第五讲 基因定点诱变 PCR技术
定点诱变技术
How DNA shuffling works ？
一、单基因和基因家族的重组装
Single gene shuffling
. .. . ....... library of point mutants
Similar mutants generated by error-prone PCR, random and site-directed mutagenesis
在正常情况下，尿嘧啶Ｎ-糖基化酶(ung+)可以去除掺 入DNA中的尿嘧啶残基。但 在ung-的菌株中，此酶失活。
在大肠杆菌dut- ung-菌株 中生长的M13噬菌体的单链基 因组DNA中将含有20-30个尿 嘧啶残基。用这些噬菌体感染 ung+菌株，尿嘧啶被迅速去 除，DNA链遭到破坏，感染 力下降约5个数量级。
牛乳糖酶到岩藻糖苷酶的直接进化（JI-HU ZHANG等，1997）
How DNA shuffling works ？
二、随机引物PCR(RPR)和重组装
多功能氧化酶的定向进化 （Hikaru Suenaga等,2001）
How DNA shuffling works ？
三、交错延伸PCR突变法(StEP)
枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化 （Huimin Zhao等，1999）
进化的热稳定性枯草芽孢杆菌蛋白酶E的突变谱系
正面
反面
进化后的枯草杆菌蛋白酶E
芽孢杆菌脲酸酶的定向 进化 （Su-Hua Huang等,2004）
定点突ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的研究意义
1.对调控区进行突变
研究基因结构与功能之间的关系
2. 对编码基因进行突变
PCR介导的基因突变
在基因5’和3’末端产生突变 重叠延伸PCR 大引物PCR法
pcr定点突变技术原理
pcr定点突变技术原理
PCR定点突变技术是指基于聚合酶链反应技术和脱氧核糖核酸（DNA）技术，通过检测特定位点的特定DNA序列，以及该特定位点在
基因突变中发生变化的方法。
该技术通过引入多个PCR扩增特定序列，并在PCR产物中检测突变位点。
整个PCR定点突变分析流程包括：DNA
提取、PCR扩增、筛选、突变检测、数据分析等步骤。
第一步，先从患
者的脱氧核糖核酸（DNA）样本中取出要检测特定位点的特定DNA序列；第二步，涉及倍性引物的PCR扩增得到的DNA复制物，称为弧菌状病
毒（HCV）；第三步，以线性化步骤将弧菌状病毒和分子材料分离出来，生成紫外可见化质粒，只保留差异片段；第四步，读取所有特征模式，以获得有效的特征模式，以及发现相关的突变和多态性；第五步，通
过对所有样本进行数据挖掘来识别单项显著突变，以确定检测突变位
点的实验结果。
PCR定点突变技术是一种快速、准确的技术，使得迅速检测基因变
异和检测新发现的个体基因变异变得可能，完成病原菌或其他物质的
突变检测，为基因治疗、基因疾病的诊断和治疗，基因改造有重要的
应用前景。
第五讲基因定点诱变PCR技术
所用酶类
T4噬菌体聚合酶：诱变几率65% T7噬菌体聚合酶：3‘-5’外切活性强，持
续合成DNA的能力强，遇到引物时会停 止。诱变几率83% KlenowDNA聚合酶：前端有引物或双链 时，可能会替换。诱变几率36%
影响因素
1 引物：热动力学（配对），突变碱基 的左右8-10bp
1.1×10-4 substitutions per cycle >0.5mM<10mM 5’ to 3’only 5’ adenosines
PCR引物： 与待扩增的靶DNA区段两端序列互补 的人工合成的寡核苷酸片断。
1.其长度通常在15~30个核苷酸之间。 2.简并引物 atggctant… 3.嵌套引物
2 T4连接酶 3 5’端磷酸化 4 单链结合蛋白：解决颈环结构
基因扩增（gene amplification）
主要内容： 1.体外扩增 2.通过体外重组和转化，将目的基因在宿
主细胞进行扩增 3.在环境作用下，生物体内相关基因的扩
增。 4.程序基因扩增 5.进化过程中的基因扩增
PCR技术
Origin
Thermus aquaticus strain YT1
Molecular weight
94 kd
Optimal temperature 72--80℃
Activity
150 nucleotides/sec/molecule
Stability
>50% at 95℃ for 40 min
