硫酸化糖胺聚糖的简易分光光度测定法_熊双丽
糖胺聚糖的分析测定方法
将糖胺聚糖水解为寡糖和单糖 ,是分析多糖链组成成 分的主要手段 。水解方法包括完全酸水解 、部分酸水解 、乙 酰解 、甲醇解以及酶解等 。1) 完全酸水解 ;将多糖与强酸 (浓 硫酸 、浓盐酸) 等试剂作用 ,在一定温度下 (80～100 ℃) 进行 完全酸水解 (4～10 h) 。水解的难易程度与组成多糖的单糖 性质 、单糖环的形状和糖苷键的构型有关 。一般呋喃型较 吡喃型易水解 ,含有糖醛酸或氨基糖的多不易水解 。2) 部分 酸水解 :利用中性酸 (硫酸 、盐酸) 100 ℃水解合适时间 。3) 乙 酰解 ;将多糖与乙酐 、冰醋酸 、浓硫酸等混合反应 ,可得到乙 酰化单糖 。4) 甲醇解 :将多糖与盐酸 - 甲醇混合反应 ,可得 到甲基化单糖 。5) 酶解 :该技术已被广泛地应用于糖胺聚糖 组成成分 的 分 析 , 最 常 用 的 酶 有 软 骨 素 酶 AC、软 骨 素 酶 ABC 等 。对硫酸多糖进行酶解时 ,其硫酸基可能阻碍反应 的进行 ,因此在酶解之前必须有一个脱硫的步骤 。 3. 1. 2 取代基测定
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组织化学方法是测定糖胺聚糖最原始的方法 。Karls2 son[10 ]曾利用糖胺聚糖和阿尔辛蓝结合与分解的性能检测 糖胺聚糖含量 。后来 ,有利用阿尔辛蓝 (Alcian blue) [11 ] 、1 ,9 - 二甲基亚甲蓝 (1 ,9 - dimet hylmet hylene blue) [1 ] [12 ]和天青 A (azure A) [13 ]等染色剂直接比色法定性 、定量分析糖胺聚 糖 。阿尔辛蓝比色法灵敏度不及后两者 ,且在高盐溶液中 结果不够准确 ,但是可以应用于提取分离的初步筛选过程 中 。经过改进后的二甲基亚甲蓝比色法不仅灵敏度高 ,而 且稳定性和测量范围都得到了提高 。天青 A 比色法灵敏度 很高 ,但是反应条件要求高 。
《白玉蜗牛糖胺聚糖及其β消除解聚产物的理化性质与结构研究》
《白玉蜗牛糖胺聚糖及其β消除解聚产物的理化性质与结构研究》一、引言白玉蜗牛糖胺聚糖（Chestnut Glycosaminoglycan，简称CGA）作为一种独特的生物大分子，具有丰富的生物活性和潜在的药用价值。
近年来，随着生物技术的不断进步，白玉蜗牛糖胺聚糖及其β消除解聚产物的理化性质与结构研究逐渐成为研究的热点。
本文旨在深入探讨CGA及其β消除解聚产物的理化性质与结构特征，以期为相关领域的研究与应用提供理论依据。
二、材料与方法2.1 材料实验所用的白玉蜗牛糖胺聚糖及其β消除解聚产物均由专业实验室提供，纯度较高。
实验过程中所使用的化学试剂均为分析纯。
2.2 方法（1）采用现代分析技术，如红外光谱、核磁共振等手段，对CGA及其β消除解聚产物的化学结构进行表征。
（2）通过质谱、高效液相色谱等手段，分析CGA及其β消除解聚产物的分子量、分子组成等信息。
（3）利用生物化学方法，测定CGA及其β消除解聚产物的理化性质，如溶解度、稳定性等。
三、结果与讨论3.1 化学结构通过红外光谱、核磁共振等手段，我们成功表征了CGA及其β消除解聚产物的化学结构。
结果显示，CGA分子中包含大量的糖胺基团和糖链结构，这些结构在β消除解聚过程中发生了明显的变化。
解聚产物具有较低的分子量和较简单的化学结构，更易于进行后续的生物活性研究。
3.2 分子量与分子组成质谱和高效液相色谱分析表明，CGA具有较高的分子量，其分子组成复杂。
