养5天，孢子完全成熟，冷藏20天也不自 溶。
孢子冷藏时间
对孢子的生产能力有较大影响 冷藏时间越长，生产能力下降越多
★ 产孢子能力强或孢子发芽、生长繁殖迅速的菌
种，可直接把孢子作为种子罐的种子，这样操作简 便、不宜污染。
生产车间种子制备
种子罐的作用： 种子罐的作用 使孢子瓶中有限数量的孢子发芽 生长并繁殖 孢子发芽、生长并繁殖 孢子发芽 生长并繁殖成 大量菌丝体，接入发酵培养基后能迅速生长，达 大量菌丝体 到一定菌体量，以利于产物的合成。 种子罐的培养基： 种子罐的培养基 •采用易被菌利用的成分，如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等 •供给足够的无菌空气，并不断搅拌
多、状、稳、纯
1. 种子制备原理与技术
种子扩大培养：将保存在砂土管、 种子扩大培养：将保存在砂土管、冷冻干燥 管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面 管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面 活化后 再经过摇瓶及种子罐逐级扩大 逐级扩大培养 活化后，再经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养 而获得一定数量 质量的纯种过程 数量和 的纯种过程。 而获得一定数量和质量的纯种过程。 一个由实验室制备到车间生产的过程
★
产孢子能力强的，及孢子发芽、生长繁殖快的菌种：
固体培养基培养孢子 孢子，孢子可直接作为种子罐的种子。 固体培养基 孢子 如生产青霉素的产黄青霉菌
★ 产孢子能力不强的，或孢子发芽慢的菌种：
可用摇瓶液体培养法 摇瓶液体培养法，获得菌丝体 菌丝体，作为种子。 摇瓶液体培养法 菌丝体 如产链霉素的灰色链霉菌、产卡那霉素的卡那霉菌
种子罐级数的确定方法
菌种的性质(如菌种传代后的稳定性) 菌种的性质(如菌种传代后的稳定性) 瓶中的孢子数， 瓶中的孢子数，孢子发芽及菌丝繁殖速度 发酵罐中种子培养液的最低接种量 种子罐与发酵罐的容积比 生产规模 随工艺条件的改变作适当的调整
总结： 总结：种子扩培 ——实验室种子制备 ——实验室种子制备
——生产车间种子制备 ——生产车间种子制备
实验室制备的孢子斜面或摇瓶种子移接到 种子罐进行扩大培养 种子罐 种子罐培养
获得足够的菌种数量， 种子罐的培养基接近发酵罐培养的醪液成分 和培养条件，使菌体适应发酵环境
种子质量的判断方法
通常检测的培养液中参数 pH是否在种子要求的范围之内 糖、氨基氮、磷酸盐的含量 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观 有无杂菌污染
种子罐级数：
制备种子需逐级扩大培养的次数。 制备种子需逐级扩大培养的次数。
一级种子罐扩大培养 一级 二级发酵 三级发酵 四级发酵
二级种子罐扩大培养（发芽罐、繁殖罐） 二级 三级种子罐扩大培养：生长更慢的菌种 三级
一级发酵：在小型发酵罐(5~30L)中进行试验时，直接采 一级 用孢子或菌丝体接入罐中发酵
不同湿度下的土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子
相对湿度 （%） 16.5-19 25-36 40-45 斜面外观 上部稀薄、下部稠， 略黄 上部薄、中部均匀发 白 一片白，孢子丰富， 稍皱 活孢子计数 （亿/支） 1.2 2.3 5.7
气温高、湿度大的地方，斜面孢子长得 慢，是由于试管下部冷凝水较多，不利 于孢子的形成。
种子罐
发酵罐
2.5-5% 20% 0.0025% 0.11% 0.03% 0.025% 0.025% 2% 10% 0.5% 22-28%
琼脂 薯干粉 (NH4)2SO4
种子培养基特点
有较完全和丰富的营养物质，糖分少，需 充足氮源和生长因子，无机氮源比例大；
各种营养物质的浓度不必太高； 供孢子用的种子培养基，可添加易被吸收利用 的碳源和氮源； 应考虑与发酵培养基的主要成分相近
酵母发酵时的种子扩大培养
酿酒酵母的扩大培养
最初采用纯种进行酵母发酵并设计出酵母繁 殖流程，他将每一步的接种量规定为10％， 并控制繁殖条件与酿造时一致 现代的流程中，接种量为1%或更低，控制的 条件也与酿造时不同。
面包酵母时的种子扩大培养的程序
丝状真菌发酵的种子扩大培养
丝状真菌既可以利用孢子，也可以 利用菌丝体作为接种物接种到发酵 罐进行发酵