Fidelity Mg2+ concentration Exonuclease activity Transferase activity
1× 29× 1×
《定点诱变技术》课件
本课程将介绍定点诱变技术的原理、实验步骤、应用案例和未来展望，以及 它对人类社会的影响和挑战。
概述
什么是定点诱变技术？
定点诱变技术是一种精准编辑基因术？
传统的基因编辑技术往往是非特异性的，不能达到精准编辑的效果，而定点诱变技术可以 避免对非目标区域的影响。
实验步骤
1
实验前的准备工作
首先需要构建引导RNA分子、购买
细胞培养与转染
2
Cas9核酸酶，以及筛选细胞线等。这 些都需要提前准备。
将引物与Cas9，利用转染技术导入到
目标细胞中，完成复合物的构建。
3
PCR扩增和测序
利用PCR扩增技术检测目标基因组位
置是否发生了修饰，并对其进行测序，
数据分析和结果解读
定点诱变技术的应用领域
定点诱变技术可以应用于基础科研、农业生产、医疗诊断等领域，为人类社会带来了诸多 益处。
基本原理
基于CRISPR-Cas9技术实 现的定点诱变
CRISPR-Cas9技术可以在基因 组中精准识别目标区域，并将 核酸酶Cas9导入到目标位置， 再通过引导RNA分子的作用， 完成对基因组上的目标位点的 修饰。
定点诱变技术可能会带来一系 列的伦理、法律和社会问题， 例如导致人们撕裂不和，社会 不公等问题。
定点诱变技术未来发展 的瓶颈和解决方案
目前，定点诱变技术在某些肿 瘤细胞和人类胚胎细胞中并没 有得到广泛应用，需要进一步 研究，探索更为高效、精准、 安全的定点诱变技术。
4
验证修饰深度和准确性。
对PCR扩增和测序的数据进行分析， 解读实验结果，得出结论，为下一步
的研究提供指导。
应用案例
定点诱变技术在基因 修复中的应用
PCR诱变ppt课件
环状诱变 PCR 法
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环状诱变 PCR 法
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4、 TAMS定点诱变技术
有目的地扩增突变链定点诱变技术:能够一次引入多个 位点的突变，并且能够有目的扩增突变链，从而使突变链 效率几乎达到100% 1、线性单链DNA模板的制备。（线性PCR） 2、突变链的合成:用2个锚锭引物(Anchor5’和Anchor3’ ) 和多个诱变引物(Mut1和Mut2)，首先在多核苷酸激酶的作 用下使每个引物磷酸化，接着在DNA聚合酶的作用下使引 物与线性模板退火、延伸，最后在DNA连接酶的作用下。 合成突变链。 3、有目的地扩增突变链：设计扩增引物(PCR5和PCR3 )， 使其3’端碱基分别与锚锭引物引入的突变碱基配对，扩增 引物只能退火到突变链而不是亲本链，所以只有突变链才 14 能扩增。
（圆点指突变位点）
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3、环状诱变 PCR 法
定义：以整个带有目的基因的质粒为模板，用诱变剂 进行扩增，最后产生环状的带有目的突变的质粒。
方法：
①两个引物反向、紧邻但没有重叠区，扩增产物是平 末端的线性DNA，需用T4连接酶环化处理。 ②以Stratagene公司开发的定点突变试剂盒为代表， 两个引物也是反向的并且其5’端有l5个碱基以上的 重叠区，扩增产物为带黏性末端的线性DNA，可自 行环化。
在通常情况下，经过一次易错PCR很难获得满 意结果，由此发展出连续易错PCR 将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一 次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变， 使每一次获得的小突变累积而产生重要的有 益突变。
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方法：增加Mg2+ 的浓度、改变dNTP的比例、调 节热循环参数、利用Mn2+替代天然辅助因子 Mg2+ 、加入dITP（三磷酸脱氧核苷酸类似物） 此方法可获得改善活性和稳定性的突变产物， 但易错PCR一般只产生点突变，因此其产生的 突变体在多样性方面尚有一定缺陷。
基因的定点诱变
因为DNA复制酶有校正功能及DNA复制 后修复系统，正常大肠杆菌自发突变频 率较小。 与校正和修复有关的基因突变后细胞内 基因突变频率大大增加，这样的菌株叫 突变菌株。
