基因定点诱变技术与DNA与蛋白质互作及定点突变介绍
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一）酵母双 杂交系统 （yeast two-hybrid system)
1. 原理：
? 真核生物的 转录因子大多是由两个 结构上分开、 功能上独立的 结构域组成的，即 DNA结合域（BD） 和转录 激活域（ AD）。
? 单独地BD能与特定基因地启 动区结合，但不能激 活基因的 转录 ，而由不同 转录 因子的 BD和AD所形 成的杂合蛋白却能行使激活 转录的功能。
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4）一旦酵母细胞中表达的“诱饵”蛋白与“猎物” 载体中表达的某个蛋白质发生相互作用， 不同转录调控因子的AD和BD结构域就会 被牵引靠拢，激活报告基因表达。
5）分离有报告基因活性的酵母细胞，得到所 需要的“猎物”载体，获得与已知蛋白相互 作用的新基因。
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AD:Activation domain DNA-BD :Binding domain
五、基因定点诱变
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定位诱变技术就是指按照设计要求， 在体外将基因特定区域的碱基进行突变， 这样就有可能在缺乏表型选择时进行遗传 分析，以便于研究基因结构与功能的关系 和基因表达调控的过程。其诱变技术有两 种类型，即区域随机诱变和点突变。
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点突变的技术有很多种，常 见的有寡核苷 酸介导的点突 变技术和PCR 定点突 变技术。 ? ㈠寡核苷酸介 导的定点突变技术
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2.实验过程
1）首先运用基因重 组技术把编码已知蛋白的DNA序 列连接到带有酵母 转录因子 BD编码区的表达 载体 上。
2）导入酵母细胞中使之表达 带有BD的杂蛋白，与报 告基因上游的启 动调控区相结合，准备作为“诱饵” 捕获与已知蛋白相互作用的基因 产物。
3）此时，若将AD的DNA与待筛选的cDNA文库中不同 插入片段相 连接，获得“猎物”载体，转化含有“诱 饵”的酵母细胞。
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酵母双杂交的基本原理示意图 25
二） 酵母单杂交系统
? 酵母 单杂交系 统是上世 纪90年代中 发展起来的研 究DNA-蛋白质之间相互作用的新技 术，可识别稳 定结合于DNA 上的蛋白 质，在酵母 细胞内研究真核 生物中 DNA-蛋白 质之间的相互作用，并通 过筛选 DNA文库直接 获得靶序列相互作用蛋白的 编码 基 因。
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* 顺式作用元件
真核生物DNA序列（非编码序列）和被 转录的结构基因距离较近，和转录调控有关。
A 启动子（启动子上游近侧序列） B 增强子 C 沉默子
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启动子（promtor ）在转录起始点上游约100－200bp 以内， 每个元件长度约为7－20bp ，决定RNA聚合酶Ⅱ转录起始 点和转录频率的关键元件。
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? 原理： ? 将已知 顺式作用元件构建到最基本启 动子（Pmin）
的上游，把 报告基因 连接到Pmin下游。将 编码待测 转录 因子 cDNA 与已知酵母 转录 激活 结构域（ AD） 融合表达 载体导入酵母 细胞， 该基因 产物如果能 够与顺式作用元件相 结合，就能激活 Pmin启动子， 使报告基因得到表达。
增强子(enhancer) 能使和它连锁的基因转录频率明显增加的 DNA序列，顺式作用元件（DNA序列）。
沉默子(silencer) 负性调节元件，与相应的反式因子结合后， 可以使正调控系统失去作用，阻遏基因转录。
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酵母单杂交的基本 原理示意图
从拟南芥 cDNA 文库中 筛选与顺式元 件DRE结 合的 转录因子示意图。
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? EMSA ? 还被
用于 研究 与蛋 白质 相结 合的 DNA ? 序列 的特
异型。
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四）DNaseI足迹试验 （DNase I foot printing）
? 主要步骤： ① 用32P标记DNA双链末端，并用 RE切去一端； ② 加入细胞特定周期蛋白 质提取物，温育； ③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲 酯-六氢吡啶，使 DNA链发生断裂。 这一反应中，DNaseI或硫酸二甲 酯的用量非常关 键， 要保证一条链只发生一次断裂！ ④沉淀 DNA（包括与 DNA 相结合的蛋白 质）； ⑤进行DNA凝胶分析。
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? 如果某个蛋白质已经与DNA的特定区段相 结合，那么，它就会保证该区段DNA免受消 化或降解作用。在电泳凝胶的放射自显影图 片上，相应于蛋白质结合的部位不产生放射 性标记的条带。
