二硫键与蛋白质的结构

二硫键与蛋白质的结构

徐国恒（北京大学医学部生理与病理生理系北京100191）

摘要二硫键是肽链上2个半胱氨酸残基的巯基基团发生氧化反应形成的共价键，具有链内二硫键和链间二硫键2种形式。与氨基酸的氨基氮原子之间形成的稳定共价键不同，二硫键容易被还原而断裂，断裂后可再次氧化重新形成二硫键，因而是可以动态变化的化学键。二硫键是参与一级结构也是形成高级结构的重要化学键，对蛋白质折叠和高级结构的形成与维持十分重要。讨论了二硫键的形成和特征及其与蛋白质结构和功能之间的关系，并讨论了生物学教学中关于二硫键的一些疑问。

关键词蛋白质二硫键高级结构功能

二硫键（disulifide bond）即S—S键，是2个巯基被氧化而形成的—S—S—形式的硫原子间的共价键。肽链上的2个半胱氨酸（cysteine，简称Cys）残基的巯基基团，可发生氧化反应形成二硫键；伴随二硫键的形成，半胱氨酸残基转变为胱氨酸残基。二硫键对维持蛋白质的分子结构具有十分重要的作用。

1 链内二硫键和链间二硫键

同一条肽链上的2个半胱氨酸残基之间形成的二硫键，称为链内二硫键，例如胰岛素A链内有1个二硫键。不同的肽链上的2个半胱氨酸之间可形成链间二硫键，例如胰岛素蛋白分子由A、B 2条肽链组成，除了A链内部有1个链内二硫键外。A链和B 链之间也通过2个二硫键连接在一起（图1）。另外，免疫球蛋白lgG的轻链和重链也是通过链间二硫键结合的。

图 1 胰岛素蛋白分子的链内二硫键和链间二硫键

Cys是半胱氨酸的英文缩写

2 二硫键的作用

二硫键对蛋白质的正确折叠和高级结构的形成与维持十分重要。二硫键的形成迫使同一或不同肽链的不同区域的氨基酸残基向一起靠拢集合，由此肽链迅速折叠并形成稳定的空间拓扑结构，该区域的氨基酸残基数量是高度密集的；同时疏水氨基酸残基围绕着二硫键，可形成局部疏水中心，拒绝水分子进入肽的内部破坏氢键。利于形成稳定的高级结构区域。由于二硫键可以桥接肽链的不同区域，有时候也被称为二硫桥（disulifide bridge）。

3 二硫键是一个动态变化的化学键

二硫键由2个巯基通过氧化反应生成。二硫键虽然是共价键，但并不十分牢靠。二硫键很容易被还原而断裂，断裂后可以再次氧化重新形成二硫键。因而，二硫键是可以动态变化的，只具有相对的稳定性，这一特征与氨基酸氮原子间形成的十分牢靠的共价键不同。许多蛋白质需要二硫键维持其特定的高级结构和生物学功能。当二硫键被断开还原为巯基基团时，蛋白质结构必然发生改变，可能完全或部分失去原有的生物功能。但有些蛋白质可能因为二硫键的还原，发生构象变化导致生物活性反而增强或出现新的功能。无论是二硫键断裂或是二硫键重新形成，均可调节蛋白质执行某种特定的功能。

4 二硫键的断裂再键合调节蛋白质功能

在细胞内一些蛋白质需要二硫键维持结构和功能，但另一些蛋白的活性却有赖于半胱氨酸残基的游离巯基的存在（即二硫键被还原断开的状态）。那么，蛋白质如何实现二硫键的氧化还原即键合与断裂呢？细胞中普遍存在一种三肽即谷胱甘肽，含谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸残基，半胱氨酸上的巯基为其活性基团。谷胱甘肽有还原型和氧化型两种形式，在酶的作用下两型之间可以相互转化。在细胞内，作为巯基供体的还原型谷胱甘肽占多数，有利于维护蛋白质的巯基处于还原状态，不形成二硫键，以维护蛋白质的特定功能。因而还原型谷胱甘肽能保护酶分子上的巯基，有重要的生理功用。有些毒物如芥子气、重金属盐等，能与酶分子的巯基结合而抑制酶活性，从而发挥其毒性作用。二巯基丙醇可以使结合的巯基恢复原来状态，所以具有解毒作用。