流程： 把携带待突变基因的质粒转入增变菌株 扩增，------随机突变体库。 把该库的重组质粒转化到正常宿主中， 筛选鉴定突变体。
寡核苷酸介导的定点诱变
①基本原理： 使用化学合成的含有突变碱基的 寡核苷酸片段作为引物，启动单链DNA 分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物 便成为了新合成DNA子链的一个组成部 分，因此所产生出来的新链便具有已发 生突变的碱基序列
作为诱变剂的寡核苷酸序列：
人工合成一段寡核苷酸序列，该序列中 除了所需的碱基突变外，其余的则与目 的基因编码链的特定区段完全互补 错配碱基的位置应设计在寡核苷酸分子 的中央部位，每侧至少10-15个碱基 通常采用化学合成 无回文，重复和自身互补序列
即使获得期望表型的突变体，无法保证 突变确实发生在目的基因上 在基因克隆和核酸测序技术发展之前， 无法知道基因中突变的位置和性质
Directed evolution （定向进化或直接进化）
对目的基因人为制造大量突变，然后 按照特定的需要和目的，给予选择压力， 反复诱变，循环筛选，将满足要求的、适 合特定目的的分子筛选出来，获得满足需 要的性能改良的蛋白质，从而实现在试管 中分子水平的模拟进化。
基因家族的改组
交错延伸重组 图10-5
以两个以上的有一定同源性的DNA片段 为模板进行PCR反应，通过交换模板机制 实现DNA序列的重新组装。 不需要DNaseI切割DNA，简化了程序。
随机引发重组 图10-6
简述pcr技术在基因定点突变中的应用。
标题：PCR技术在基因定点突变中的应用一、PCR技术的概念和原理聚合酶链式反应（PCR）是一种通过复制DNA分子来合成特定DNA序列的技术。
它是由美国生物化学家卡里·穆利斯在1983年首次发明的。
PCR技术可以扩增DNA分子，使之成百上千倍地增加，从而在实验室中方便地进行各种分子生物学研究。
PCR技术的原理是利用DNA聚合酶酶制造复制DNA的过程。
在反应体系中，向DNA模板添加适当的引物，通过多次循环的热循环，使DNA聚合酶依次在模板DNA的两条链上合成新的DNA链，从而实现了DNA分子的扩增。
二、PCR技术在基因定点突变中的应用1.基因定点突变的概念基因定点突变是指DNA序列中的单个碱基（A、T、C、G）发生改变，从而产生了新的等位基因。
这种突变是基因在漫长的演化过程中逐渐积累的结果，对生物的遗传性状和适应环境具有重要影响。
2.PCR技术在基因定点突变中的原理通过PCR技术，可以利用特定的引物扩增出含有突变位点的DNA片段。
通过生物信息学方法设计出含有突变位点的引物，然后将这些引物与待扩增DNA片段进行PCR反应。
在PCR反应中，引物会与模板DNA特异性结合，并在DNA聚合酶的作用下，扩增出所需的DNA片段。
通过测序技术验证PCR产物是否成功扩增，并鉴定突变位点的具体情况。
3.PCR技术在基因定点突变研究中的应用（1）基因工程PCR技术在基因工程中被广泛应用，可以通过基因定点突变来改变特定基因的编码序列，从而获得具有特定功能的重组蛋白质。
利用PCR技术可以在基因的编码序列中引入特定的突变位点，使其产生特定的生物学效应。
（2）遗传疾病研究在遗传疾病研究中，PCR技术可以用来检测基因中的特定突变位点，从而帮助科研人员了解遗传疾病的发病机制。
通过PCR扩增获得含有突变位点的DNA片段，然后进行测序分析，可以帮助科研人员研究遗传病的发病机制，并为临床治疗提供理论依据。
（3）生物多样性研究在生物多样性研究中，PCR技术可以用来检测不同基因型之间的差异，从而帮助科研人员了解不同裙体之间的遗传差异。
pcr定点诱变原理例题
pcr定点诱变原理例题
PCR（聚合酶链式反应）定点诱变是一种用于引入特定突变的技术，其原理是利用PCR反应来产生特定的突变。
这种技术可以被用于研究基因功能、蛋白质结构和酶催化机制等领域。
下面我将从原理和例题两个方面来回答你的问题。
首先，我们来看一下PCR定点诱变的原理。
PCR定点诱变利用了PCR反应中的错误复制和修复机制。
在PCR反应中，DNA聚合酶会复制DNA模板，但是由于其复制过程中的错误率，会产生一些突变。
通过控制PCR反应条件和引入特定的引物（引物中包含所需的突变信息），可以在特定位点引入所需的突变。
之后，可以通过转化或者其他方法将这些突变引入到目标生物体中，从而实现对特定基因的定点诱变。
接下来，我们来看一个例题。
假设我们希望在一个特定的基因中引入一个点突变，使得蛋白质的一个氨基酸发生改变。
