静电纺纳米纤维用于组织再生(莫秀梅)

静电纺纳米纤维用于组织再生莫秀梅,东华大学化学化工与生物学院1.背景和前言1.1.理想的组织工程支架需要有天然细胞外基质的纳米丝结构1.在临床上每天都可以见到许多组织缺损的问题，组织工程学和转化医学的发展为组织缺损的修复和再生提供了有效途径，然而组织再生的关键是要为缺损组织提供一个暂时的替代支架，暂时替代原有组织，诱导细胞的长入和新组织的形成，待组织形成后支架在体内降解。

已有的组织工程支架制备方法适用于一些大的组织象骨和软骨支架的制备，但是对一些精细的和具有功能性的组织，象血管和神经等还没有制备出理想的组织再生支架。

仿生功能化静电纺纳米纤维为这些精细组织工程支架的制备提供了新思路和新方法，使组织工程支架发展进入了一个新的阶段，即纳米仿生组织细胞间质(细胞外基质)的阶段。

实际上人体内细胞外基质本质上是由蛋白和糖氨聚糖(GAGs)复合而成的纳米纤维凝胶网络，纤维直径通常为50-300nm[Piez KA,1984]。

人体组织就是细胞镶嵌在这些纳米纤维凝胶网络中，见图1。

细胞通过细胞膜上的受体系统与细胞外基质上的配体特异性结合并对外界信号做出反应，影响细胞行为。

组织工程支架材料就是要起到仿生组织细胞间质的作用。

另外,若支架材料的骨架尺寸过大时,在组织的形成过程中,因不能适时降解常有阻断组织有序调整的现象,有时只能形成疤痕,达不到再生有序组织的目的。

这又对支架材料提出了新的要求，即尽可能的与组织的细胞间质相似。

有实验证明当支架材料的骨架尺寸大小从毫米级降到微米级纤维时,那种有碍组织有序调整的现象明显消失[Kim B-S,1998]。

最近已发现纳米纤维结构已明显改善了组织工程支架材料在骨、软骨、心血管、神经和膀胱再生上的应用，减少了疤痕的形成[Patch K,2003]。

研究表明，纳米材料对细胞行为有显著影响。

Pattison等[Pattison MA,2005]采用纳米级PLGA支架接种平滑肌细胞体外构建组织工程膀胱，发现与传统微米级支架相比，细胞在小于自身尺度的纳米支架上具有更好的粘附和生长能力，且能分泌更多的胶原和弹性蛋白。

Elias等[Elias KE,2002]的研究也证实了成骨细胞的增殖能力随着碳纳米纤维的直径减小而增强，且碱性磷酸酶和钙质的分泌也随纤维直径减小而增多。

2005年，Stevens等[Stevens MM,2005]在Science上撰文比较了不同的支架结构对细胞行为的影响，认为细胞以平铺的方式黏附于微米级支架上，且伸展方式与在平整表面上类似。

而纳米级支架（如纳米纤维）更大的表面积有利于吸附更多的蛋白质，能够为细胞膜上的受体提供更多的黏附位点，吸附的蛋白质也可通过改变构象暴露更多隐蔽的黏附位点，从而有利于细胞黏附和增长（图2）。

因而以纳米纤维制备的细胞支架能仿生人体内细胞外基质的物理结构，促进组织的再生。

1.2.静电纺纳米纤维能仿生组织细胞外基质的结构和功能静电纺纳米纤维仿生细胞外基质用于组织工程在近些年受到特别关注，利用静电纺能够将几乎所有的组织工程材料纺成纳米纤维，包括合成高分子材料，如PLA、PGA、PCL及其共聚物和天然高分子材料，如胶原、明胶、纤维蛋白、蚕丝、蜘蛛丝等天然蛋白质和壳聚糖、透明质酸、纤维素等多糖类材料[Yoshimoto H,2003][Min Byung-Mo,2004]，对同一种材料又可以控制得到纤维无规排列，或不同程度平行排列的表面结构，以及层与层之间无规，或平行，或十字交错叠加等三维结构。