种子扩培
步骤： 步骤： 斜面培养基中活化； 斜面培养基中活化； 扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培养， 扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培养，完 实验室种子制备； 成实验室种子制备； 一级种子罐，制备生产用种子； 一级种子罐，制备生产用种子；视情况确定扩 大级数，完成生产车间种子制备 生产车间种子制备； 大级数，完成生产车间种子制备； 种子转种至发酵罐
优良种子应具备的条件
生长活力强，延迟期短； 生长活力强，延迟期短； 生理状态稳定； 生理状态稳定； 浓度及总量能满足发酵罐接种量的要求; 浓度及总量能满足发酵罐接种量的要求; 无杂菌污染，保证纯种发酵； 无杂菌污染，保证纯种发酵； 适应性强， 适应性强，生产能力稳定
种子扩大培养应根据菌种的生理特性，选 择合适的培养条件来获得代谢旺盛、数量 获得代谢旺盛、 获得代谢旺盛 足够的种子。这种种子接入发酵罐后，将 足够的种子 使发酵生产周期缩短 设备利用率提高 发酵生产周期缩短，设备利用率提高 发酵生产周期缩短 设备利用率提高。
培养基
营养成分丰富、完全，有利于孢子发芽和菌 丝生长；氮源和维生素含量高，使菌丝体粗 壮、活力强； 营养成分尽量和发酵培养基接近，种子容易 适应发酵罐的生长条件，利于发酵 种子培养基浓度低于发酵培养基
黑曲霉发酵生产柠檬酸
成分 麦芽汁 蔗糖
NH4NO3 K2HPO4 MgSO47H2O
斜面 麦芽汁
保藏斜面 分离培养基
培养温度
温度过低， 温度过低，菌种生长发育缓慢 温度过高会使菌丝过早自溶
在制备土霉素生产种子过程中，高于37℃培养时，孢 子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨基氮回升 提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。
湿度
湿度低，孢子生长快； 湿度大，孢子生长慢
制备土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子时 发现，在含有少量水分的试管斜面培养基下 部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速 蒸发呈干瘪状，孢子稀少
在放射形土壤杆菌多糖（ARPS） 发酵过程中不同的接种量对多糖产量的影响
采用较大的接种量 较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖到 较大的接种量 达高峰的时间，使产物的形成提前到来。但若接 种量过多，往往使菌丝生长过快，培养液粘度增 加，造成溶氧不足，而影响产物的合成。 接种量过小，延长发酵周期，往往还会引起其他 接种量过小 不正常情况。 生产中，在保证高产的情况下尽量用大接种量 大接种量
不能产生无性孢子的用繁殖体菌丝作为接 种物，如生产赤霉素的菌种——藤仓赤霉 问题：难以获得均一的接种物 接种前将菌丝打成碎片，形成大量的菌丝 段，它具有大量的生长点
放射形土壤杆菌多糖（ARPS） 发酵过程中不同的接种龄对多糖产量的影响
种龄和接种量
接种量： 接种量：移入的种子液体积和接种后培养液体的体 积的比例
大多数抗生素发酵：7~15% ，有时可达20~25% 有机酸发酵：10% 谷氨酸发酵（棒状杆菌）：1% 肌苷酸发酵1.5~2% 制霉菌素发酵0.1~1%
无菌方式接保藏的菌种至斜面培养基上，成熟后 挑选正常菌落至试管斜面和摇瓶。 菌种产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖迅速， 可用固体培养基培养孢子 菌种产孢子能力不强或孢子发芽慢，可用摇瓶液 体培养法 不产孢子的菌种，保藏基础上，在一定温度下活 化即可
——实验室种子制备 实验室种子制备
液体培养法：液体试管、三角瓶摇床振荡或回旋 式培养。 表面培养法：茄子瓶、克氏瓶或瓷盘培养。 固体培养法：三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶、培养皿 等麸皮培养。
本章主要内容
种子制备原理与技术 影响种子质量的因素 种子质量的控制措施 举例：细菌、酵母、放线菌和丝状真 菌的种子扩大培养
为什么要进行 种子扩大培养？ 种子扩大培养？