首先，我们需要设计引物，其中包含我们希望引入的突变信息。
然后，我们进行PCR反应，使用这些引物来引发特定的突变。
接下来，可以通过测序等方法验证是否成功引入了突变。
最后，可以将这个突变基因导入到目标生物体中，观察其表型变化以及对应的功能变化。
通过PCR定点诱变技术，我们可以精确地引入特定的突变，从而研究基因功能、蛋白质结构以及酶催化机制等方面的问题。
这种技术在分子生物学和遗传学研究中具有重要的应用价值。
希望这个例题能够帮助你更好地理解PCR定点诱变的原理和应用。
基因定点突变DNA实验技术方法
基因定点突变DNA实验技术方法要研究和检测基因定点突变，需要使用一系列的实验技术方法。
以下是几种常用的DNA实验技术方法：1.基因测序技术基因测序技术是研究基因组突变的关键方法之一、它可以将DNA分子按顺序解码，并确定单个核苷酸的序列。
经过多年的发展，现在有很多种基因测序技术可供选择，如Sanger测序、Illumina测序、PacBio测序和单分子DNA测序。
这些技术可以高效地测定基因组中各个位置的核苷酸序列，并揭示基因定点突变的存在。
2.聚合酶链式反应（PCR）PCR是一种用于扩增特定DNA片段的方法，可以在PCR反应过程中选择性地扩增感兴趣的基因片段。
对于基因定点突变的研究，PCR可以用来扩增包含突变位点的DNA片段，并通过测序分析来确定突变的类型。
3.引物延伸法引物延伸法是一种常用的检测单核苷酸多态性（SNP）和点突变的方法。
该方法使用引物和DNA聚合酶来识别特定位点，并从该位点延伸引物，以确定突变的存在与否。
引物延伸法可以用于快速、高效地检测多个位点的突变。
4. 限制性酶切酶（Restriction Enzyme Digestion）限制性酶切酶可以通过识别特定的DNA序列并在该序列周围切割DNA来检测和分析基因定点突变。
当突变中产生或消失限制性酶切位点时，可以通过酶切后的DNA片段的大小变化来检测突变。
5. DNA芯片技术（DNA Microarray）DNA芯片技术是一种高通量的基因分析技术，可以同时检测和比较大量的基因表达水平。
通过将DNA分子固定在芯片的表面并用荧光探针进行杂交反应，可以检测不同样品中基因定点突变的存在。
以上是几种常用的DNA实验技术方法，用于研究和检测基因定点突变。
随着技术的不断发展和创新，这些方法将进一步提高灵敏度和分辨率，为基因定点突变的研究提供更多的选择和可能性。
基因定点诱变技术与DNA与蛋白质互作及定点突变介绍
24
酵母双杂交的基本原理示意图 25
二） 酵母单杂交系统
? 酵母 单杂交系 统是上世 纪90年代中 发展起来的研 究DNA-蛋白质之间相互作用的新技 术，可识别稳 定结合于DNA 上的蛋白 质，在酵母 细胞内研究真核 生物中 DNA-蛋白 因。
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一）酵母双 杂交系统 （yeast two-hybrid system)
1. 原理：
? 真核生物的 转录因子大多是由两个 结构上分开、 功能上独立的 结构域组成的，即 DNA结合域（BD） 和转录 激活域（ AD）。
? 单独地BD能与特定基因地启 动区结合，但不能激 活基因的 转录 ，而由不同 转录 因子的 BD和AD所形 成的杂合蛋白却能行使激活 转录的功能。
– 1.盒式诱变 – 2.寡核苷酸引物诱变技术
? ㈡ PCR点突变技术
– 1.重组PCR定点诱变法 – 2.引物PCR定点诱变法
3
㈠寡核苷酸介 导的定点突 变技术
? 1.盒式诱变（casette mutagenesis） ? 利用一段人工合成的具有突变序列的
寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应 序列。
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33
? EMSA ? 还被
用于 研究 与蛋 白质 相结 合的 DNA ? 序列 的特
异型。
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四）DNaseI足迹试验 （DNase I foot printing）
? 主要步骤： ① 用32P标记DNA双链末端，并用 RE切去一端； ② 加入细胞特定周期蛋白 质提取物，温育； ③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲 酯-六氢吡啶，使 DNA链发生断裂。 这一反应中，DNaseI或硫酸二甲 酯的用量非常关 键， 要保证一条链只发生一次断裂！ ④沉淀 DNA（包括与 DNA 相结合的蛋白 质）； ⑤进行DNA凝胶分析。