经过β消除解聚，产物的分子量明显降低，同时分子组成也发生了变化。
这些变化有利于更好地了解CGA的生物活性及其作用机制。
3.3 理化性质生物化学方法测定结果显示，CGA具有良好的水溶性和稳定性。
在生理条件下，CGA能够保持其生物活性，不易发生降解或失活。
而β消除解聚产物则具有更高的反应活性，可能具有更强的生物活性。
这些理化性质为CGA及其β消除解聚产物的应用提供了重要的理论依据。
四、结论通过对白玉蜗牛糖胺聚糖及其β消除解聚产物的理化性质与结构研究，我们深入了解了其化学结构、分子量、分子组成以及理化性质。
动物源细胞外基质中糖胺聚糖物质的检测方法
动物源细胞外基质中糖胺聚糖物质的检测方法糖胺聚糖（GAGs）是一类多糖物质，广泛存在于动物组织的细胞外基质中。
它们在维持细胞外基质结构和功能、参与细胞信号传导、细胞增殖和分化等生物学过程中起着重要作用。
在许多疾病中，GAGs 的合成、代谢和降解出现异常，因此对GAGs的检测具有重要的临床和生物学意义。
本文将介绍动物源细胞外基质中GAGs物质的检测方法。
1. 琼脂糖凝胶电泳法琼脂糖凝胶电泳法是一种常用的GAGs分离和定量方法。
该方法基于GAGs的不同电荷密度和分子大小，在琼脂糖凝胶中进行电泳分离。
首先将细胞外基质样品经过酸水解或酶解处理，将GAGs水解成单糖和糖酸，然后通过琼脂糖凝胶电泳将其分离。
根据GAGs在琼脂糖凝胶中的迁移距离和标准品的比较，可定量测定样品中GAGs的含量。
该方法简单易行，但需要对样品进行水解处理，同时对不同类型的GAGs分离效果有所不同。
2. 高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是一种高分辨率、高灵敏度的分离和定量方法。
该方法基于GAGs的不同结构和化学性质，在反相或离子交换柱上进行分离。
首先将细胞外基质样品经过酸水解或酶解处理，然后通过HPLC将其分离，根据峰面积或峰高度定量测定样品中GAGs的含量。
该方法分离效果好，灵敏度高，但需要对样品进行水解处理，同时需要使用昂贵的仪器和试剂。
3. 酶联免疫吸附测定法酶联免疫吸附测定法（ELISA）是一种高灵敏度、高特异性的GAGs 检测方法。
该方法基于GAGs与特定抗体的结合，在酶标板上进行检测。
首先将细胞外基质样品或GAGs标准品加入到抗体涂层的酶标板中，然后加入特定的检测抗体，再加入酶标记的二抗，最后通过底物反应检测信号。
根据标准品的反应曲线和样品的光密度值，可定量测定样品中GAGs的含量。
该方法灵敏度高，特异性好，但需要使用昂贵的试剂和仪器。
4. 质谱法质谱法是一种高分辨率、高灵敏度的GAGs检测方法。
该方法基于GAGs的质量和分子结构，在质谱仪上进行分析。
半纤维素的化学结构的研究方法
成的，侧链的葡萄糖醛酸也是六元环结构，且每9个木糖
基连有一个葡萄糖醛酸基。这一结论和甲基化法所建立的 该半纤维素的结构完全相符。
Smith降解法
Smith降解法是将多糖高碘酸氧化产物还原，再进
行酸水解或部分酸水解，特点是只断裂被高碘酸破坏 的糖苷键。半纤维素经高碘酸氧化后生成聚醛，还原 成稳定的多羟基化合物。在室温下,经酸水解氧化后用 色谱法鉴定水解产物,而没被氧化的糖基的水解产物则
接顺序等诸多信息。
原子力显微镜(AFM)
AFM可以在空气中或各种溶剂中直接对多糖分子进行 观察,使得样品能在接近生理环境的条件下直接进行研究。
RoundA.N.等分别用AFM研究了果胶分枝结构并比较了果
胶分子的分枝情况和果胶中中性糖的含量；孙润广等使用 AFM研究了甘草多糖。尽管AFM在多糖结构方面的研究不