在体外，多肽的二硫键的形成可使蛋白质分子发生凝集、沉淀、活性降低。体外储存酶蛋白溶液如DNA 限制性内切酶时，常加入巯基还原剂如二硫代苏糖醇防止酶蛋白分子形成二硫键，以维护酶蛋白的正确结构和活性。在蛋白质研究中，纯化蛋白时加入巯基还原剂的原理也是如此。例如用工程菌表达重组蛋白质时，含有半胱氨酸的重组蛋白质常因二硫键形成，而使其包涵体难于溶解，需要加入高浓度的巯基还原剂增溶。

5 蛋白质的完全变性需要打断二硫键

物理因素如高温和放射线，化学变性剂如SDS、尿素、盐酸胍，能够破坏疏水键、盐键、氢键、范德华力，因而能破坏蛋白质的高级结构，导致蛋白质理化性质改变和生物活性丧失，称为蛋白质的变性（denaturation）。但是，这些变性剂并不影响肽键和二硫键，因而难以彻底破坏蛋白质的高级结构使蛋白质彻底变性。如果再加上还原剂如二巯基乙醇等，则可使蛋白质完全变性。在生物医学研究中最常用的2种还原剂是β一巯基乙醇（2一Mercapto—ethano1）和二硫代苏糖醇（dithiothreito1）。

6 生活中的应用：二硫键与烫发和发型保持

蛋白质占毛发干重的90％，主要是角蛋白（keratin）。角蛋白的分子结构中含有大量的二硫键。不同种类的毛发如人发和鸟类羽毛，以及毛发的不同部位的半胱氨酸含量和二硫键数量有很大差别，这些差别与毛发的柔韧程度有关。日常生活中的烫发和发型保持，主要原理是操纵毛发角蛋白二硫键的还原和再氧化，即二硫键的断开和重新键合。

图2 二硫键的还原和再化是烫发时发型改变的基础

代表肽链，S-S表示二硫键，SH表示巯基

如图2所示，烫发前毛发角蛋白中的大量二硫键以某种特定的方式排列。烫发过程中，先使用还原剂如硫代乙醇酸盐处理头发，使角蛋白中的二硫键断裂还原为游离巯基。用卷发器将毛发固定成所要的波浪形状。然后使用氧化剂如双氧水处理头发，使角蛋白中刚刚被还原的巯基氧化，并在新的位置形成二硫键。烫发后新形成的二硫键在角蛋白肽链中的位置，与烫发前相比发生明显的变化，头发的形状也随之发生改变并维持于新的发型。如果不使用卷发器的话，上述还原氧化过程可将波浪状的头发拉直。虽然市面上的烫发剂标有各种各样的成分。但只有还原剂和氧化剂是必要的核心成分，其他所有成分并非必要，无非是些肥皂之类的表面活性剂和广告概念性的添加剂。现代的冷烫还是热烫，基本原理大致如此，惟其所用还原剂和氧化剂有所不同而已。

7 二硫键是构成一级结构的共价键，还是构成高级结构的共价键？

在蛋白质分子结构中，二硫键归属于蛋白质的一级结构，还是归属于高级结构？在中国，有不少参加生物学奥赛的中学生和教师提出过这样的问题，看似简单实则难以回答。基本上，在大学生物化学关于蛋白质分子结构教材里，这样的问题似乎未曾被强调过，也没有简单的答案或者没有唯一正确的答案。作者试图讨论如下。如果说，蛋白质一级结构是指肽链氨基酸残基共价结合的排列顺序，那么氨基酸残基间的共价键只有肽键和二硫键，肽键是主键，而二硫键是副键且只在2个半胱氨酸残基存在时才有可能形成（但也可能维持巯基的还原状态不形成二硫键）。严格按照这一概念，二硫键可以认为是属于构成一级结构的共价键。的确，国内外一些大学专业教材明确指出，氨基酸残基之间的所有共价键，报括二硫键与肽键均属于蛋白质一级结构的键以胰岛素蛋白为例，胰岛素的A链内部有一个链内二硫键（图1），这样的链内二硫键可以说属于构成蛋白质一级结构的共价键。但胰岛素A链和B链之间还存在2个二硫键（图1），免疫球蛋白lgG的轻链和重链也是通过链间二硫键结合形成免疫球蛋白的高级结构。很多大学专著和研究文献又明确指出，维持蛋白质高级结构的作用力主要是氢键、疏水相互作用、离子键、范德华力以及共价二硫键，认为二硫键是参与高级结构的共价键。因而可以说，二硫键参与一级结构但无疑也是参与高级结构的重要化学键。