定点诱变的原理和应用
定点诱变的原理和应用1. 引言定点诱变是一种基因工程技术，可以通过人为干预基因组，使其发生特定的变异。
定点诱变技术在科研、生物医药等领域具有重要的应用价值。
本文将介绍定点诱变的原理和应用。
2. 定点诱变的原理定点诱变的原理是通过人为设计和构建特定的DNA片段，然后将其导入宿主细胞中，通过一系列的分子生物学技术将该DNA片段插入到细胞染色体的目标位点上。
定点诱变技术主要有以下几个关键步骤：•设计目标位点：首先需要确定要进行定点诱变的目标位点，通常是某个特定基因或基因组区域。
•构建修饰DNA片段：根据目标位点的序列信息，设计和合成能够与目标位点配对的DNA片段。
这些DNA片段通常包含所需的突变基因或序列。
•导入宿主细胞：将修饰DNA片段导入宿主细胞中，常用的方法有电转化、化学法和病毒介导的转导等。
•插入目标位点：通过一系列的分子生物学技术，将修饰DNA片段插入到细胞染色体的目标位点上。
常见的方法有CRISPR/Cas9技术、基因敲除、基因转座等。
3. 定点诱变的应用定点诱变技术在科研、生物医药等领域具有广泛的应用价值。
以下是其中几个常见的应用领域：3.1 基因功能研究定点诱变技术可以用来研究基因的功能和表达调控机制。
通过在目标位点上插入突变基因，研究者可以观察到这些突变对基因功能和表达的影响，进而揭示基因的作用机制和生物学功能。
3.2 疾病模型构建定点诱变技术可以用来构建疾病模型，以研究疾病的发生机制和治疗方法。
通过在目标位点上插入与特定疾病相关的突变基因，可以模拟疾病的发生过程，进一步研究疾病的发病机理，并寻找治疗疾病的新方法。
3.3 转基因作物育种定点诱变技术可以用来改良作物品种，提高其产量、抗病性等性状。
通过在目标位点上插入与所需性状相关的突变基因，可以直接导入所需性状，避免传统杂交育种中的不可控性，并加快育种进程。
3.4 基因治疗定点诱变技术可以用来进行基因治疗，治疗一些遗传性疾病或基因突变导致的疾病。
定点突变pcr[宝典]
![定点突变pcr[宝典]](https://img.taocdn.com/s3/m/f0e9c039dc36a32d7375a417866fb84ae45cc33f.png)
人血管生长因子基因（hVEGF）的PCR定点突变实验原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
目的学会引物的设计、PCR扩增及巩固琼脂糖凝胶电泳分析。
主要内容1、PCR引物设计的最基本注意事项；2、PCR扩增中的注意事项；3、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析。
VEGF成熟基因序列：GgatccGCACCCATGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAATCA TCACGAAGTGGTGAAGTTCA TGGA TGTCTA T CAGCGCAGCTACTGCCA TCCAA TCGAGACCCTGGTGGACA TCTTCCAGGAGTACCCTGATGAGA TCGA GTACA TCTTCAAGCCATCCTGTGTGCCCCTGATGCGATGCGGGGGCTGCTGCAA TGACGAGGGCCTGG AGTGTGTGCCCACTGAGGAGTCCAACATCACCA TGCAGA TTA TGCGGATCAAACCTCACCAAGGCCA GCACA TAGGAGAGA TGAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTGAATGCAGACCAAAGAAAGA TAGAGCA AGACAAGAAAATCCCTGTGGGCCTTGCTCAGAGCGGAGAAAGCATTTGTTTGTACAAGA TCCGCAGA CGTGTAAA TGTTCCTGCAAAAACACAGACTCGCGTTGCAAGGCGAGGCAGCTTGAGTTAAACGAACG TACTTGCAGA TGTGACAAGCCGAGGCGGTGA突变酶切位点Ggatcc（BamH1）GAATTC（EcoR1）引物VEGF165-Primer-上游：5’- GAA TTCGCACCCA