生化实验_转氨酶(GPT)活性的测定报告

实验二（2）转氨酶（GPT）活性的测定

一．研究背景及目的

转氨酶是生物体内重要的一类酶。转氨酶催化α-氨基酸的氨基与α-酮酸的酮基之间的相互转化而生成一种新的氨基酸与一种的新的酮酸，这种作用被称为转氨基作用[1]。转氨酶种类很多，体内除了赖氨酸、苏氨酸外，其余α-氨基酸都可参加转氨基作用并各有其特异的转氨酶。其中以谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）最为重要。GPT与GOT活性的测定在临床上有着重要应用，可作为一些疾病诊断的指标。GPT催化的是谷氨酸与丙酮酸之间的转氨作用，GOT催化的是谷氨酸与草酰乙酸之间的转氨作用，草酰乙酸在柠檬酸苯胺溶液中可以转变为丙酮酸与二氧化碳。由于都有丙酮酸的生成，所以可以通过实验测定一定时间内丙酮酸的生成量而计算这两种转氨酶的活性。本实验以动物的新鲜肝脏和血清为材料，分别测定其中的GTP的活性，以此来研究该转氨酶活性的测定方法。

二．原理

由于动物肝脏和血清中的转氨酶活性较高，易于测得，且动物或人的转氨酶活性的测定应用广泛、技术成熟，因此本试验选取家兔的新鲜肝脏和血清为实验材料，对其中的一种重要转氨酶——GTP的活性进行测定。转氨酶活性测定的历史沿革建立了金氏法、穆氏法及赖氏法等较成熟的基本方法，本实验采用的是金氏法。该方法对转氨酶活力的定义是：血清在37℃，pH7.4条件下，与底物作用60min后，每生成1μM丙酮酸为一个转氨酶活性单位。丙酮酸含量的测定运用的是比色法。丙酮酸可与2,4-二硝基苯肼反应，生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色，所以通过测定溶液在520nm下的光吸收值并与标准溶液比色便可计算出丙酮酸的含量，丙酮酸的含量对应于一定的转氨酶活力单位。

三．材料、试剂与仪器

材料：

新鲜家兔肝脏和血清

试剂[1]：

①磷酸盐缓冲液（pH7.4）

甲液：1/15 mol/L磷酸氢二钠溶液

乙液：1/15 mol/L磷酸氢二钾溶液

取甲液825ml，乙液175ml，混合，测得pH为7.4即可。

② GTP基质液

称取α-酮戊二酸29.2mg及DL-丙氨酸1.78g，溶于pH7.4的磷酸盐缓冲液20ml 中，再加缓冲液70ml，并移入100ml容量瓶中，加1mol/L的氢氧化钠溶液0.5ml，校正pH至7.4，再以pH7.4的磷酸盐缓冲液定容。贮存于冰箱中备用，可保存一周时间。

③ 2,4-硝基苯肼溶液

称取2,4二硝基苯肼20mg，先溶于10ml浓盐酸中，再以蒸馏水稀释至100ml，棕色试剂瓶内保存。

④丙酮酸标准液

精确称取丙酮酸钠22mg。溶解后转入100ml容量瓶中，用pH7.4的磷酸盐缓冲液定容即可。

⑤柠檬酸苯胺溶液

取柠檬酸50g溶于50ml蒸馏水中，再加苯胺充分混合即可，低温出现结晶时，可置于37℃水浴中溶解后应用。

⑥ 0.4M氢氧化钠溶液

仪器：

DK-S24型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司，编号L304056）

TPL-4OB低温台式离心机（上海安亭科学仪器厂，编号20070529）

722光栅分光光度计（上海紧密科学仪器有限公司）

大龙系列加样器及吸头（20-200μl，100-1000μl，1000-5000μ）

JP-100架盘药物天平（美国双杰兄弟有限公司，编号3878）

配平天平（北京医用天平厂）

刻度试管，离心管，小烧杯，匀浆器，洗瓶，冰浴

四．操作步骤

1．取健康家兔，处死。心脏采血，分装至离心管（生理盐水浸润），4000转低温离心15min，取上清液冰浴待用。取肝脏，生理盐水冲洗沥干，取1g匀浆，用磷酸盐缓冲液定容至10ml，4000转低温离心15min，取上清液，冰浴，记为肝脏研磨液1。取2ml肝脏研磨液1，用磷酸盐缓冲液定容至4ml，冰浴，记为肝脏研磨液2。

