甘薯盐胁迫诱导IbDEAD1基因的克隆、生物信息学及表达分析

甘薯盐胁迫诱导IbDEAD1基因的克隆、生物信息学及表达

分析

朱明库;孟小庆;蔡敬;李格;李宗芸

【摘要】DEAD-box解旋酶是植物中最大的解旋酶家族,不仅在几乎所有涉及DNA/RNA代谢的细胞过程中发挥关键作用,而且还广泛参与植物生长发育与胁迫响应过程.目前,甘薯中有关DEAD-box基因的功能研究尚未见报道.本研究以耐盐性品种徐薯22与盐敏感性品种徐薯32为研究材料,通过RNA-seq及生物信息学分析,首次从甘薯中筛选出一个受盐胁迫诱导的DEAD-box基因,命名为IbDEAD1.根据转录组分析的测序结果设计引物,从徐薯22中克隆出该基因的全长序列（GenBank登录号：MF043568）.序列分析表明,IbDEAD1基因包含一个1 701bp的开放阅读框,编码566个氨基酸.序列分析显示IbDEAD1蛋白具有一个DEAD-box蛋白典型的解旋酶中心和多个磷酸化位点,且为DEAD-box RNA解旋酶.系统进化树及qRT-PCR分析均表明,IbDEAD1基因可能在甘薯盐胁迫响应过程中发挥重要作用.这些结果为进一步研究IbDEAD1基因在甘薯盐胁迫响应中的功能奠定了基础.

【期刊名称】《江苏师范大学学报：自然科学版》

【年(卷),期】2017(035)003

【总页数】7页(P23-29)

【关键词】甘薯 DEAD-box解旋酶生物信息学表达分析

【作者】朱明库;孟小庆;蔡敬;李格;李宗芸

【作者单位】江苏师范大学生命科学学院/江苏省药用植物生物技术重点实验室,江苏徐州221116

【正文语种】中文

【中图分类】Q812

作为固着生物,植物经常会遭受各种环境胁迫,如高盐、干旱、低温、紫外线等,这可能会导致脂质、蛋白质和DNA损伤,从而减弱植物基因组的稳定性,严重影响植物的生长与产量[1-2]．然而,有些植物品种已经进化形成特定的分子、细胞和生理机制,能够经受这些环境逆境．例如,解旋酶(helicase)在应对DNA损伤修复中扮演着重要角色．DEAD-box解旋酶是最大的解旋酶家族,广泛存在于从病毒到人类几乎所有已知生物体中,其通过催化双链DNA/RNA的解旋,在复制、重组、转录、翻译和修复等遗传过程中均发挥重要作用[3]．RNA解旋酶主要参与了RNA结构形成的调控活动,包括RNA的复制、转录、剪接、蛋白质翻译、mRNA的输出及其稳定性等过程[4-5]．DNA解旋酶是促使双螺旋DNA解旋的驱动蛋白,参与了DNA 的复制、重组及修复[6].

解旋酶的典型特征是含有一个保守的解旋酶中心,包含了8个或9个特征性的保守基序(motif)．DEAD-box解旋酶由Linder等[7]首次发现,并根据基序Ⅱ中的氨基酸序列DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)而命名,而根据基序Ⅱ氨基酸序列的差异,DEAD-box家族蛋白又可分为DEAD,DEAH和DEXH/D[8-10]．已有研究表明,DEAD-box解旋酶除具有持家基因功能外,还广泛参与植物生长发育过程．因为DEAD-box蛋白参与RNA代谢等过程,因此在胚胎发育中必不可少,比如拟南芥AtRH7基因突变体表现出短根及根分支变少,同时胚胎和子叶发育异常[11]．拟南芥

ABO6(ABA overly sensitive)基因编码一个DEXH-box RNA解旋酶,该基因突变体的线粒体中会积累更多的活性氧(ROS),ROS则进一步介导了生长素和脱落酸之

间的相互作用,而这个互作调控了主根的生长和种子的发芽[12].