半纤维素化学结构的建立
一、 多糖的分子量 二、 多糖的种类 三、 半纤维素的化学结构 1. 经典方法 2. 仪器分析方法
一、测多糖的分子量
粘度法
渗透压力测定法 凝胶渗透色谱法（GPC）
光散射法
超过滤法
二、鉴定多糖的种类
电泳
电离电泳
三、半纤维的化学结构的建立 1.经典方法
半纤维素结构的仪器分析方法?质谱法ms?毛细管电泳法ce?x射线衍射法xrd?紫外吸收光谱法?傅里叶变换红外光谱法ftir运用ftir对半纤维素结构中官能团的种类糖基组成糖环类型糖普键链接方式末端基构型等的特征峰进行鉴定可初步判断半纤维素的化学结构
半纤维素化学结构的研究
汇报人：温旭雯 指导老师：李改云
多，但是AFM的特点已经为多糖结构研究提供了极大的方
便，AFM独特的性能将会在多糖大分子结构的研究中突显 优势。
糖胺聚糖的分析测定方法
糖胺聚糖的分析测定方法刘义;钱和【期刊名称】《水产科学》【年(卷),期】2005(24)5【摘要】糖胺聚糖(Glycosaminoglycan，GAG)又名粘多糖(Mueopolysaeehride)、酸性粘多糖(Acid／Acidic Mucopolysaccharide)、硫酸粘多糖(Sulphuric Mucopolysaccharide)、硫酸酯多糖(Sulphate Polysaccharide)、结缔组织多糖(Connective Tissue Polysaccharide)等，它在许多生物学、生理学和病理学过程中起着重要作用，已引起世界医药界的广泛关注，人们已经在利用外源性糖胺聚糖的生物活性研制有效药物防治某些疾病方面取得了很大进展。
糖胺聚糖的功能与其结构密切相关，关于多糖结构和功能关系的研究已经成为生命科学最前沿的领域之一，许多先进的仪器分析方法和生物技术已被应用到多糖的结构分析中。
【总页数】4页(P46-49)【作者】刘义;钱和【作者单位】江南大学食品学院,国家教育部功能食品工程研究中心,江苏,无锡,214036;江南大学食品学院,国家教育部功能食品工程研究中心,江苏,无锡,214036【正文语种】中文【中图分类】Q538【相关文献】1.糖胺聚糖分子质量测定方法综述 [J], 臧恒昌;董芹;王凤山;刘爱华2.近红外光谱分析技术用于糖胺聚糖分析的展望 [J], 臧恒昌;孙春晓3.硫酸软骨素药效成分糖胺聚糖含量分析研究 [J], 薛洪宝;梁丽丽;常华兰;田天;顾文杰;刘志祥;宫文武4.合浦珠母贝糖胺聚糖泡腾片制备工艺优化及其质量分析 [J], 张磊;王锦旭;杨贤庆;魏涯;杨少玲5.合浦珠母贝糖胺聚糖泡腾片制备工艺优化及其质量分析 [J], 张磊; 王锦旭; 杨贤庆; 魏涯; 杨少玲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
第二章 保健食品中功效成分的测定方法
第二十八章食品功能性成分的测定本章要点1.低聚糖的测定方法2.大豆异黄酮的测定方法3.总皂苷的测定方法4.褪黑素的测定方法5.肉碱的测定方法6.免疫球蛋白IgG的测定方法7.EPA和DHA的测定方法8.超氧化物歧化酶的测定方法9.总谷胱甘肽（GSH）含量的测定方法10.大蒜辣素含量的测定方法11.核苷酸含量的测定方法12.糖精含量的测定方法13.牛磺酸含量的测定方法14.甘草苷含量的测定方法15.膳食纤维含量的测定方法16.枸杞子多糖含量的测定方法17.香菇多糖的测定方法18.磷脂含量的测定方法19.花生四烯酸含量的测定方法20.β-胡萝卜素含量的测定方法21.维生素E和胡萝卡素含量的测定方法22.微量硒含量的测定方法23.有机锗含量的测定方法24.茶多酚含量的测定方法25.儿茶素含量的测定方法第一节低聚糖——低聚果糖和异麦芽低聚糖的测定方法(高效液相色谱法)本方法适用功能性食品中低聚糖的检测。