2．取6支试管，编号，按下表操作[1]：

再取18支试管，分为三组，每组6支，分别用于测定血清、肝脏研磨液1、肝脏研磨液2的GPT

活性，6支试管中3支作为测定管，另外3支作为对照管。

五． 数据整理

2. GPT 活性测定

2.1血清中GPT 活性的测定

六．结果计算与分析

根据标准曲线方程

y=0.0017x+0.0464（y对应于OD值，x对应于酶活单位）

计算各三种样品光吸收值（以测定管均值与对照管均值之差计算）对应的酶

以上结果显示：血清中GPT活性较高，而肝脏中的GPT活性特别的高，尽管稀释了一定的倍数，仍然超出了标准曲线设定的范围。我们知道，研磨液2是由研磨液1稀释2倍得到的，但是其活性完全与稀释倍数不成比例。我认为这是由两个方面的原因造成的：①肝脏中GPT活性过高，催化反应中GPT过量，其活性没有得到完全的体现，所以稀释后活性没有按稀释倍数降低；②肝脏研磨液稀释倍数不够，使得产物浓度超出了比色法的线性范围，最终导致通过标准曲线方程计算得到的酶活单位存在较大误差。

七．结论与展望

通过以上的计算与分析，本实验得到的结论是：通过比色法测定一定时间内

转氨酶催化反应的产物的含量来表征转氨酶的活性的方法是可行的，关键的问题

在于如何确定底物及酶的浓度从而使得酶的活性得到最大程度的发挥且底物浓

度适于比色法的测定。本实验中由于肝脏中转氨酶活性过高，稀释倍数不够，导

致产物浓度过大，超出了比色法的最适测定范围，得到的数据误差较大。所以希

望以后的实验能够调整肝脏研磨液的稀释倍数，更加准确地测定转氨酶的活性。

八．实验小结

本次实验比较成功，实验过程中没有出现明显失误。由于实验室配备了加样器取代了原来的移液管，使得加样速度大大提高，最终我们小组在较短时间内顺利完成了实验。此外从实验数据中也发现：各平行实验数据相差较小，可见平行性良好，实验操作带来的偶然误差较小。

九．参考文献

[1]生物化学实验指导 19-22 中国农业大学生物化学实验室中国农业大学自编教材

附：两种酶活性测定实验的主要设计细节异同点分析比较：

淀粉酶与转氨酶活性的测定在实验的整体思路上是相同的，但是实验设计上存在着许多不同之处，各自具有其特点，具体表现为以下几点：

首先，制备酶液的方法不同：淀粉酶活性测定中采用的是萌发的小麦种子的研磨稀释液，转氨酶活性的测定中采用的是家兔的血清及肝脏研磨稀释液。作如此选择是出于实验的可操作性及现实意义的考虑。萌发的种子中的淀粉酶活性和动物血清及肝脏中的转氨酶活性都比较高，所以选取它们易于较准确地测得酶活性；此外，萌发的种子中淀粉酶活性的测定对于农业生产具有重要的指导意义，而动物或人的血清及肝脏中转氨酶活性的测定在临床上具有重要应用，所以以它们为实验材料的研究在技术上比较成熟而且具有现实意义。

第二，淀粉酶活性测定实验是以两种淀粉酶——α淀粉酶和β淀粉酶为研究对象的，而转氨酶活性测定实验是以一种转氨酶GPT为研究对象的。也就是说，淀粉酶活性测定实验以一种生物材料来研究两种淀粉酶的活性而转氨酶活性测定实验以两种生物材料来研究一种转氨酶的活性。具体的实现测定的策略分别是：淀粉酶活性测定实验分别测定α淀粉酶（抑制了β淀粉酶活性）活性及两种淀粉酶的总活性；转氨酶活性测定实验分别测定了血清中的GPT活性及两种不同稀释倍数的肝脏研磨液的GPT活性。如此设计主要出于两方面的考虑：实验的可操作性及典型性。因为对于淀粉酶的测定，通过抑制β淀粉酶活性来测定α淀粉酶活性是易于实现的；而对于转氨酶活性的测定，GPT是一种体内最重要的转氨酶之一，所以其活性测定具有典型性，通过测定GPT在不同组织中的活性能够实现转氨酶活性研究的目的。

第三，酶活性的测定是通过酶促反应的产物测定实现的，淀粉酶活性测定实验中测定的产物是麦芽糖，这是因为两种淀粉酶催化反应的产物几乎都是麦芽糖，所以麦芽糖的产量能够表征淀粉酶的活性，而且麦芽糖的含量易于通过比色法测得；同样道理，转氨酶活性测定实验中测定的是催化产物中的丙酮酸的含量。

第四，酶活力单位的定义不同：淀粉酶活力单位的定义是：每分钟每克鲜重麦种所催化生成的麦芽糖毫克数；转氨酶活力单位的定义是：血清（或肝脏研磨液）在37℃，pH7.4条件下，与底物作用60min生成1μM丙酮酸为一个转氨酶