切片标本的制作

切片标本的制作

本次实验采用的是石蜡切片法。

石蜡切片法的程序如下：

取材→固定→冲洗（洗涤）→脱水→透明→包埋→切片→贴片→烘片→脱蜡→复水→染色→脱水透明→封藏。

上述每个程序的要求和方法可归纳为透蜡制片和染色两大步骤，现简单介绍如下：

脱水步骤为：

将组织块浸入系列酒精70%→80%→95%→100%→100%各30min。脱水的实际时间长短视组织块的大小而定，但不宜过长。

透明步骤为：

将组织块浸入二甲苯与无水乙醇（1：1）的混合液30min→二甲苯30min→二甲苯30min。

透蜡步骤为：

将组织块浸入二甲苯与石蜡（1：1）的混合液30min→石蜡30min→石蜡30min。

脱蜡程序为：

纯二甲苯（脱蜡）15min→纯二甲苯15min→二甲苯：

纯乙醇（1：1）3min

复水程序为：

纯乙醇3min→95%乙醇3min→90%乙醇3min→80%乙醇3min→70%乙醇

3min→60%乙醇3min→50%乙醇3min→30%乙醇3min→蒸馏水

H、E染色程序为：

将已复水的切片放入苏木精染液中（30分钟以上），水洗2分钟，在

0．5%的盐酸水中分色3秒（当在显微镜下检查时，核褪至淡红色，细胞质及结缔组织几近无色即可）蒸馏水洗1分钟，

0．1%氨水中蓝化（1~3分钟，核呈蓝紫色），蒸馏水洗（1分钟），切片由低至高浓度的系列酒精中脱水（每级3~5分钟）至95%乙醇→切片入

0．5%伊红中复染（3分钟）（伊红由95%乙醇配制的）→95%乙醇中分色（显微镜检查呈蓝紫色，胞质及结缔组织为粉红色）→95%乙醇轻洗（除去玻片上多余的伊红染液。动作要迅速，否则组织上的伊红要脱下来）。

透明程序为：

将已脱水的切片依次放入纯乙醇：

二甲苯（1：1）→二甲苯⑴→二甲苯⑵中，每级15分钟。

1．2．1透蜡制片

1．2．

1．1、取材从实验罗非鱼最后一根背鳍下方用解剖刀取下3×3×4mm左右的新鲜肌肉块取材时要注意组织块方向与肌纤维走向要一致。同时，取材时动作迅速，保持组织的新鲜，取材所用的解剖刀要锋利。

1．2．

1．2、固定把取下的肌肉组织块迅速投入已预先配制好的Bouin,s固定剂中固定。固定剂中的药品可以使构成组织的蛋白质变性凝结，组织块硬化，从而保持组织及细胞的原来形态结构。

Bouin,s固定剂配方如下：

苦味酸饱和溶液75ml

xx25 ml

冰醋酸5 ml

1．2．

1．3、冲洗（洗涤）肌肉块经固定剂的处理，会在肌肉的表面或内部残留着组织液，这些残留的药品若不除去，将会对以后的制片过程产生不良影响，所以肌肉从固定剂中取出后，必须经流水冲洗或数次的乙醇洗涤，使得组织中残留的固定剂全部除去为止。

1．2．

1．4、脱水的目的在于去除肌肉中的水分。在石蜡制片法中所用的渗透和包埋剂就是石蜡，由于石蜡和水是不相溶的。因此为了使石蜡能很好地渗透进肌肉组织的每个部分，就必须先把肌纤维细胞中的水分除去，在脱水时要用从低浓度到高浓度的系列酒精逐步脱水，这样可避免肌纤维因脱水而过分地收缩。脱水需彻底。