TGGCAGAAGGAGGAG-3’VEGF165-Primer下游：5’- GCAAGCTTTTAGTCTAGACGCCTCGGCTTGTCACA TC-3’实验步骤1 按下列比例加入试剂PCR反应体系如下：试剂终浓度加量（25 µL）10×Buffer 1× 2.5 µL25 mM MgCl2 1.5 mM 1.5 µL10 mM dNTP s 0.2 mM 0.5 µL5 U/μL Taq 酶 1 U 0.2 µL10 μM 上游引物 1.0 µL10 μM 下游引物 1.0 µL模板0.5 µL补加ddH2O 至25 µL2 进行PCR扩增PCR反应条件：95 ℃预变性，4 min，一个热循环；95 ℃热变性30 s，53 ℃褪火30 s，72 ℃延伸45 s，28个热循环；72 ℃复性10 min；16 ℃保存。
基因定点诱变的方法及原理
基因定点诱变的方法及原理基因定点诱变是指在特定位置引发基因突变的一种技术或方法。
通过基因定点诱变技术，可以精确地改变基因组中特定位置的碱基序列，从而研究或改变目标基因的功能。
目前常用的基因定点诱变方法主要有以下几种：1. CRISPR-Cas9系统：CRISPR-Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated protein 9）是一种基于RNA-DNA 相互识别的靶向基因编辑技术。
该系统利用Cas9蛋白通过结合到特定的DNA 序列来导向编辑目标位置，而CRISPR RNA（crRNA）和互补序列的转录过程产生了指导RNA（sgRNA）。
CRISPR-Cas9系统可以通过设计合成特定的sgRNA来诱导Cas9蛋白与目标基因的DNA序列结合，并在目标位点引入双链断裂，通过自然修复过程来实现基因突变。
2. TALEN系统：TALEN（Transcription activator-like effector nuclease）是一种由TAL（Transcription activator-like）蛋白和核酸酶融合而成的基因编辑工具。
TAL蛋白可通过识别和结合特定的DNA序列来实现靶向基因编辑。
TALEN 系统利用设计合成的TAL蛋白与核酸酶的融合体结合到目标基因的DNA序列上，并通过酶活性诱导DNA的双链断裂，从而引发基因突变。
3. ZFN系统：ZFN（Zinc finger nuclease）是由锌指蛋白（Zinc Finger Protein）与核酸酶（nuclease）融合而成的一种基因编辑工具。
锌指蛋白能够识别和结合到特定的DNA序列上，而核酸酶则通过识别锌指蛋白与DNA结合后的底物序列引发DNA的切割。
ZFN系统利用设计合成的锌指蛋白与核酸酶的融合体结合到目标基因的DNA序列上，从而在特定的位置诱导DNA的双链断裂，进而引发基因突变。
简述定点突变pcr原理
简述定点突变pcr原理亲爱的今天咱们来聊聊定点突变 PCR 这个神奇的玩意儿，保证让你轻轻松松就搞明白它的原理！想象一下，咱们就像是一群超级基因工程师，要对 DNA 这个神秘的密码进行精准改造。
定点突变 PCR 呢，就是咱们手里的神奇魔法棒。
咱们先来说说 DNA 吧，它就像是一个长长的密码串，决定了生物的各种特征。
但有时候，咱们想要让这个密码串发生一点点小变化，来实现咱们的特定目的，这时候定点突变 PCR 就派上用场啦！在这个过程中，咱们得有几个关键的小伙伴。
首先就是咱们的模板 DNA ，这就像是我们要改造的原始蓝图。
然后呢，还有一对特别设计的引物，这俩家伙可是关键中的关键哦！这对引物啊，就像是两个聪明的小向导。
它们可不是随便设计的，而是经过咱们精心谋划的。
它们身上带着咱们想要引入的突变信息。
比如说，咱们想在某个特定的位置把一个碱基换成另一个，这对引物就会在这个位置做出相应的改变。
接下来，PCR 反应就开始啦！就好像是一场热闹的大派对。
在 PCR 反应的锅里，有各种神奇的试剂，模板 DNA 、引物、酶等等都在里面欢快地跳舞。
DNA 会在高温下解开双链，就像是把紧紧抱在一起的双胞胎给分开。
然后，引物就会迅速地找到它们对应的位置，紧紧地贴上去，就像找到了自己的归属。
然后呢，在酶的帮助下，新的 DNA 链就开始合成啦！因为引物带着咱们设计好的突变信息，所以新合成的 DNA 链就会有咱们想要的突变啦！一轮 PCR 反应结束后，咱们就得到了一部分带有突变的 DNA 。
但是别着急，这还不够呢！咱们还要再来几轮，让带有突变的 DNA 越来越多，直到成为咱们的主力军。