纳米纤维的取向排列可以引导细胞沿纤维取向增殖[Xu CY,2004]，从而可以设计用于具有取向结构的组织再生。

纳米纤维除了能从结构上仿生细胞外基质，同轴静电纺也使得从功能上仿生组织细胞外基质成为可能。

利用同轴静电纺可以将活性因子和功能性因子纺入纳米纤维中使之缓慢释放而得到具有特殊功能的组织工程支架。

例如，将肝素纺入纳米纤维血管支架中得到抗凝血血管支架[Su Yan,2011]；将神经生长因子纺入纳米纤维神经导管中得到具有促进神经再生功能的神经导管[Wang Chunyang,2012]；将骨形成蛋白纺入纳米纤维骨再生支架中诱导间充质干细胞向成骨细胞转化[Su Yan,2012]。

因此开展静电纺纳米纤维仿生功能化生物材料的研究以用于组织再生是非常必要的，并且对组织工程和转化医学的发展具有科学意义，对人类的健康具有社会意义。

2.研究内容2.1.蛋白-多糖复合纳米纤维的制备及研究天然细胞外基质是由胶原蛋白和粘多糖组成的纳米丝交织而成，为了从组成上和结构上仿生组织细胞外基质，我们对蛋白-多糖复合纳米纤维进行了研究，首次将胶原蛋白和壳聚糖纺成复合纳米纤维[Chen Zonggang2007,2009],将丝素蛋白和壳聚糖纺成复合纳米纤维[Zhang Kuihua, 2011],以及将丝素蛋白和透明质酸纺成复合纳米纤维[Zhang Kuihua,2012].研究了胶原蛋白和壳聚糖复合纳米纤维单丝及纳米纤维膜的力学性能[Chen Zonggang,2009],发现胶原蛋白和壳聚糖复合纳米纤维单丝的断裂强度和断裂伸长高于单组份胶原蛋白和壳聚糖的纳米纤维的测试值。

当壳聚糖的含量为20%时复合纳米纤维的断裂伸长为45%，而胶原蛋白纳米纤维的断裂伸长为4%，壳聚糖纳米纤维的断裂伸长仅为1%。

当壳聚糖的含量为40%时复合纳米纤维的断裂强度为63MPa，而胶原蛋白纳米纤维的断裂强度为23MPa，壳聚糖纳米纤维的断裂强度仅为17MPa。

胶原蛋白和壳聚糖复合纳米纤维膜也在壳聚糖含量为20%表现出一定的弹性，断裂伸长为73%，断裂强度为2MPa。

胶原蛋白和壳聚糖复合纳米纤维的力学性能优于单组份纳米纤维是由于胶原蛋白与壳聚糖复合时存在着分子间的相互作用[Chen Zonggang,2008]。

将胶原蛋白与壳聚糖复合不仅可以得到力学性能优良的纳米纤维，而且可以改善其生物学性能[Chen Zonggang,2010],用平滑肌细胞在不同壳聚糖含量的复合纳米纤维上培养，发现细胞在壳聚糖含量为20%时增殖速率最快。

人体组织细胞外基质由胶原蛋白中加入少量粘多糖组成，蛋白与多糖的组成有利于细胞的增长。

2.2.胶原蛋白-壳聚糖-P(LLA-CL)复合纳米纤维的制备及研究蛋白-多糖复合纳米纤维的研究得到胶原蛋白-壳聚糖复合纳米纤维的断裂强度为2MPa，这样强度的组织工程支架对皮肤再生是合适的，但是用于像小血管，神经导管和肌腱等组织再生,这样的力学性能还远不能满足需要。

合成材料有优良的力学性能，例如乳酸和己内酯的共聚物（P(LLA-CL)）通过调节共聚比可以得到不同力学性能的材料，将天然材料与P(LLA-CL)复合制备纳米纤维有望得到既具有优良的力学性能又具有生物相容性的组织工程支架。

我们首次制备出胶原蛋白-壳聚糖-P(LLA-CL)复合纳米纤维[Yin Anlin,2012]，研究了胶原蛋白-壳聚糖-P(LLA-CL)复合纳米纤维的力学性能与三种材料复合比关系。

纯P(LLA-CL)纳米纤维的断裂强度为13MPa，断裂伸长为330%，表现出弹性材料的应力应变行为。

发现当胶原蛋白-壳聚糖-P （LLA-CL）的比例为20:5:75时复合纳米纤维的抗张强度最大，为17MPa，弹性模量最高为11MPa，此时复合纳米纤维的断裂伸长可保持为110%。

