硫酸化糖胺聚糖的简易分光光度测定法_熊双丽

第22卷,第6期光　谱　实　验　室Vo l.22,No.6 2005年11月Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory Nov ember,2005

硫酸化糖胺聚糖的简易分光光度测定法

熊双丽①　金征宇

(江南大学食品科学技术学院　江苏省无锡市江南大学食品学院糖油楼210　214036)

摘 要

利用硫酸化糖胺聚糖和阿利新蓝在酸性环境下形成可溶复合物直接比色测定硫酸化糖胺聚糖。配制

1.1mg/m L酸性染料于15%磷酸-2%硫酸溶液中,取一定量糖胺聚糖与之混合,在490nm处比色测定。该

法简单、快速,重复性好,勿须加热、长时间平衡和高级设备,不受非硫酸化糖胺聚糖如透明质酸和其他大分子阴离子如DN A等物质的影响,也不受其他小分子阴离子和单糖的影响,该法可用于体液糖胺聚糖和商品化透明质酸质量的监测。

关键词　硫酸化糖胺聚糖,阿利新蓝,分光光度法。

中图分类号:O657.32 文献标识码:B 文章编号:1004-8138(2005)06-1294-04

1　前言

糖胺聚糖为具有抗血栓、抗病毒、治疗关节炎等多种生物活性,其产品用途广泛,涉及药品、食品、化妆品等,对其含量测定和成分鉴定一般采用己糖醛酸、氨基己糖监测,或者总糖胺聚糖与染料(如阿利新蓝、二甲基甲基蓝)形成不溶或者可溶复合物进行比色测定。阿利新蓝是中心具有铜原子憎水体系的四价阳离子性染料[1],本文利用强酸性条件下阿利新蓝只与硫酸化糖胺聚糖相互作用的机理,建立了硫酸化糖胺聚糖的简易分光光度测定法,是一种快速、简便、准确的分析检测方法。2　实验部分

2.1　仪器与试剂

T U-1900双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)。

阿利新蓝8GX(北京莱博生物材料有限公司);硫酸软骨素C,透明质酸(美国Sigm a公司);肝素;牛血清蛋白,生化纯;硫酸、磷酸、硫酸钾、半胱氨酸、氯化钠、乙酸钠等均为分析纯。实验用水均为去离子水。

染液配制: 1.1mg/m L酸性染料溶液——110mg阿利新蓝8GX溶于15%磷酸-2%硫酸中,定容至100m L;

硫酸软骨素钠、透明质酸钠和肝素钠标准溶液:1mg/m L水溶液。

3　结果与讨论

3.1　吸收波长的确定

空白管加水0.lm L;实验管分别取硫酸软骨素(ChS)0、20、40、60μL、透明质酸(HA)和肝素(Hep)100μL(1mg/m L),加水至0.1m L,再加阿利新蓝染液1.5m L,于400—800nm可见光区扫描如图1,结果显示阿利新蓝染料溶液空白和透明质酸-阿利新蓝复合物的最低吸收波长皆为

①联系人,手机:013093031549;E-mail:xlberry@s oh

作者简介:熊双丽(1977—),女,四川省眉山市人,在读博士研究生,从事碳水化合物与生物技术的研究。

收稿日期:2005-05-25

490nm ,两者光谱曲线一样,证明透明质酸在此条件下不与阿利新蓝染料溶液作用,而硫酸软骨素-阿利新蓝复合物、肝素-阿利新蓝复合物最低吸收波长改变,移至500nm 处附近,为了消除500nm 处染液空白的吸收,选择490nm 进行硫酸化糖胺聚糖含量的测定。

3.2　硫酸化糖胺聚糖的测定

分别取硫酸软骨素、透明质酸和肝素0、10、20、40、60μL,加水至0.1m L,再加阿利新蓝染液

1.5m L ,于490nm 比色。结果如图2,硫酸软骨素和肝素在强酸性条件下与阿利新蓝形成可溶性复合物,其颜色随浓度的升高而加深,在0—80μg 范围内呈线性关系,但是,糖胺聚糖主链由各种糖醛酸和各种氨基半乳糖组成,因具体糖胺聚糖总类不同,糖主链和取代基(硫酸基和羧基等)结构不同,曲线稍微有差异。透明质酸在强酸性条件下,不与阿利新蓝形成可溶性复合物[2]

。

3.3　阿利新蓝复合物稳定性和重复性探讨

从图3可以清晰看出5min 内阿利新蓝-糖胺聚糖复合物形成完全,5—140min 范围内稳定,以后吸光度缓慢增加,所以时间对测定的结果基本没有影响,实验结果表明该测定方法重现性好。

3.4　其他物质的影响

分别测定硫酸钾、半胱胺酸、氯化钠、牛血清蛋白、葡萄糖、半乳糖、N -乙酰氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸等对硫酸化糖胺聚糖的影响,结果如表1,结果显示酸性条件下,葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、牛血清蛋白、半胱氨酸、N -乙酰氨基葡萄糖、葡萄糖等单糖对测定无影响,EDT A 、乙酸钠等阴离子对测定也无影响,氯离子和硫酸根离子在低浓度时,无影响,含量过高时会轻度干扰可溶性复合物的稳定性,引起吸收值的减小。