经过一轮又一轮的 PCR 反应，最后咱们就能得到大量含有定点突变的 DNA 啦！是不是感觉超级神奇？其实啊，定点突变 PCR 就像是一场精心策划的基因改造大作战。
咱们通过巧妙地设计引物，利用 PCR 反应的强大力量，实现对 DNA 密码的精准修改。
基因定点突变技术
定点突破旳措施
• 寡核苷酸介导旳基因突变指用具有突变碱基旳寡聚核苷酸
片断作为引物，在聚合酶旳作用下开启DNA分子进行复 制。
• 盒式突变是利用一段人工合成旳含基因突变序列旳寡核
苷酸片段，取代野生型基因中旳相应序列。
• PCR介导旳基因突变
寡核苷酸介导旳定点突变
• 寡聚核苷酸定点诱 变技术是由加拿大 旳生物化学家 ( michael smith )发明 旳.
在分子生物学和基因工程中旳应用
探明未知序列旳构造和功能旳关系，如开启子诱变筛选，真 核旳TATA盒保守序列拟定。 载体构建：调控元件，强开启子，多接头。 研究基因调控序列，如AUG前加入ACC序列最佳。
在蛋白质工程中旳应用
降低毒性，如TNF 变化亚型和种旳特异性，如IFN旳23位AAG（赖氨酸），AGG （精氨酸），使IFN2a变成IFN2b。123位Try（酪）变甘/丝， 使IFN种属特异性明显变化，对人抗病毒活性不大于牛。 提升活性和稳定性，如IFN- βser17（cys变ser） 提升蛋白质作用旳专一性，如IFNβ旳9-56位被IFNa旳7-54位 取代后，活性提升40倍。
• 定点突变技术旳潜在应用领域很广，例如研究蛋白质相互 作用位点旳构造、改造酶旳不同活性或者动力学特征，改 造开启子或者DNA作用元件，引入新旳酶切位点，提升蛋白 旳抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白旳晶体构造，以 及药物研发、基因治疗等等方面。
应用前景
• 不同于定点突变旳是基于PCR旳随机突变，经过变化PCR条件提 升PCR过程中旳随机犯错，这种措施合用于未知旳蛋白质，作全 局性分析，所以有人称为饱和突变（saturation mutagenesis）。 但是这种措施因为没有目旳性，分析操作相当繁琐，而且不会出 现一种位点2个以上碱基突变，因而应用上有不足。定点突变合 用于蛋白构造已经有初步了解旳基因，比PCR随机突变更有目旳 性，也更为精确，简朴，同步改造基因愈加“随心所欲”。因为 定点突变技术在蛋白质组学中有这非常广泛旳应用前景，相信这 个技术在不远旳将来还会有更大旳改善和发展，也必将为更多人 熟悉应用。
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概念： 定点诱变：通过取代、插入或缺失克隆 基因或DNA序列中的任何一个特定的碱 基的技术。
寡核苷酸定点诱变技术
M.Smith（加拿大生物化学家） 1993年诺贝尔化学奖，1978年发明了 寡核苷酸定点诱变技术。 利用寡核苷酸定点诱变技术，可以 认为地通过基因的改变来修饰、改造某 一已知的蛋白质，从而可以研究蛋白质 的结构及其与功能的关系、蛋白质之间 的相互作用。
1× 29× 1×
*This cycle is normally included in a PCR assay in order to allow any “unfinished” product from previous amplification to achieve its full length
基因扩增（gene amplification）
主要内容： 1.体外扩增 2.通过体外重组和转化，将目的基因在宿 主细胞进行扩增 3.在环境作用下，生物体内相关基因的扩 增。 4.程序基因扩增 5.进化过程中的基因扩增
PCR技术 在1983年，美国Cetus公司人类遗 传研究室的科学家K.B.Mullis发明 的。 PCR是一种在体外快速扩增特定基 因或DNA序列的方法，有称之为体 外扩增法。
插入突变
1 2 3 4
人工合成片段 Transposon insertion （Tn5） 同源重组 PCR
基 因 的 体 外 诱 变
Kunkel法 或称”U”法
dut -
：dUTP酶（dUTPase）缺陷，细胞不
能把dUTP转化为dUMP,因此细胞内dUTP的含 量大为增加，其中一些dUTP可掺入DNA中正 常情况下有“T”占据的位置。
ung -：UDG酶缺陷，UDG酶（尿嘧啶-N-糖
基化酶）可除去DNA中的尿嘧啶
E.Coli （dut-，ung-）
合成的DNA中含有尿嘧啶，M13噬菌体 DNA中将含有20-30个尿嘧啶碱基。
CJ236(dut-，ung- ，F+ )