目的
满足发酵罐接种的要求——提供足够数量 的种子 缩短发酵时间，提高发酵罐利用率——种 子活力旺盛、数量足够 菌种驯化的需要——菌种经培养后能很快 适应发酵液的环境
链霉素生产中，斜面孢子在6℃冷藏两 个月后的发酵单位比冷藏一个月的降低18％， 比冷藏3个月的降低35％。
通气与搅拌
足够的通气量，以保证菌种代谢正常，提 高种子的质量 搅拌可提高通气效果，促进生长繁殖，过 度搅拌导致培养液大量涌泡，液膜表面的 酶易氧化变性，泡沫过多增加染菌机会， 增加能耗。 丝状微生物不宜剧烈搅拌。
种子液生化分析项目主要有：营养基质的消 耗速度、pH变化、溶氧变化、色泽和气味等
种子制备的放大原理与技术
细菌发酵时的种子扩大培养； 细菌发酵过程中种子扩大培养的主要目的 是为了获得大量的活力强的种子 ； 种龄对于生芽孢的种子尤其重要。若接种 物含大量芽孢，将给后续发酵带来较长迟 滞期
举 例：
梭状芽孢杆菌发酵丁醇－丙酮时种子扩大培养的程序
种子制备过程
实验室种子制备阶段：琼脂斜面 斜面至固体 斜面 培养基扩大培养（如茄子瓶斜面培养等) 摇瓶培养 或液体摇瓶 摇瓶 生产车间种子制备阶段：种子罐 种子罐扩大培 种子罐 养
实验室种子制备
保藏菌种经无菌接种接入适合于孢子发芽 或菌丝生长的斜面培养基中，经培养成熟后挑 选菌落正常的孢子可再一次接入试管斜面。
pH 值
选择最适种子培养pH的原则是获得最大 比生长速率和适当的菌量 培养最后一级种子的培养基的pH应接近 于发酵培养基的pH，以便种子能尽快适 应新的环境
3.种子质量的控制措施
菌种稳定性的检查 测定其生产能力，从中挑选高产菌株， 并及时对退化菌种进行复壮 提供适宜的生长环境 种子无杂菌检查，保证纯种发酵
例：青霉素生产菌种
孢子悬 浮液 一级种子罐
（27℃，40h） ）
二级种子罐
（27℃， 10-24h） ）
发酵罐
二级种子扩大培养， 二级种子扩大培养，也称三级发酵 通常50m3发酵罐都采用三级发酵
种子罐级数的确定
种子扩大的级数：制备种子需逐级扩大培 养的次数 级数愈少，愈利于简化工艺及控制，并可 减少种子罐污染杂菌的机会，减少消毒及 值班工作量，减少因种子罐生长异常而造 成的发酵波动。
例：青霉素生产菌种
孢子悬浮液
（4-14h） 14h）
一级种子罐
（27℃，40h） ）
二级种子罐
（27℃， 10-24h） ）
发酵罐
实验室种子 制备
孢子进罐法
★ 不产孢子的细菌：获得一定数量和质量的菌体 菌体
保藏斜面
活化斜面
摇瓶培养
种子罐
如生产谷氨酸的棒状杆菌属、短杆菌属
例：谷氨酸棒杆菌
斜面菌种于32℃，培养18~24h 斜面菌种 茄子瓶斜面培养基/1000mL 250mL茄子瓶斜面培养基 茄子瓶斜面培养基 摇瓶液体培养基，32℃培养12h 摇瓶液体培养基 种子罐
大接种量的优点：
缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周 期，提高了设备利用率 生产菌迅速占领整个培养环境，有利于减少 染菌机会
缺点：菌丝生长块，易造成溶氧不足而影 响生产
2.影响种子质量的因素 影响种子质量的因素
种子质量的优劣，主要取决于菌种本身的 遗传特性和培养条件
原材料质量
原材料质量波动引起种子质量不稳定 例：麸皮原料、大米、小米原料等 原材料质量波动的主要原因：无机离子含 量不同（微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺 激孢子的形成，磷含量太多或太少也会影 响孢子的质量） 氮源类型的影响
利用孢子作为接种物
在固化的培养基上产生孢子 “滚瓶”技术应用于产黄青霉的孢子生产 在固体培养基上产生孢子 在谷类的颗粒表面形成大量的孢子 在液体深层培养基中产生孢子 灰黄霉素产生菌展青霉一试验表明在良好的 通气条件下，培养基中含氮是在0.05～0.1％ （w/v）之间时，可以产生大量的孢子
丝状真菌的菌丝体作为接种物
其他参数，如接种前酶活、种子罐的溶氧 和尾气等
种龄与接种量
接种龄
种子罐中培养的菌体移入下一级种子罐或发酵罐时的 培养时间 接Байду номын сангаас龄以处于对数生长期的菌丝最为合适。菌种过嫩 或过老，不但延长发酵周期，而且会降低产量。 细菌最适接种龄7-24h，霉菌16-50h，放线菌2164h，同一菌种不同批次培养，得到的种子质量也不完 全一致。
孢子培养时间