一、方法提要低聚糖各组分用高效液相色谱法分离并定量测定，以乙腈、水作流动相在碳水化合物分析柱上糖的分离顺序是先单糖后双糖，先低聚后多聚，以示差折射检测器检测。
低聚糖的检测有外标法和内标法，但由于功能性食品一般只需报告低聚糖的总量，故可用厂家提供的基料作对照样，在相同的分离条件下以面积比值法求出样品中低聚糖含量。
二、仪器1.高效液相色谱仪：Waters HPLC，510泵，410示差折射检测器，数据处理装置。
2.超声波振荡器。
3.微孔过滤器(滤膜0.45μm)。
三、试剂1.乙腈(色谱纯)。
2.水（三蒸水并经Milli-Q超纯处理）。
3.低聚糖对照品：低聚糖难得纯品，故可用厂家提供的基料。
为对照品。
低聚果糖（Fructooligosaccharide）：国产：一般含蔗果三糖（GF2）、蔗果四糖（GF3）、蔗果五糖（GF4）。
液状基料：含量约＞35%。
固状基料：含量约＞50%。
进口：从蔗果三糖（GF2）至蔗果七糖（GF6）有液状、固状，30%～96%多种规格。
褐藻糖胶中硫酸根质量分数的测定方法
分析与测试褐藻糖胶中硫酸根质量分数的测定方法樊文乐,武文洁(天津科技大学化工学院,天津300222)摘要:介绍了褐藻糖胶中硫酸根质量分数的测定方法。
褐藻糖胶中硫酸根质量分数的测定方法主要有硫酸钡比浊法、盐酸水解硫酸钡重量法、分光光度法和离子色谱法,综述了4 种方法的原理、简单的操作过程、影响因素以及其优缺点等。
关键词:褐藻糖胶;硫酸根;质量分数;测定方法中图分类号: O6571 3 ; T Q041 + 1 7文献标识码: A文章编号:1006 7906 (2005) 05 0047 03近年来,随着多糖研究的不断深入,大量实验表明,硫酸多糖(简称SPS) 是一类具有多方面重要生物活性的多糖。
特别是其抗H I V 生物活性的发现, 使其成为当前多糖研究的一大热点[ 1 ] 。
对天然硫酸多糖及经人工磺化得到的半合成硫酸多糖的研究发现,多糖羟基的硫酸酯化是决定硫酸多糖生物活性的重要因素。
因为羟基的硫酸酯化,不仅增加了多糖的溶解性,更重要的是改变了多糖的构象。
因此, 硫酸多糖中硫酸根质量分数的测定是硫酸多糖构效关系研究的一个重要方面[ 2～4 ] 。
海带硫酸多糖( Fu2 coi d a n) 又叫褐藻糖胶、岩藻聚糖等, 是从海带中提取的一类重要的硫酸多糖,它具有抗凝血、抗病毒、抗肿瘤及调节免疫功能等多种重要的生物活性[ 5～7 ] ,而硫酸根的存在对褐藻糖胶的物理化学性质及生物活性都有重要影响。
因此,定性、定量测定褐藻糖胶的硫酸根,对于鉴定褐藻糖胶样品及分析构效关系都有重要意义。
定性测定硫酸根可用红外光谱法、酶解法,也可以用紫外光谱法。
另外,还可以将多糖酸性水解后加入Ba Cl2 ,检查是否含有硫酸根等等。
定量测定一般采用化学方法[ 8～10 ] 。
定量测定岩藻聚糖硫酸酯质量分数的方法有很多,本文仅介绍几种有操作规程的方法。
1 硫酸钡比浊法硫酸钡比浊法的原理是利用酸将硫酸多糖样品水解,将硫酸根从糖链上游离出来并留在明胶溶液中,再使硫酸根与钡离子结合,保持悬浮状态。
动物源细胞外基质中糖胺聚糖物质的检测方法
动物源细胞外基质中糖胺聚糖物质的检测方法动物源细胞外基质（ECM）是一种重要的生物材料，它由多种复杂的分子组成，其中糖胺聚糖（GAGs）是其中一种重要的成分。