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2.寡核苷酸引物诱变技术
? 用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片 段作为引物，启动单链DNA的复制，新产 生出来的心链就具有已发生突变的碱基序 列。
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㈡ PCR点突变技术
– 1.重组PCR定点诱变法 ? 该方法是利用四种引物，三轮PCR反应来
进行的。操作较为繁琐。
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片产 段生 末一 端种 的突 突变 变位 体点 DN远离A
30ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
三）凝胶阻滞 实验 （electrophoretic mobility shift assay, EMSA）
? 是体外分析DNA与蛋白质相互作用的一种特 殊的凝胶电泳技术
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? 原理：
? 在凝胶电泳中，由于 电场的作用，裸露的 DNA朝正 电极移动的距离与其分子量的 对数成反比。如果 此时DNA分子与某种蛋白 质相结合，那么，由于分 子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞， 在特定 电压 和时间 内朝正 电极移 动的距离也就相 应缩短了。所以，当某个 DNA片段与细胞提取物混 合之后，若它在凝胶 电泳中的移动距离变小了，就 说明它可能已与提取物中的某种特殊蛋白 质分子 相结合了。
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– 2.引物PCR定点诱变法 ? 该方法是利用三种引物，两轮PCR反应来进
行的。
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六、DNA与蛋白质互作分析
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? 外源基因的功能分析涉及蛋白质与DNA的互 作分析。
? 主要方法有：
? 酵母杂交系统 ? 凝胶阻滞实验 ? DNaseI足迹实验 ? 甲基化干扰试验 ? 体内足迹实验
– 1.盒式诱变 – 2.寡核苷酸引物诱变技术
? ㈡ PCR点突变技术
– 1.重组PCR定点诱变法 – 2.引物PCR定点诱变法
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㈠寡核苷酸介 导的定点突 变技术
? 1.盒式诱变（casette mutagenesis） ? 利用一段人工合成的具有突变序列的
寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应 序列。
一）酵母双 杂交系统 （yeast two-hybrid system)
1. 原理：
? 真核生物的 转录因子大多是由两个 结构上分开、 功能上独立的 结构域组成的，即 DNA结合域（BD） 和转录 激活域（ AD）。
? 单独地BD能与特定基因地启 动区结合，但不能激 活基因的 转录 ，而由不同 转录 因子的 BD和AD所形 成的杂合蛋白却能行使激活 转录的功能。
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4）一旦酵母细胞中表达的“诱饵”蛋白与“猎物” 载体中表达的某个蛋白质发生相互作用， 不同转录调控因子的AD和BD结构域就会 被牵引靠拢，激活报告基因表达。
5）分离有报告基因活性的酵母细胞，得到所 需要的“猎物”载体，获得与已知蛋白相互 作用的新基因。
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AD:Activation domain DNA-BD :Binding domain
五、基因定点诱变
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定位诱变技术就是指按照设计要求， 在体外将基因特定区域的碱基进行突变， 这样就有可能在缺乏表型选择时进行遗传 分析，以便于研究基因结构与功能的关系 和基因表达调控的过程。其诱变技术有两 种类型，即区域随机诱变和点突变。
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点突变的技术有很多种，常 见的有寡核苷 酸介导的点突 变技术和PCR 定点突 变技术。 ? ㈠寡核苷酸介 导的定点突变技术
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2.实验过程
1）首先运用基因重 组技术把编码已知蛋白的DNA序 列连接到带有酵母 转录因子 BD编码区的表达 载体 上。
2）导入酵母细胞中使之表达 带有BD的杂蛋白，与报 告基因上游的启 动调控区相结合，准备作为“诱饵” 捕获与已知蛋白相互作用的基因 产物。
3）此时，若将AD的DNA与待筛选的cDNA文库中不同 插入片段相 连接，获得“猎物”载体，转化含有“诱 饵”的酵母细胞。
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酵母双杂交的基本原理示意图 25
二） 酵母单杂交系统
? 酵母 单杂交系 统是上世 纪90年代中 发展起来的研 究DNA-蛋白质之间相互作用的新技 术，可识别稳 定结合于DNA 上的蛋白 质，在酵母 细胞内研究真核 生物中 DNA-蛋白 质之间的相互作用，并通 过筛选 DNA文库直接 获得靶序列相互作用蛋白的 编码 基 因。
