脱氧核酶传感器研究进展

　第28卷第2期2013年4月 大学化学

UNIVERSITY CHEMISTRY Vol.28No.2

Apr.2013　

脱氧核酶传感器研究进展

聂绩　周颖琳*　张新祥*

(北京大学化学与分子工程学院　北京100871)

摘要　脱氧核酶是利用体外分子进化技术获得的一类具有高效催化活性和结构识别能力的单链DNA片段㊂本文主要介绍了两类脱氧核酶,即RNA切割型脱氧核酶和G⁃四聚体型脱氧核酶在生物传感体系中的发展和应用㊂

关键词　脱氧核酶　RNA切割型　G⁃四聚体型　传感器

1982年,Cech等[1]发现四膜虫核糖体RNA基因转录产物的I型内含子剪切与外显子拼接过程无需任何蛋白质存在,这打破了酶的化学本质是蛋白质的概念,证明了RNA具有酶的催化功能㊂1983年,Altman等[2]在研究核糖核酸酶P时发现具有切割核糖体RNA前体功能的RNA,并证明其具有全酶活性㊂因为核酶(ribozyme)的发现,Cech和Altman共享了1989年诺贝尔化学奖㊂1994年,Breaker和Joyce等[3]利用体外定向分子进化技术筛选得到第一条人工合成的具有切割磷酸二酯键功能的单链DNA,这种具有酶催化功能的DNA就叫做脱氧核酶(deoxyribozyme或DNAzyme)㊂核酶与脱氧核酶构成了功能核酸的重要部分,核酶包括天然与人工合成核酶;但至少目前为止,自然界没有发现天然脱氧核酶㊂人工合成的脱氧核酶迄今已有100多种[4],由于其结构与功能的多样性,广泛应用于基因治疗㊁核酸分析㊁传感器构建等领域㊂

1　脱氧核酶基本概念

脱氧核酶的化学本质是DNA㊂相较于RNA而言,脱氧核酶缺少呋喃糖环2⁃OH,这决定了脱氧核酶的结构稳定性强于以RNA成构的核酶㊂所有脱氧核酶均为单链,同RNA相似,可以形成复杂多样的折叠结构并显示出催化功能㊂脱氧核酶可以催化多类反应,如RNA或DNA切割㊁DNA连接㊁DNA水解等[5]㊂与传统的蛋白酶相比,脱氧核酶具有稳定性高,相对分子质量小,易化学合成㊁修饰与复制,受pH 等环境因素影响小等优势㊂脱氧核酶非常容易进行以核酸为识别模式或者信号表达模式的传感器构建;另外,脱氧核酶具有对DNA进行连接与断裂的催化能力,可以应用到基因调控与治疗中㊂

各种功能多样性的脱氧核酶可通过合理设计不同的体外筛选方式获得㊂筛选过程往往是从一个固相化学合成的DNA随机文库出发,通过合理设计,将能够催化与不具备催化能力的寡核苷酸序列区分开;再利用聚合酶链式反应(PCR),对具有催化能力的序列进行扩增,扩增后获得一个新的文库并应用于下一轮筛选㊂文库中特异性序列纯度随循环筛选过程进行而增加,直至达到较高催化活力水平时结束筛选㊂完成筛选后,需要对获得的序列进行表征以及效应评价㊂一般来说,在体外筛选过程中,需要进行反向筛选,以有效消除没有催化活性的 寄生序列”;也可结合突变与修饰辅助重新筛选提高酶活性㊂也就是说,应针对不同的筛选目的,合理设计与优化筛选方式㊂

脱氧核酶的催化功能特性改变了核酸仅仅是编码以及遗传信息携带者的观念㊂目前,在分子生物学以及基因工程上,脱氧核酶主要是作为一种工具酶存在[6]㊂脱氧核酶可以在细胞水平上敲除某特异*通讯联系人,E⁃mail:zhouyl@;zxx@