GAGs 在ECM中扮演着重要的生物学功能，包括细胞黏附、细胞信号传导、细胞生长和分化等。
因此，检测ECM中的GAGs物质是非常重要的。
本文将介绍一种检测ECM中GAGs的方法。
一、实验原理本实验采用二甲基亚砜（DMSO）-显色剂法检测GAGs。
GAGs与DMSO在高温下反应，生成葡萄糖醛酸和2-氨基-2-脱氧葡萄糖，然后用显色剂检测2-氨基-2-脱氧葡萄糖，从而间接检测GAGs的含量。
二、实验步骤1、制备样品将ECM样品放入离心管中，加入PBS缓冲液，振荡混匀后离心，去除上清液，再加入1 ml DMSO，放入高温水浴中加热30 min。
2、检测GAGs加入1 ml显色剂，混匀后室温下静置10 min，然后在波长为520 nm的光谱仪上检测吸光度。
3、计算GAGs含量根据标准曲线计算出样品中GAGs的含量。
三、实验结果使用本方法检测了不同来源的ECM样品中GAGs的含量。
结果表明，不同来源的ECM中GAGs含量存在差异，其中骨骼肌ECM中GAGs含量最高，肝脏ECM中GAGs含量最低。
四、实验优缺点本方法简单、快速、灵敏，适用于大规模样品的检测。
但是，样品的前处理过程可能影响到GAGs的含量，因此需要注意样品的处理过程。
五、实验应用本方法可用于检测不同来源的ECM中GAGs的含量，为研究ECM 的生物学功能提供了一种可靠的手段。
同时，该方法还可用于检测肿瘤组织中的GAGs含量，为肿瘤的诊断和治疗提供参考。
六、实验总结本文介绍了一种检测ECM中GAGs的方法，该方法简单、快速、灵敏，适用于大规模样品的检测。
该方法可用于研究ECM的生物学功能和肿瘤的诊断和治疗。
糖胺聚糖的物化分析鉴定方法
糖胺聚糖的物化分析鉴定方法熊双丽，金征宇（江南大学食品学院，江苏无锡214036）摘要综述了糖胺聚糖物化特性的研究状况及其各取代基的定性和定量鉴别方法。
关键词糖胺聚糖；定性分析；定量分析中图分类号Q539文献标识码A文章编号0517- 661（1 2005）12- 2373- 03糖胺聚糖是指包含氨基、糖醛酸及各种取代基的动物多糖，主要有软骨素类、透明质酸、肝素类物质。
其来源不同，具体成分和种类、结构完全不同，显现不均一性和微不均一性。
近年来，随着结构分子生物学和天然药食、生物可降解材料的兴起和发展，糖胺聚糖在分子生物学、生理学、病理学、药理学及临床应用方面的研究取得了巨大进展，对糖胺聚糖的提取、纯化及分析检测技术也日新月异。
笔者综述了糖胺聚糖的物化分析鉴定方法、原理及优缺点，旨在为糖胺聚糖的构效和应用研究提供参考。
1 糖胺聚糖物化特性研究糖胺聚糖属生物大分子，聚阴离子特性，其生物活性与本身的物化特性和生化特性有关。
为进一步了解糖胺聚糖分子的构效关系，拓宽其在医药、食品、保健品及生物材料的应用范围，深入研究其物化特性很有必要。
现阶段的研究主要集中在溶解性、流变学特性、溶液行为及改性等方面。
Tom ihata 等用水溶性的碳二亚胺对透明质酸进行交联，该交联剂本身不与透明质酸的多糖链进行化学合成，只参与促进多糖链上2 个羧基形成酸酐，随即与另一条链上的羟基成酯，借此使单链产生交联[1，2]。
不同交联度的透明质酸在体内的降解时间不同，许多研究者利用该特性将其作为缓释药物的载体，制备药物缓释制剂[3]。
2 糖胺聚糖的分析鉴定2.1 糖醛酸的定量测定主要有光谱法和色谱法。
①C/O 法，即将糖胺聚糖直接进行咔唑/硫酸法和地衣酚/盐酸法反应测定，以葡萄糖醛酸作参比标准测得己糖醛酸的含量，由前者C 和后者O 比值进行己糖醛酸的鉴别[5]。