ssDNA制备载体
1 单链噬菌体载体 M13 2 phagemid载体-辅助噬菌体
Description
Thermus aquaticus strain YT1 94 kd 72--80℃ 150 nucleotides/sec/molecule >50% at 95℃ for 40 min 1.1×10-4 substitutions per cycle >0.5mM<10mM 5’ to 3’only 5’ adenosines
温度（℃）
94
循环1
94℃变性 （1min）
循环2
循环3
72 60 60 ℃退火 （1min）
72 ℃延伸 （1.5min）
时间（min）
PCR反应的温度循环周期
PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引 物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反 应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃ 延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增 产物的数量满足实验需求为止。
Reaction Condition for a Typical PCR Assay
Parameter
Template pH dNTPs Gelatin Primers Mg2+ oncentration Enzyme Total volume
Concentration
10 attomoles(~1×106 molecules) 8.4（10mM Tris-Hcl） 200 μ M(each one) 100 g/ml (optional) 0.5 μ M(each one);(0.1—1.0μ M) >0.5mM< 10mM 1 unit 25—100μ l
所用酶类
T4噬菌体聚合酶：诱变几率65% T7噬菌体聚合酶：3‘-5’外切活性强，持 续合成DNA的能力强，遇到引物时会停 止。诱变几率83% KlenowDNA聚合酶：前端有引物或双链 时，可能会替换。诱变几率36%
影响因素
1 引物：热动力学（配对），突变碱基 的左右8-10bp 2 T4连接酶 3 5’端磷酸化 4 单链结合蛋白：解决颈环结构
5’ (a) (b) 引物2 5’ 3’ 5’ (c) 引物21 3’ 引物1互补链
5’
新引物
3’ 5’
5’ 3’
(e)
不同长度的链
单位长度的链
(f)
引物2互补链
5’ 3’
3’ 5’
引物1互补链
(g)
目的片段（不同长度的链未示出）
聚合酶链式反应示意图
Some DNA Polymerases Used in PCR
Enzyme
Klenow Sequenase Taq BstE Pfu Tth UlTma
Microbial Source
Escherichia coli T7 bacteriophage Thermus aquaticus Bacillus stearothermophilus Pyrococcus furiosus Thermus thermmophilus Teratoga maritima
Typical PCR Thermal Profile
Program
94℃ (first step) 1min 1min 1min
37—60℃ (second step) 1min 1min 1min
72℃ (third step) 1min 1min 10min
Reps
Cycle1 Cycle2—30 Cycle31*
基因诱变的应用
1 2 3 4 5
结构和功能 基因的注释 代谢途径-分子育种 蛋白质的修饰 分子设计-分子进化工程
缺失诱变
1 简单缺失 通过对DNA片段中具有的相应的酶 切位点进行切割，而后用T4连接酶进行 连接。 2 系统缺失 核酸外切酶III、S1核酸酶、Klenow大 片段
Thermotolerance
No No Yes Yes Yes Yes Yes
Characteristics of Taq Polymerase
Characteristics
Origin Molecular weight Optimal temperature Activity Stability Fidelity Mg2+ concentration Exonuclease activity Transferase activity