脱水步骤为：

将组织块浸入系列酒精70%→80%→95%→100%→100%各30min。脱水的实际时间长短视组织块的大小而定，但不宜过长。

1．2．

1．5、透明肌肉组织经脱水后，石蜡也不能直接渗透进肌肉组织。此时还必须将肌肉块中所含的乙醇除去，除去乙醇的药品必须既能很好的与乙醇相溶，又能与石蜡相溶。经这种药品处理过的肌肉，使肌肉呈现透明状，所以称为透明剂。因此，这种处理程序就叫透明。这里采用的透明剂是二甲苯。当肌肉组织中的乙醇被透明剂替代后，肌肉组织才能透蜡包埋。

透明步骤为：

将组织块浸入二甲苯与无水乙醇（1：1）的混合液30min→二甲苯30min→二甲苯30min。

1．2．

1．6、透蜡是使包埋剂透入进肌肉组织的各个部分的过程。透蜡是肌肉组织可在切片机上制作切片的需要。石蜡在常温下呈固体状，它是具有一定的熔点，透蜡时必须使石蜡熔化为液体状态才能使石蜡渗入肌肉组织，所以透蜡过程必须在恒温箱中进行。

透蜡步骤为：

将组织块浸入二甲苯与石蜡（1：1）的混合液30min→石蜡30min→石蜡30min。

1．2．

1．7、包埋将完成透蜡程序的肌肉组织块包埋在含有石蜡的小纸盒内，便于保存及制作薄的石蜡切片。包埋时把熔化的石蜡倒入小容器内，然后迅速夹取肌肉组织放入小容器中，并适当调整肌肉组织块的位置和方向，待容器中的石蜡迅速凝成蜡块。

1．2．

1．8、切片肌肉组织块经上述各程序的处理后，不仅变得较硬，而且有了石蜡的支撑，经修整后便可以放在切片机上切成极薄的石蜡切片。切片的厚度为8um。

1．2．

1．9、贴片把由切片机上切下的含有肌肉组织的蜡条割成小段，再将小段蜡条安放在均匀涂过蛋白质的载玻片上，滴上蒸馏水使其在展片台上加热，在加热过程中使蜡条适当地伸展开，以此使组织伸展平正，然后把玻片上多余的水分去掉。

1．2．

1．10、烘片把贴好蜡片的载玻片置于37℃的恒温箱中烘烤24小时以上，使切片干燥。

1．2．2染色

以下各步骤均需在染色缸中进行，所以需预先准备好一套清洁的染色缸，分别贴上系列标签并加入相应的药品。

1．2．

2．1、脱蜡通过切片、贴片及烘片后，肌肉组织仍埋藏在蜡中，为了使肌肉组织顺利染上色，必须先将肌肉组织切片上的蜡去掉，因此要把贴片烘干后的的玻片放入含有二甲苯的染色缸内，使蜡溶解在二甲苯中。

脱蜡程序为：

纯二甲苯（脱蜡）15min→纯二甲苯15min→二甲苯：

纯乙醇（1：1）3min

1．2．

2．2、复水在肌肉组织透蜡包埋前已把肌肉组织中的水去除干净了，而没有经过复水处理的肌肉组织切片不能放入水溶性的染料中染色，所以染色前肌肉组织切片中必须经复水处理，也就是使得肌肉组织中含有水分。肌肉组织切片复水过程必须逐渐进行，即从纯乙醇——经下降的各浓度系列酒精直至水，每级3~5分钟。在水中的放置时间要稍加长，大约10分钟以上，苏木精染液才能上色。

复水程序为：

纯乙醇3min→95%乙醇3min→90%乙醇3min→80%乙醇3min→70%乙醇

3min→60%乙醇3min→50%乙醇3min→30%乙醇3min→蒸馏水

1．2．

2．3、染色组织或细胞的许多结构在自然状态下是无色或具有很淡的颜色的，要区分出组织和细胞的各种结构是极为困难的，为了更好地对组织的各种结构进行观察，必须染色。染色时将切片放入预先制好的染色剂内，根据不同的目的、不同的染色剂的要求染色一定时间后取出切片，切片再行水洗、分色或复染等程序的处理。本实验的染色采用苏木精（hematoxylin）、伊红（eosin）染色法，简称为H、E染色法。