磷酸酶的测定方法

磷酸酶测定(磷酸苯二钠比色法)：

土壤磷酸酶是植物根系与微生物的分泌产物。磷酸酶与土壤P素转化密切相关，是土壤P素肥力的指标。

1、试剂配制

（1）甲苯

（2）磷酸苯二钠：称取6.75g磷酸苯二钠（C6H5PO4Na2.2H2O）溶于水，并稀释至1L（1毫升含25mg酚）

（3）缓冲液

（4）pＨ9.0硼酸盐缓冲液

缓冲溶液配制：

(1)酸性磷酸酶:醋酸盐缓冲液(pH=5.0)

A：0.2M醋酸钠溶液：16.4g 无水醋酸钠（C2H3O2Na）溶于1000mL蒸馏水中，或是27.2g三水醋酸钠（C2H3O2Na.3H2O）溶于1000mL水中。

B：0.2M醋酸溶液：11.55mL醋酸定容于1000mL

醋酸盐缓冲液(pH=5.0)：7mLA＋3mLB混合即得

（2）碱性磷酸酶：硼酸盐缓冲液（pH10.0）

硼砂－氢氧化钠缓冲液（pH10.0）：

A：硼砂液：19.072g硼砂溶于1000mL蒸馏水中

B：氢氧化钠溶液：4g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中

50mLA＋43mLB加水稀释至200mL，混匀即得

（3）硼酸盐缓冲液（pH9.0）

A：0.05M硼砂溶液：19.07g硼砂（Na2B4O710H2O）溶于1000mL蒸馏水中

B：0.2M硼酸溶液：12.37g硼酸（H3BO3）溶于1000mL蒸馏水中

硼酸盐缓冲液（pH9.0）：80mLA+20mLB混匀即得

（4）中性磷酸酶：柠檬酸盐缓冲液（pH7.0）

A：0.1M柠檬酸溶液：21.01g柠檬酸. H2O（或是19.21gC6H8O7）溶于1000mL 蒸馏水中

B：0.2M磷酸氢二钠：35.61g磷酸氢二钠.2 H2O（53.63g磷酸氢二钠.7 H2O或是71.7g磷酸氢二钠.12 H2O）溶于1000mL蒸馏水中

柠檬酸盐缓冲液（pH7.0）：3.63mLA+16.37mLB混匀即得

（5）2.5％铁氰化钾

（6）0.5％的4－氨基安替吡啉溶液

（7）酚原液：2克酚溶液蒸馏水定容致1升（2mg/mL），溶液在暗色中稳定。（8）酚工作液：取2.5mL原液稀释至100mL（0.05mg酚/mL）

2、操作步骤：

称取5ｇ土于50mL容量瓶中，加1mL甲苯，加塞塞紧轻摇15min。再加入5mL磷酸苯二钠（6.75g溶于1L水）和5mL相应的缓冲液(酸性磷酸酶用pＨ5.0大醋酸缓冲液，中性磷酸酶用pH7.0的柠檬酸缓冲液，碱性磷酸酶用pH10的硼酸缓冲液)，同时对每一土样都设置用5mL水代替基质的对照。仔细摇匀后放入恒温箱,在37℃下培养24ｈ。

用热至38℃的蒸馏水将容量瓶中混合物稀释至刻度(甲苯浮在刻度以上)，再用致密滤纸过滤。取1mL滤液于100mL容量瓶中，加5mL pＨ9.0硼酸盐缓冲液，再加入3mL 2.5％的铁氰化钾和3mL 0.5％的4－氨基安替吡啉溶液，摇动，仔细混匀，这时溶液呈粉红色，然后加水定容。待颜色稳定时（20-30min），在波长570nm处测定各样品的消光值。土壤的磷酸酶活性根据标准曲线求出酚的含量。

磷酸酶活性以每克土壤的酚毫克数表示（若用P的毫克数表示，结果需乘0.32；若用P2O5的毫克数表示，需乘2.29）。

标准曲线：分别向100mL容量瓶中注入0，1，3，5，7，9，11mL工作液并显色定容（分别相当于0.05，0.15，0.25，0.35，0.45，0.55mg酚），5mL pＨ9.0硼酸盐缓冲液，再加入3mL 2.5％的铁氰化钾和3mL 0.5％的4－氨基安替吡啉溶液，摇动，仔细混匀，这时溶液呈粉红色，然后加水定容。待颜色稳定后，比色绘制标准曲线。