除此之外,近年研究表明,DEAD-box解旋酶还广泛参与了植物对生物及非生物胁迫的响应．自从Seki等[13]首次发现冷诱导的解旋酶基因FL2-5A4,第1次表明解旋酶可能在胁迫应答中的新功能,10多年来,研究人员通过对拟南芥、水稻、番茄等植物中解旋酶基因的功能研究表明,DEAD-box解旋酶在多种生物及非生物胁迫响应中均发挥重要作用[14-15]．拟南芥STRS1/2基因编码DEAD-box RNA解旋酶,使突变体strs1和strs2的抗盐性增强,突变体中RD29A,DREB1A及DREB2A等胁迫响应基因的表达均高于野生型[16]．水稻SUV3蛋白同时具有DNA和RNA 解旋酶活性,超表达SUV3基因的水稻耐盐性和抗旱性增强,同时产量不受影响[17]．另外,在CBF-COR冷胁迫应答途径中,DEAD-box解旋酶基因LOS4-1能够抑制、而LOS4-2则促进CBFs及其下游靶基因的表达,说明LOS RNA解旋酶在mRNA的输出、生长发育以及对温度的胁迫响应中都发挥重要作用[18-19]．之前我们研究发现,超表达SlDEAD31基因的番茄植株对盐和干旱胁迫的耐受性增强,胁迫下转基因植株存活率更高,而MDA含量降低[15]．以上发现为将来利用DEAD-box解旋酶的“DNA/RNA解旋”功能来改良植物对各种生物及非生物胁迫的耐受性,进而提高作物产量提供了可能．然而,在真核生物中,许多信号转导途径被环境胁迫所激活,很难确定解旋酶在复杂的信号转导网络中的具体位置．因此,由解旋酶介导的胁迫应答机制仍待进一步研究．

甘薯(Ipomoea batatas (L.) Lam.)不仅可以作为粮食、饲料和工业原料,还是重要的新兴能源和高效保健作物．我国甘薯的栽培面积和产量均居世界首位,总产量仅次于水稻、小麦和玉米．长期以来,甘薯在我国一直充当着抗灾救荒及保命粮的角色,是保证粮食安全的底线作物[20]．与其他主要农作物相比,大部分甘薯品种具有耐盐碱、抗旱、耐贫瘠等特性,不存在“与人争粮、与粮争地”的问题,因此，可作为盐碱地粮食和能源作物加以开发利用．鉴于此,了解甘薯抵御盐胁迫的应答机制

将会为培育高耐盐甘薯新品种(品系)奠定基础．目前,有关甘薯中DEAD-box基因的相关研究尚无报道,GenBank中也未见有甘薯DEAD-box基因的注册信息．为此,本研究利用耐盐性品种徐薯22与盐敏感性品种徐薯32在盐胁迫处理下的RNA-seq数据,首次从甘薯中筛选出一个盐胁迫诱导的DEAD-box基因,命名为IbDEAD1．根据转录组分析的测序结果设计引物,从徐薯22中克隆出该基因的全长序列,并在NCBI中完成注册(GenBank登录号:MF043568)．本研究通过对IbDEAD1基因进行系统的生物信息学分析,同时利用qRT-PCR的方法检测其对盐胁迫处理的响应特性,旨在为进一步研究甘薯IbDEAD1基因在盐胁迫响应中的功能和作用机制奠定基础．

1.1 材料及主要试剂

本研究利用实验室已完成的耐盐性品种徐薯22与盐敏感性品种徐薯32在盐胁迫处理下的RNA-seq数据筛选出IbDEAD1基因．盐胁迫响应分析实验中,选取大小一致、发育健康的徐薯22茎蔓在1/4浓度的霍格兰培养液中水培生根,培养条件为16 h光照(28 ℃)/8 h黑暗(26 ℃)．培养10 d后选取根系健康、长势接近的植株进行盐胁迫处理．通过在霍格兰溶液中加入200 mmol/L的NaCl,分别于处理后1，3，6，12，24，48，72 h收取根组织样品,对照组用不含NaCl的霍格兰溶液培养．所收取的鲜样迅速用液氮冷冻,放置于-80 ℃冰箱保存备用．

基因克隆所需的Trizol试剂、PrimeScript反转录酶、PrimeSTAR® HS DNA聚合酶、pMD19-T-vector,qRT-PCR分析所需的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ均购自大连宝生物(TakaRa)公司．DNA marker、氨苄青霉素(Amp)为Sigma公司产品．大肠杆菌菌种DH5α,由江苏省药用植物生物技术重点实验室保存．

1.2 方法

1.2.1 甘薯盐胁迫处理RNA-seq数据中DEAD-box基因的筛选通过用关键词“DEAD”和“helicase”在实验室已完成的耐盐性品种徐薯22与盐敏感性品种