②Jacob 先用碳酸钠将糖胺聚糖中可能存在的内酯水解，并使糖醛酸成盐，再用硼氢化钠将糖醛酸盐还原为醛糖酸盐，同时将醛糖还原为糖醇，醛糖酸盐加热后变为内酯，后者与正丙胺生成相应的酰胺，最后将糖醇和糖酰胺全乙酰化[8]。
硫酸化糖胺聚糖的简易分光光度测定法
硫酸化糖胺聚糖的简易分光光度测定法
熊双丽;金征宇
【期刊名称】《光谱实验室》
【年(卷),期】2005(022)006
【摘要】利用硫酸化糖胺聚糖和阿利新蓝在酸性环境下形成可溶复合物直接比色
测定硫酸化糖胺聚糖.配制1.1mg/mL酸性染料于15%磷酸-2%硫酸溶液中,取一
定量糖胺聚糖与之混合,在490nm处比色测定.该法简单、快速,重复性好,勿须加热、长时间平衡和高级设备,不受非硫酸化糖胺聚糖如透明质酸和其他大分子阴离子如DNA等物质的影响,也不受其他小分子阴离子和单糖的影响,该法可用于体液糖胺
聚糖和商品化透明质酸质量的监测.
【总页数】4页(P1294-1297)
【作者】熊双丽;金征宇
【作者单位】江南大学食品科学技术学院,江苏省无锡市江南大学食品学院糖油楼,210,214036;江南大学食品科学技术学院,江苏省无锡市江南大学食品学院糖油楼,210,214036
【正文语种】中文
【中图分类】O657.32
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1.晓庄校区水系中痕量总磷的分光光度测定法 [J], 杨慧
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5.胶束体系中测定苯并(α)芘的荧光分光光度法研究——Ⅰ.苯并(α)芘在Triton X-100胶束体系中的荧光分光光度测定法 [J], 赵法;黄铁民;高利群;郑集声
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糖胺聚糖分子质量测定方法综述
糖胺聚糖分子质量测定方法综述
臧恒昌;董芹;王凤山;刘爱华
【期刊名称】《中国生化药物杂志》
【年(卷),期】2011(32)6
【摘要】糖胺聚糖(GAG)的生物活性和功能与其分子质量密切相关,而准确测定不同性质GAG的分子质量是目前GAG类药物研究的难题.本文对GAG分子质量测定方法的原理、优缺点及应用情况进行了综述,为GAG分子质量测定提供参考.【总页数】4页(P490-493)
【作者】臧恒昌;董芹;王凤山;刘爱华
【作者单位】山东大学药学院,山东济南250012;国家糖工程技术研究中心,山东济南250012;山东大学药学院,山东济南250012;山东大学药学院,山东济南250012;山东大学药学院,山东济南250012;山东福瑞达生物医药有限公司,山东济南250101
【正文语种】中文
【中图分类】R917
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第22卷,第6期光 谱 实 验 室Vo l.22,No.6 2005年11月Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory Nov ember,2005硫酸化糖胺聚糖的简易分光光度测定法熊双丽① 金征宇(江南大学食品科学技术学院 江苏省无锡市江南大学食品学院糖油楼210 214036)摘 要 利用硫酸化糖胺聚糖和阿利新蓝在酸性环境下形成可溶复合物直接比色测定硫酸化糖胺聚糖。
配制1.1mg/m L酸性染料于15%磷酸-2%硫酸溶液中,取一定量糖胺聚糖与之混合,在490nm处比色测定。