表1　阿利新蓝与其他物质相互作用

样品名

OD 490①氯化钾(50μmol)

0.000氯化钾(200μmol)

0.000氯化钾(50μmol )

0.000氯化钠(200μmol)

0.001±0.001乙酸钠(200μmol)

0.000硫酸钾(50μmol)

0.000硫酸钾(100μmol)

0.000EDTA(50μmol)

0.000葡萄糖(50μmol )

0.000葡萄糖醛酸(50μm ol )

0.000半乳糖醛酸(50μm ol)

0.000N -乙酰氨基葡萄糖(50μmol)

0.000牛血清蛋白(100μg )

0.000半胱氨酸(50μmol)

0.000　①490nm

处的吸光度图3　阿利新蓝及阿利新蓝-糖胺聚糖 复合物的稳定性观察

1295第6期熊双丽等:硫酸化糖胺聚糖的简易分光光度测定法

3.5　体液的检测

为探讨该方法是否适合于生物体液糖胺聚糖测定,取正常人尿液和正常大鼠血清,加入0,10, 20,30μg纯的硫酸软骨素,计算回收率,如表2。

表2　体液中糖胺聚糖回收率测定

硫酸软骨素添加量

(μg)50μL尿中糖胺聚糖含量

(μg)

回收率

(%)

20μL血清中糖胺聚糖含量

(μg)

回收率

(%)

0 5.25±0.33- 3.07±0.21-

1013.98±0.4287.8711.28±0.2382.10

2025.36±0.75100.5520.29±0.5186.11

3032.37±0.9890.4032.98±0.5999.70

从表中看出,尿液和血清中硫酸软骨素回收率分别为87.87%—100.55%和82.10%—99.7%,血清值差异比尿液大,这可能是因为血清中有大量糖蛋白等物质存在,在强酸性条件下,一些血清蛋白质带上正电荷,与硫酸软骨素相互作用,减少硫酸软骨素与阿利新蓝染料结合的几率,干扰测定,而尿液相应物质少,所以干扰少。因为一般正常尿液中糖胺聚糖主要以硫酸软骨素形式存在,本文以硫酸软骨素C为标准,测定尿液中硫酸软骨素含量为0.101mg/m L。

3.6　讨论

阿利新蓝结构为中心具有铜原子平面四面体憎水体系的四价阳离子性染料,所以呈蓝色,不同于其他单价阳离子染料,允许它在不同的p H环境下能够与糖胺聚糖类阴离子聚合物相互作用。糖胺聚糖主链由各种糖醛酸和各种氨基半乳糖组成,因具体糖胺聚糖总类不同,糖主链(糖醛酸、氨基半乳糖)和取代基(硫酸基、羧基等)结构不同,典型的硫酸化糖胺聚糖硫酸软骨素含有羧基和硫酸基,硫酸软骨素类硫酸化多糖双糖分子上硫酸酯基团和羧基在水中存在离解平衡。在强酸性条件下只有硫酸基带负电荷,首先与阿利新蓝发生静电作用形成可溶性复合物,在一定范围内随浓度升高颜色变深而符合郎伯比耳定律,透明质酸分子中没有硫酸基,在此条件下不与阿利新蓝形成可溶性复合物。

所以本文根据强酸性条件下,阿利新蓝只与硫酸化糖胺聚糖相互作用的机理,建立了硫酸化糖胺聚糖的简易分光光度测定法,是一种快速、简便、准确的分析检测方法。不受非硫酸化糖胺聚糖如透明质酸和其他大分子阴离子如DN A等物质的影响,也不受其他小分子阴离子和单糖的影响。

参考文献

[1]Sco tt J E.H is toch emis try of Acian BlueΙ.M etach romasia of Acian Blu e,As trablau and Other Cationics and Oth er Pythalo-

cyanin Dyes[J].Histochemie,1970,21(3):277—285.

[2]Bjorns son,S Simulatan eouw Preparation and Quan titation of Protoglycans by Precipitation with Acian Blue[J].Anal Biochem,

1993,210(2):282—291.

[3]Bhavanandan V P,Angela M artin et al.Quangitation of Urinary Glycosaminog lycans with Alcian Blue:Ev aluation of th e In ter-

ference by Tamm-Hofsfaa Glycop ro tein[J].Clinica Ch imica Acta,1996,251(2):207—214.

[4]Gold F W.Th e Quantitive Spectrophotometric Estimation of Total Su lfated Glycosaminoglycan Levels[J].B ioch imica et Bio-

ph ysica Acta,1981,673(4):408—415.

[5]Farndale R W,Sayers C A,Barretl A J.A Direct Spectropho tometric M icroass ay for Sulfated Glycoaminoglycans in Cartilag e

Cultu res[J].Connect Tissue Res,1982,9(4):247—248.

[6]高华,刘坤,于兹东等.间苯三酚分光光度法测定硫酸软骨素的研究[J].中国生化药物杂志,2000,21(5):247—248.

[7]茅力,吕志宏,陈景衡等.间接原子吸收法测定鲨鱼软骨粉中的硫酸软骨素[J].中华预防医学杂志,1998,32(3):183—185.

1296光谱实验室第22卷