用此复合比制备的血管支架爆破强度也最高，为3300mmHg，顺应性为0.75%/100mmHg。

此复合比列下得到了类似人体血管的力学性能，因此胶原蛋白-壳聚糖-P（LLA-CL）具有20:5:75复合比时可用作最佳纳米纤维血管支架。

胶原蛋白-壳聚糖-P（LLA-CL）复合纳米纤维的水接触角也与复合比有关，随着胶原蛋白-壳聚糖含量的能加，水接触角降低，说明生物相容性增加。

内皮细胞在复合纳米纤维上的增殖实验表明，胶原蛋白-壳聚糖-P（LLA-CL）复合纳米纤维上细胞的增殖能力要高于纯P(LLA-CL)纳米纤维和胶原蛋白-壳聚糖纯天然纳米纤维。

胶原蛋白-壳聚糖-P（LLA-CL）复合纳米纤维表现出比纯组分材料更高的力学性能和更好的生物相容性。

2.3.丝素蛋白-P(LLA-CL)复合纳米纤维的制备及研究我们首次将丝素蛋白和P(LLA-CL)纺成复合纳米纤维,并对其力学性能和生物学性能进行了研究[Zhang Kuihua,2010]。

纯P(LLA-CL)纳米纤维的抗张强度为 6.96MPa，断裂伸长为458%，表现出弹性材料的应力应变行为。

当少量丝素蛋白加入，即丝素蛋白含量为25%时，丝素蛋白-P(LLA-CL)复合纳米纤维的抗张强度达到最大值为10.6MPa，断裂强度可保持为279%。

但是丝素蛋白含量进一步增加时力学性能下降，丝素蛋白纳米纤维的抗张强度仅为 2.72MPa，断裂伸长仅为 3.85%。

丝素蛋白-P(LLA-CL)复合纳米纤维的水接触角随着丝素蛋白含量的能加而下降，说明丝素蛋白的加入改善了P(LLA-CL)的生物相容性。

内皮细胞在丝素蛋白-P(LLA-CL)复合纳米纤维上的增殖实验显示，细胞在复合纳米纤维上的增殖速率快于在纯丝素蛋白和纯P(LLA-CL)纳米纤维上的值，特别当丝素蛋白含量为25%是达到最高值。

丝素蛋白-P(LLA-CL)复合纳米纤维表现出比纯组分材料更高的力学性能和更好的生物相容性。

这一结果与胶原蛋白-壳聚糖-P（LLA-CL）复合纳米纤维一致。

说明天然材料与合成材料复合制备纳米纤维是制备具有优良力学性能和生物相容性组织工程支架的最佳途径。

我们还对丝素蛋白-P(LLA-CL)复合纳米纤维的体外37度在PBS缓冲液中的降解性能进行了研究[Zhang Kuihua,2011]。

发现P(LLA-CL)纳米纤维在三个月时失去了纳米纤维的形态，六个月时重量损失50%；丝素蛋白-P(LLA-CL)（25:75）复合纳米纤维在六个月时失去了纳米纤维的形态，此时重量损失27%；丝素蛋白六个月时依然保持纳米纤维的形态，重量损失仅为6%。

P(LLA-CL)纳米纤维的体外降解速率快，丝素蛋白的加入降低了P(LLA-CL)纳米纤维的体外降解速率。

同时发现P(LLA-CL)降解释放出酸性，加入丝素蛋白后降解液的酸性有所缓解。

2.4.皮芯结构纳米纤维的制备及研究静电纺纳米纤维的直径通常为几百纳米，这样细的纤维还可以纺的具有皮芯结构。

我们分别用同轴静电纺的方法[Li Xiaoqiang,2009][Su Yan,2009]和乳液静电纺的方法[Li Xiaoqiang, 2009][Su Yan,2009]制备出皮芯结构的纳米纤维。

我们用胶原蛋白作为壳层材料，用聚氨酯作为芯层材料，同轴共纺制备出胶原蛋白聚氨酯皮芯结构的纳米纤维，芯层材料提供了优良的力学性能，壳层材料提供了优良的生物相容性，此法制备的皮芯结构的纳米纤维适用于多种组织再生支架的应用[Chen Rui,2010]。