对孢子的质量有较大影响 过于年轻的孢子经不起冷藏， 过于年轻的孢子经不起冷藏，过于衰老的孢子导致生产能 力下降
土霉素菌种斜面培养4天，孢子尚未完全成 熟，冷藏7-8天菌丝开始自溶；若 培养5天，孢子完全成熟，冷藏20天也不自 溶。
孢子冷藏时间
对孢子的生产能力有较大影响 冷藏时间越长，生产能力下降越多
★ 产孢子能力强或孢子发芽、生长繁殖迅速的菌
种，可直接把孢子作为种子罐的种子，这样操作简 便、不宜污染。
生产车间种子制备
种子罐的作用： 种子罐的作用 使孢子瓶中有限数量的孢子发芽 生长并繁殖 孢子发芽、生长并繁殖 孢子发芽 生长并繁殖成 大量菌丝体，接入发酵培养基后能迅速生长，达 大量菌丝体 到一定菌体量，以利于产物的合成。 种子罐的培养基： 种子罐的培养基 •采用易被菌利用的成分，如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等 •供给足够的无菌空气，并不断搅拌
多、状、稳、纯
1. 种子制备原理与技术
种子扩大培养：将保存在砂土管、 种子扩大培养：将保存在砂土管、冷冻干燥 管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面 管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面 活化后 再经过摇瓶及种子罐逐级扩大 逐级扩大培养 活化后，再经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养 而获得一定数量 质量的纯种过程 数量和 的纯种过程。 而获得一定数量和质量的纯种过程。 一个由实验室制备到车间生产的过程
★
产孢子能力强的，及孢子发芽、生长繁殖快的菌种：
固体培养基培养孢子 孢子，孢子可直接作为种子罐的种子。 固体培养基 孢子 如生产青霉素的产黄青霉菌
★ 产孢子能力不强的，或孢子发芽慢的菌种：
可用摇瓶液体培养法 摇瓶液体培养法，获得菌丝体 菌丝体，作为种子。 摇瓶液体培养法 菌丝体 如产链霉素的灰色链霉菌、产卡那霉素的卡那霉菌
种子罐级数的确定方法
菌种的性质(如菌种传代后的稳定性) 菌种的性质(如菌种传代后的稳定性) 瓶中的孢子数， 瓶中的孢子数，孢子发芽及菌丝繁殖速度 发酵罐中种子培养液的最低接种量 种子罐与发酵罐的容积比 生产规模 随工艺条件的改变作适当的调整
总结： 总结：种子扩培 ——实验室种子制备 ——实验室种子制备
——生产车间种子制备 ——生产车间种子制备
实验室制备的孢子斜面或摇瓶种子移接到 种子罐进行扩大培养 种子罐 种子罐培养
获得足够的菌种数量， 种子罐的培养基接近发酵罐培养的醪液成分 和培养条件，使菌体适应发酵环境
种子质量的判断方法
通常检测的培养液中参数 pH是否在种子要求的范围之内 糖、氨基氮、磷酸盐的含量 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观 有无杂菌污染
种子罐级数：
制备种子需逐级扩大培养的次数。 制备种子需逐级扩大培养的次数。
一级种子罐扩大培养 一级 二级发酵 三级发酵 四级发酵
二级种子罐扩大培养（发芽罐、繁殖罐） 二级 三级种子罐扩大培养：生长更慢的菌种 三级
一级发酵：在小型发酵罐(5~30L)中进行试验时，直接采 一级 用孢子或菌丝体接入罐中发酵
不同湿度下的土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子
相对湿度 （%） 16.5-19 25-36 40-45 斜面外观 上部稀薄、下部稠， 略黄 上部薄、中部均匀发 白 一片白，孢子丰富， 稍皱 活孢子计数 （亿/支） 1.2 2.3 5.7
气温高、湿度大的地方，斜面孢子长得 慢，是由于试管下部冷凝水较多，不利 于孢子的形成。
种子罐
发酵罐
2.5-5% 20% 0.0025% 0.11% 0.03% 0.025% 0.025% 2% 10% 0.5% 22-28%
琼脂 薯干粉 (NH4)2SO4
种子培养基特点
有较完全和丰富的营养物质，糖分少，需 充足氮源和生长因子，无机氮源比例大；
各种营养物质的浓度不必太高； 供孢子用的种子培养基，可添加易被吸收利用 的碳源和氮源； 应考虑与发酵培养基的主要成分相近
酵母发酵时的种子扩大培养
酿酒酵母的扩大培养
最初采用纯种进行酵母发酵并设计出酵母繁 殖流程，他将每一步的接种量规定为10％， 并控制繁殖条件与酿造时一致 现代的流程中，接种量为1%或更低，控制的 条件也与酿造时不同。
