免疫细胞及细胞因子的检测

37℃培养 72小时
参考值：60%~80%，小于50%视为降低。
评价：方法简便易行，受主观因素影响大。
②放射性核素法
外周血或单个核细胞+刺激物
37℃培养 56小时
加适
量3H-TdR 培养16小时 记录每分钟脉冲数（cpm）
SI=PHA刺激管cpm均值/空白对照管cpm均 值。 评价：结果客观，但价格昂贵，有放射性 核素污染。
本法分离的单个核细胞纯度可达95%，淋
巴细胞约占90%~95%，细胞收率可达80%以上， 但室温超过25℃时可影响细胞收率。
用Percoll原液（密度1.135）与约等量的
磷酸缓冲液均匀混合，经高速离心后，可使分 离液形成一个从管底到液面密度逐渐递减的连 续密度梯度，再将已制备的单个核细胞悬液轻 轻叠加在液面上，低速离心后，便得四个细胞
①反向溶血空斑试验：检测人类Ig分泌细胞. 淋巴细胞+SPA-SRBC+抗人Ig抗体+补体
37℃ 3~5小时
溶血空斑。
②酶联免疫斑点试验：检测抗体分泌细胞，又可 检测抗体分泌量。 抗原包被固相载体→淋巴细胞→酶标二抗→ 底 物显色。
第四节
吞噬细胞功能的检测
单核一巨噬细胞系统： ①非特异性地吞噬； ②特异性免疫过程起作用。
（二）、淋巴细胞亚群的分离
1 、 E 花环沉降法：基本原理是利用 T 细胞有羊红细胞
受体（E受体），可以与羊红细胞结合形成较大的E花
环的特性，可将T细胞和B细胞分离。 2、尼龙毛柱分离法：利用B细胞和单核细胞具有易粘 附于尼龙纤维表面的特性，将T细胞和B细胞分离。 3 、亲和板结合分离法：利用亲和层析和抗体固相包 被原理。
分离溶液的基本要求：
① 对细胞无毒；
② 基本等渗；
③ 不溶于血浆等分离物质； ④ 有一定的比重。 较理想的细胞分层液：聚蔗糖—泛影葡胺， 商品名为：Ficoll
Ficoll 分离液法：单次差速密度梯度离心 的分离法。
方法： 1、细胞分层液置试管底层； 2、将肝素抗凝全血以Hanks液或PBS液作适 当稀释后，轻轻叠加在分层液上面； 3、水平式离心； 4、离心管中会出现几个不同层次的液体和 细胞带（见图）
第十三章 免疫细胞及细胞因子的检测
免疫缺陷症 自身免疫病 肿瘤 机体细胞免疫水平 淋巴细胞或淋巴细胞亚 群的数量和功能的变化
第一节
免疫细胞的分离与纯化
外周血的淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、 红细胞和血小板，可根据它们的理化特性，如 细胞大小、密度、表面电荷和粘附能力等存在 差异，分离不同的细胞群体。但淋巴细胞理化 特性与其它细胞差异甚微，不容易分纯，所以 产生了专门的淋巴细胞分离纯化技术，旨在于 获得高纯度、高收率和高活性的不同类型和不 同亚群特点的淋巴细胞。
第二节
淋巴细胞数量的检测
一、T淋巴细胞数量的检测 （一）、免疫荧光法：直接法、间接法 （二）、酶免疫组织化学法：以酶作为抗体 标记物→细胞酶免疫组化 生物素——链霉亲和素放大系统提高灵敏度
（三）、花环技术
1、E花环试验 2、抗体致敏花环法 用相应的抗CD3单克隆抗体吸附于醛化的红细胞（致 敏）+受检细胞→抗原抗体反应→受检细胞周围粘附3
个或3个以上红细胞为花环形成细胞，计算花环形成
细胞与计数淋巴细胞之比。（见图）
E花环试验结果示意图
二、B淋巴细胞数量的检测
（一）、CD抗原的检测
（二）、 SmIg 的检测：鉴定 B 细胞可靠的指标。
第三节
淋巴细胞功能的检测
淋巴细胞功能测定是在免疫缺陷病及多种 疾病的发病机制、疗效判断、免疫治疗及预后 的重要依据。可分为体内实验和体外实验。
一、白细胞分离：自然沉降法
红细胞密度1.093
白细胞密度1.092
灰白层
二、外周血单个核细胞分离
外周血单个核细胞（PBMC）：包括淋巴细 胞和单核细胞。
红细胞密度1.093
粒细胞密度1.092 单个核细胞密度1.075-1.090 血小板密度1.030-1.035
可分离各种血细胞和单个核细胞
密度为1.075- 离心 1.092的等渗 分离溶液
③MTT比色法
外周血或单个核细胞+刺激物————→ 加适量MTT混匀————→比色法测OD值。
SI 试验孔 对照孔 OD 均值 OD 均值
37℃培养 70小时
培养4~6小时
评价：方法敏感、简单、快速、无污染。
二、B淋巴细胞功能的检测
临床常检测各来自百度文库抗体
评定
B细胞的功能．
对于免疫缺陷患者或科研实验时：
一、T淋巴细胞功能的检测
1、淋巴细胞转化实验 刺激物
非特异性 特异性
基本原理：T细胞敏感刺激物在体外刺激 T细胞→T细胞增殖、转化→根据其增殖转化
能力评定相应的细胞功能。
①形态法
外周血或单个核细胞+刺激物————→ 涂片染色镜检
淋巴细胞转化率 转化的淋巴细胞数 转化的淋巴细胞数 未转化的淋巴细胞数 100 %
吞噬率61%-64%，对大肠杆菌杀菌率>90%，对金葡菌杀 菌率>85%
二、巨噬细胞功能检测
基本原理：人巨噬细胞与鸡红细胞（CRBC） 混合后孵育，通过计算巨噬细胞吞噬CRBC百分 率和吞噬指数判断人巨噬细胞的吞噬功能。
参考值：吞噬率61%~64%；吞噬指数接近于1。
第五节、细胞因子的检测
细胞因子：是由活化的免疫细胞及某些基 质细胞表达并分泌的活性物质，其生物学功能 是介导和调节免疫应答及炎症反应，其化学本 质是蛋白质或多肽。
层。（见图）
三、淋巴细胞的纯化与亚群的分离
（一）淋巴细胞的纯化
1 、贴壁粘附法：利用单核细胞贴壁生长的特 点；B细胞会有所损失。
2 、吸附柱过滤法：同样利用单核细胞具有贴 壁生长的特点，粘附能力为：巨噬细胞或单核 细胞>树突细胞>B细胞>T细胞=红细胞。
3 、磁铁吸引法：利用单核细胞县有吞噬的特 性，加入直径为3μm的羰基铁颗粒。
吞噬细胞
中性粒细胞：以吞噬功能为主，发挥非特 异性免疫防疫作用并参与机体的免疫应答 炎症损伤等。 吞噬活动：趋化、吞噬、胞内杀灭作用三个阶段。
一、中性粒细胞功能的检测
（一）、中性粒细胞趋化功能的测定
琼脂糖凝胶平板法
（二）、中性粒细胞吞噬功能测定
待检细胞悬液+白色念珠菌悬液 染色→涂片镜检
保温
美蓝
测定方法：分子生物学测定方法，免疫测 定方法、生物学测定方法。 种类：白细胞介素、集落刺激因子、干扰 素、肿瘤坏死因子、生长因子、趋化因子。表 现为细胞因子网络。