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* 顺式作用元件
真核生物DNA序列（非编码序列）和被 转录的结构基因距离较近，和转录调控有关。
A 启动子（启动子上游近侧序列） B 增强子 C 沉默子
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启动子（promtor ）在转录起始点上游约100－200bp 以内， 每个元件长度约为7－20bp ，决定RNA聚合酶Ⅱ转录起始 点和转录频率的关键元件。
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? 原理： ? 将已知 顺式作用元件构建到最基本启 动子（Pmin）
的上游，把 报告基因 连接到Pmin下游。将 编码待测 转录 因子 cDNA 与已知酵母 转录 激活 结构域（ AD） 融合表达 载体导入酵母 细胞， 该基因 产物如果能 够与顺式作用元件相 结合，就能激活 Pmin启动子， 使报告基因得到表达。
增强子(enhancer) 能使和它连锁的基因转录频率明显增加的 DNA序列，顺式作用元件（DNA序列）。
沉默子(silencer) 负性调节元件，与相应的反式因子结合后， 可以使正调控系统失去作用，阻遏基因转录。
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酵母单杂交的基本 原理示意图
从拟南芥 cDNA 文库中 筛选与顺式元 件DRE结 合的 转录因子示意图。
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? EMSA ? 还被
用于 研究 与蛋 白质 相结 合的 DNA ? 序列 的特
异型。
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四）DNaseI足迹试验 （DNase I foot printing）
? 主要步骤： ① 用32P标记DNA双链末端，并用 RE切去一端； ② 加入细胞特定周期蛋白 质提取物，温育； ③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲 酯-六氢吡啶，使 DNA链发生断裂。 这一反应中，DNaseI或硫酸二甲 酯的用量非常关 键， 要保证一条链只发生一次断裂！ ④沉淀 DNA（包括与 DNA 相结合的蛋白 质）； ⑤进行DNA凝胶分析。
35
? 如果某个蛋白质已经与DNA的特定区段相 结合，那么，它就会保证该区段DNA免受消 化或降解作用。在电泳凝胶的放射自显影图 片上，相应于蛋白质结合的部位不产生放射 性标记的条带。
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2.寡核苷酸引物诱变技术
? 用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片 段作为引物，启动单链DNA的复制，新产 生出来的心链就具有已发生突变的碱基序 列。
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㈡ PCR点突变技术
– 1.重组PCR定点诱变法 ? 该方法是利用四种引物，三轮PCR反应来
进行的。操作较为繁琐。
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片产 段生 末一 端种 的突 突变 变位 体点 DN远离A
30ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
三）凝胶阻滞 实验 （electrophoretic mobility shift assay, EMSA）
? 是体外分析DNA与蛋白质相互作用的一种特 殊的凝胶电泳技术
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? 原理：
? 在凝胶电泳中，由于 电场的作用，裸露的 DNA朝正 电极移动的距离与其分子量的 对数成反比。如果 此时DNA分子与某种蛋白 质相结合，那么，由于分 子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞， 在特定 电压 和时间 内朝正 电极移 动的距离也就相 应缩短了。所以，当某个 DNA片段与细胞提取物混 合之后，若它在凝胶 电泳中的移动距离变小了，就 说明它可能已与提取物中的某种特殊蛋白 质分子 相结合了。
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– 2.引物PCR定点诱变法 ? 该方法是利用三种引物，两轮PCR反应来进
行的。
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六、DNA与蛋白质互作分析
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? 外源基因的功能分析涉及蛋白质与DNA的互 作分析。
? 主要方法有：
? 酵母杂交系统 ? 凝胶阻滞实验 ? DNaseI足迹实验 ? 甲基化干扰试验 ? 体内足迹实验
– 1.盒式诱变 – 2.寡核苷酸引物诱变技术
? ㈡ PCR点突变技术
– 1.重组PCR定点诱变法 – 2.引物PCR定点诱变法
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㈠寡核苷酸介 导的定点突 变技术
? 1.盒式诱变（casette mutagenesis） ? 利用一段人工合成的具有突变序列的
寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应 序列。