面包酵母时的种子扩大培养的程序
丝状真菌发酵的种子扩大培养
丝状真菌既可以利用孢子，也可以 利用菌丝体作为接种物接种到发酵 罐进行发酵
种子扩培
步骤： 步骤： 斜面培养基中活化； 斜面培养基中活化； 扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培养， 扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培养，完 实验室种子制备； 成实验室种子制备； 一级种子罐，制备生产用种子； 一级种子罐，制备生产用种子；视情况确定扩 大级数，完成生产车间种子制备 生产车间种子制备； 大级数，完成生产车间种子制备； 种子转种至发酵罐
优良种子应具备的条件
生长活力强，延迟期短； 生长活力强，延迟期短； 生理状态稳定； 生理状态稳定； 浓度及总量能满足发酵罐接种量的要求; 浓度及总量能满足发酵罐接种量的要求; 无杂菌污染，保证纯种发酵； 无杂菌污染，保证纯种发酵； 适应性强， 适应性强，生产能力稳定
种子扩大培养应根据菌种的生理特性，选 择合适的培养条件来获得代谢旺盛、数量 获得代谢旺盛、 获得代谢旺盛 足够的种子。这种种子接入发酵罐后，将 足够的种子 使发酵生产周期缩短 设备利用率提高 发酵生产周期缩短，设备利用率提高 发酵生产周期缩短 设备利用率提高。
培养基
营养成分丰富、完全，有利于孢子发芽和菌 丝生长；氮源和维生素含量高，使菌丝体粗 壮、活力强； 营养成分尽量和发酵培养基接近，种子容易 适应发酵罐的生长条件，利于发酵 种子培养基浓度低于发酵培养基
黑曲霉发酵生产柠檬酸
成分 麦芽汁 蔗糖
NH4NO3 K2HPO4 MgSO47H2O
斜面 麦芽汁
保藏斜面 分离培养基
培养温度
温度过低， 温度过低，菌种生长发育缓慢 温度过高会使菌丝过早自溶
在制备土霉素生产种子过程中，高于37℃培养时，孢 子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨基氮回升 提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。
湿度
湿度低，孢子生长快； 湿度大，孢子生长慢
制备土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子时 发现，在含有少量水分的试管斜面培养基下 部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速 蒸发呈干瘪状，孢子稀少
在放射形土壤杆菌多糖（ARPS） 发酵过程中不同的接种量对多糖产量的影响
采用较大的接种量 较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖到 较大的接种量 达高峰的时间，使产物的形成提前到来。但若接 种量过多，往往使菌丝生长过快，培养液粘度增 加，造成溶氧不足，而影响产物的合成。 接种量过小，延长发酵周期，往往还会引起其他 接种量过小 不正常情况。 生产中，在保证高产的情况下尽量用大接种量 大接种量
不能产生无性孢子的用繁殖体菌丝作为接 种物，如生产赤霉素的菌种——藤仓赤霉 问题：难以获得均一的接种物 接种前将菌丝打成碎片，形成大量的菌丝 段，它具有大量的生长点
放射形土壤杆菌多糖（ARPS） 发酵过程中不同的接种龄对多糖产量的影响
种龄和接种量
接种量： 接种量：移入的种子液体积和接种后培养液体的体 积的比例
大多数抗生素发酵：7~15% ，有时可达20~25% 有机酸发酵：10% 谷氨酸发酵（棒状杆菌）：1% 肌苷酸发酵1.5~2% 制霉菌素发酵0.1~1%
无菌方式接保藏的菌种至斜面培养基上，成熟后 挑选正常菌落至试管斜面和摇瓶。 菌种产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖迅速， 可用固体培养基培养孢子 菌种产孢子能力不强或孢子发芽慢，可用摇瓶液 体培养法 不产孢子的菌种，保藏基础上，在一定温度下活 化即可
——实验室种子制备 实验室种子制备
液体培养法：液体试管、三角瓶摇床振荡或回旋 式培养。 表面培养法：茄子瓶、克氏瓶或瓷盘培养。 固体培养法：三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶、培养皿 等麸皮培养。