性基因,通过观察该敲除基因对于细胞生理过程中的作用,可以探明其功能㊂此外,利用脱氧核酶能特异性切断信使RNA,可建立信使RNA水平上有效的基因灭活㊂通过调控蛋白质表达阻断基因表达,可实现对于某些生理㊁代谢途径的调节调制㊂例如,10⁃23脱氧核酶被用于切断人c⁃mycmRNA的起始密码子A㊃UG位点[7]㊂本文将重点介绍脱氧核酶在传感器领域的应用,其中主要涉及RNA切割型和G⁃四聚体型㊂

2　基于脱氧核酶的传感器

传感器是一种对物理或化学信息响应并产生可检测信号的设备㊂其包括靶标识别与信号转换两个部分:靶标识别元件的作用是识别靶标,必须具备响应迅速㊁动态范围宽㊁特异性高㊁稳定性好以及普适性高的特点;信号转换元件则是将识别事件转换为信号,且信号与靶标浓度之间具有一定的定量关系㊂通常信号转换元件可以将靶标识别转化为荧光㊁比色㊁发光㊁电化学信号等㊂功能核酸包括核酶㊁脱氧核酶㊁核酸适体以及适体核酶,其靶标范围非常广泛,涉及金属离子㊁有机小分子㊁生物大分子甚至细胞与病毒等㊂正由于可以特异性识别大量靶标,功能核酸已经成为构建靶标识别元件的重要平台[8]㊂

脱氧核酶在生物基质中比核酶更稳定,且一般尺寸更小,可控性更强,价格便宜且易于合成㊂因此,目前较广泛研究的是脱氧核酶构建的传感器㊂构建方式主要是利用靶分子作为辅因子能够促进脱氧核酶切断RNA的反应,从而实现对靶分子(金属离子或者氨基酸等)的定量检测㊂另一方面,具有过氧化物酶活性的脱氧核酶可以用作识别元件本身或者构建信号转导元件㊂下面对这两类脱氧核酶传感器作详细阐述㊂

2.1　RNA切割型脱氧核酶传感器

具有RNA切割功能的脱氧核酶往往需要金属离子或氨基酸等辅因子参与,但也存在无需任何辅因子的RNA切断㊂10⁃23型脱氧核酶和8⁃17型脱氧核酶是两种典型的RNA切割型脱氧核酶,可分别切割嘌呤⁃嘧啶连接以及AG连接㊂金属离子的存在可促进DNA的正确折叠以及中间过渡态的稳定,形成催化中心并具有催化活性㊂此外,还可以屏蔽寡核苷酸的负电荷,以利于酶链与底物链的趋近与结合㊂目前已发现Pb2+㊁Mg2+㊁UO2+2㊁Zn2+㊁Mn2+等离子依赖的RNA切割型脱氧核酶㊂如图1所示为8⁃17E Pb2+特异性切割脱氧核酶,Pb2+存在下,可在底物链rA位点进行有效切割㊂目前利用RNA切割型脱氧核酶

构建的传感器主要用于检测辅因子,根据信号转导方式不同主要分为荧光型㊁比色型以及电化学型

㊂

图1　8⁃17E Pb2+特异性切割脱氧核酶结构示意图

2.1.1　荧光型

分子信标(molecular beacon)是利用发卡结构与靶分子相互作用,使末端标记的荧光基团(F)与猝灭基团(Q)由靠近变为相互远离,从而使荧光信号增强(图2(A))㊂脱氧核酶切割反应过程类似于分子信标的原理,被称为催化信标㊂在脱氧核酶催化信标中,可以通过灵活地选取合适的标记位点(图2 (B~G))设计不同类型的标记型荧光传感器㊂Lu等[9]在底物链与酶链末端分别标记荧光基团与猝灭基团(图2(C)),利用底物链断裂导致的荧光增强,可实现Pb2+1×10-8~4×10-6mol/L的定量检测㊂由2大学化学第28卷