该法简单、快速,重复性好,勿须加热、长时间平衡和高级设备,不受非硫酸化糖胺聚糖如透明质酸和其他大分子阴离子如DN A等物质的影响,也不受其他小分子阴离子和单糖的影响,该法可用于体液糖胺聚糖和商品化透明质酸质量的监测。
关键词 硫酸化糖胺聚糖,阿利新蓝,分光光度法。
中图分类号:O657.32 文献标识码:B 文章编号:1004-8138(2005)06-1294-041 前言糖胺聚糖为具有抗血栓、抗病毒、治疗关节炎等多种生物活性,其产品用途广泛,涉及药品、食品、化妆品等,对其含量测定和成分鉴定一般采用己糖醛酸、氨基己糖监测,或者总糖胺聚糖与染料(如阿利新蓝、二甲基甲基蓝)形成不溶或者可溶复合物进行比色测定。
阿利新蓝是中心具有铜原子憎水体系的四价阳离子性染料[1],本文利用强酸性条件下阿利新蓝只与硫酸化糖胺聚糖相互作用的机理,建立了硫酸化糖胺聚糖的简易分光光度测定法,是一种快速、简便、准确的分析检测方法。
2 实验部分2.1 仪器与试剂T U-1900双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)。
阿利新蓝8GX(北京莱博生物材料有限公司);硫酸软骨素C,透明质酸(美国Sigm a公司);肝素;牛血清蛋白,生化纯;硫酸、磷酸、硫酸钾、半胱氨酸、氯化钠、乙酸钠等均为分析纯。
实验用水均为去离子水。
染液配制: 1.1mg/m L酸性染料溶液——110mg阿利新蓝8GX溶于15%磷酸-2%硫酸中,定容至100m L;硫酸软骨素钠、透明质酸钠和肝素钠标准溶液:1mg/m L水溶液。
3 结果与讨论3.1 吸收波长的确定空白管加水0.lm L;实验管分别取硫酸软骨素(ChS)0、20、40、60μL、透明质酸(HA)和肝素(Hep)100μL(1mg/m L),加水至0.1m L,再加阿利新蓝染液1.5m L,于400—800nm可见光区扫描如图1,结果显示阿利新蓝染料溶液空白和透明质酸-阿利新蓝复合物的最低吸收波长皆为①联系人,手机:013093031549;E-mail:xlberry@s oh 作者简介:熊双丽(1977—),女,四川省眉山市人,在读博士研究生,从事碳水化合物与生物技术的研究。
收稿日期:2005-05-25490nm ,两者光谱曲线一样,证明透明质酸在此条件下不与阿利新蓝染料溶液作用,而硫酸软骨素-阿利新蓝复合物、肝素-阿利新蓝复合物最低吸收波长改变,移至500nm 处附近,为了消除500nm 处染液空白的吸收,选择490nm 进行硫酸化糖胺聚糖含量的测定。
3.2 硫酸化糖胺聚糖的测定分别取硫酸软骨素、透明质酸和肝素0、10、20、40、60μL,加水至0.1m L,再加阿利新蓝染液1.5m L ,于490nm 比色。
结果如图2,硫酸软骨素和肝素在强酸性条件下与阿利新蓝形成可溶性复合物,其颜色随浓度的升高而加深,在0—80μg 范围内呈线性关系,但是,糖胺聚糖主链由各种糖醛酸和各种氨基半乳糖组成,因具体糖胺聚糖总类不同,糖主链和取代基(硫酸基和羧基等)结构不同,曲线稍微有差异。
透明质酸在强酸性条件下,不与阿利新蓝形成可溶性复合物[2]。
3.3 阿利新蓝复合物稳定性和重复性探讨从图3可以清晰看出5min 内阿利新蓝-糖胺聚糖复合物形成完全,5—140min 范围内稳定,以后吸光度缓慢增加,所以时间对测定的结果基本没有影响,实验结果表明该测定方法重现性好。
3.4 其他物质的影响分别测定硫酸钾、半胱胺酸、氯化钠、牛血清蛋白、葡萄糖、半乳糖、N -乙酰氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸等对硫酸化糖胺聚糖的影响,结果如表1,结果显示酸性条件下,葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、牛血清蛋白、半胱氨酸、N -乙酰氨基葡萄糖、葡萄糖等单糖对测定无影响,EDT A 、乙酸钠等阴离子对测定也无影响,氯离子和硫酸根离子在低浓度时,无影响,含量过高时会轻度干扰可溶性复合物的稳定性,引起吸收值的减小。
表1 阿利新蓝与其他物质相互作用样品名OD 490①氯化钾(50μmol)0.000氯化钾(200μmol)0.000氯化钾(50μmol )0.000氯化钠(200μmol)0.001±0.001乙酸钠(200μmol)0.000硫酸钾(50μmol)0.000硫酸钾(100μmol)0.000EDTA(50μmol)0.000葡萄糖(50μmol )0.000葡萄糖醛酸(50μm ol )0.000半乳糖醛酸(50μm ol)0.000N -乙酰氨基葡萄糖(50μmol)0.000牛血清蛋白(100μg )0.000半胱氨酸(50μmol)0.000 ①490nm处的吸光度图3 阿利新蓝及阿利新蓝-糖胺聚糖 复合物的稳定性观察1295第6期熊双丽等:硫酸化糖胺聚糖的简易分光光度测定法3.5 体液的检测为探讨该方法是否适合于生物体液糖胺聚糖测定,取正常人尿液和正常大鼠血清,加入0,10, 20,30μg纯的硫酸软骨素,计算回收率,如表2。
表2 体液中糖胺聚糖回收率测定硫酸软骨素添加量(μg)50μL尿中糖胺聚糖含量(μg)回收率(%)20μL血清中糖胺聚糖含量(μg)回收率(%)0 5.25±0.33- 3.07±0.21-1013.98±0.4287.8711.28±0.2382.102025.36±0.75100.5520.29±0.5186.113032.37±0.9890.4032.98±0.5999.70 从表中看出,尿液和血清中硫酸软骨素回收率分别为87.87%—100.55%和82.10%—99.7%,血清值差异比尿液大,这可能是因为血清中有大量糖蛋白等物质存在,在强酸性条件下,一些血清蛋白质带上正电荷,与硫酸软骨素相互作用,减少硫酸软骨素与阿利新蓝染料结合的几率,干扰测定,而尿液相应物质少,所以干扰少。
因为一般正常尿液中糖胺聚糖主要以硫酸软骨素形式存在,本文以硫酸软骨素C为标准,测定尿液中硫酸软骨素含量为0.101mg/m L。
3.6 讨论阿利新蓝结构为中心具有铜原子平面四面体憎水体系的四价阳离子性染料,所以呈蓝色,不同于其他单价阳离子染料,允许它在不同的p H环境下能够与糖胺聚糖类阴离子聚合物相互作用。
糖胺聚糖主链由各种糖醛酸和各种氨基半乳糖组成,因具体糖胺聚糖总类不同,糖主链(糖醛酸、氨基半乳糖)和取代基(硫酸基、羧基等)结构不同,典型的硫酸化糖胺聚糖硫酸软骨素含有羧基和硫酸基,硫酸软骨素类硫酸化多糖双糖分子上硫酸酯基团和羧基在水中存在离解平衡。
在强酸性条件下只有硫酸基带负电荷,首先与阿利新蓝发生静电作用形成可溶性复合物,在一定范围内随浓度升高颜色变深而符合郎伯比耳定律,透明质酸分子中没有硫酸基,在此条件下不与阿利新蓝形成可溶性复合物。
所以本文根据强酸性条件下,阿利新蓝只与硫酸化糖胺聚糖相互作用的机理,建立了硫酸化糖胺聚糖的简易分光光度测定法,是一种快速、简便、准确的分析检测方法。
不受非硫酸化糖胺聚糖如透明质酸和其他大分子阴离子如DN A等物质的影响,也不受其他小分子阴离子和单糖的影响。
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